本發(fā)明屬于海洋微生物檢測
技術領域：
，具體地，涉及一種同時檢測四種海洋弧菌的試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
：近年來，由于海洋漁業(yè)資源的日漸衰退，漁業(yè)捕撈量已大幅度下降，單靠海洋捕撈已遠遠不能滿足我國人民對海洋水產品的需求，因此，海水養(yǎng)殖得到普遍重視和大力發(fā)展。擴大魚類增養(yǎng)殖，開發(fā)魚類蛋白資源是當今世界水產增養(yǎng)殖中最活躍的科研開發(fā)工作，水產養(yǎng)殖已成為世界上增加魚類來源最迅速的方式，也是水產品生產發(fā)展的必然趨勢?；【?vibriosis)是由弧菌屬細菌(vibriospp.)引起的一類細菌性疾病，該病在全球范圍內廣泛發(fā)生，其暴發(fā)性流行不僅給海水養(yǎng)殖魚類、貝類及甲殼類等經濟動物的養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經濟損失，還導致野生的海水魚類、貝類及甲殼類大量死亡，因此，對該類疾病的研究一直備受國內外研究工作者的關注，是海水養(yǎng)殖動物病害的主要研究領域之一。國外對海水魚類弧菌病的研究始于20世紀初，自20世紀60年代后相繼對多種弧菌屬的致病菌有較豐富的研究和報道。在我國，海水養(yǎng)殖業(yè)經歷了藻、蝦、貝的3次養(yǎng)殖浪潮之后，又相繼迎來了90年代形成的海水魚類養(yǎng)殖的第4次養(yǎng)殖高潮。然而，由于養(yǎng)殖面積過速擴展、養(yǎng)殖密度過高和管理不當，養(yǎng)殖魚類疾病繁生，造成巨大的經濟損失。由弧菌引起的死亡時有報道，弧菌病被公認為是魚類養(yǎng)殖中最為嚴重的病害之一，是該行業(yè)發(fā)展的重要限制性因素。做好海水中弧菌的檢測是預防海洋水產疾病的重要前提，而陽性對照在海水弧菌檢測工作中必不可少，但是由于作為陽性對照的樣本不易獲得和不穩(wěn)定性，樣本直接作為陽性對照可操作性差，不利于快速高效的對弧菌進行檢測。另外，如何進一步提高普通熒光定量pcr的靈敏度也是當前迫切需要解決的問題。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術中海洋弧菌檢測缺少陽性對照物以及熒光定量pcr靈敏度不高的缺陷和不足，提供一種含有陽性對照物的熒光定量pcr試劑盒；所述試劑盒的靈敏度提高了100倍，基本對模板中100copies/μl的目標序列可以有效檢出，在海洋弧菌檢測中具有較大的應用前景。本發(fā)明的目的是提供一種同時檢測四種海洋弧菌的試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供利用上述試劑盒檢測海洋弧菌的方法。本發(fā)明的再一目的是提供上述試劑盒及方法的應用。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案給予實現(xiàn)的：一種同時檢測四種海洋弧菌的試劑盒，包括熒光定量pcr所需試劑，還包括陽性對照物，4對熒光pcr引物和4條分子信號探針和pcr引物；所述陽性對照物為含有霍亂弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和創(chuàng)傷弧菌16srdna序列的質粒；所述4對熒光pcr引物和分子信號探針依次如seqidno.3～14所示；所述pcr引物如seqidno.1～2所示。本發(fā)明通過擴增霍亂弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和創(chuàng)傷弧菌的16srdna靶基因，連接到t-vector載體，一方面作為試劑盒的陽性對照物，另一方面由于重組質粒濃度穩(wěn)定和非常易于不斷擴增，在試劑盒的研發(fā)過程中當作標準樣本，測試檢測試劑盒的特異性和敏感性，通過將熒光定量pcr的模板預先進行普通pcr，可大大提高熒光定量pcr的靈敏度。優(yōu)選地，所述質粒為陽性質粒pmd-vc、pmd-vp、pmd-vv和pmd-va。一種同時檢測四種海洋弧菌的方法，先提取待測弧菌樣品dna，再將待測樣品和權利要求1中的陽性對照物用權利要求1中所述pcr引物seqidno.1～2進行預擴增，再將預擴增的pcr產物用引物seqidno.3～14進行熒光定量pcr檢測，通過陽性對照物比較，計算出待測樣品中四種弧菌的含量。優(yōu)選地，所述預擴增的pcr反應體系：2xextaqmixture12.5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，模板3μl，ddh2o7.5μl，共25μl；所述pcr反應程序為：95℃，4min；94℃45s，42℃45s，72℃45s，2個循環(huán)；94℃45s，43℃45s，72℃45s，2個循環(huán)；94℃45s，44℃45s，72℃45s，2個循環(huán)；94℃45s，45℃45s，72℃45s，2個循環(huán)；94℃45s，46℃45s，72℃45s，2個循環(huán)；94℃45s，47℃45s，72℃45s，2個循環(huán)；94℃45s，48℃45s，72℃45s，2個循環(huán)；94℃45s，49℃45s，72℃45s，2個循環(huán)；94℃45s，45℃45s，72℃45s，15個循環(huán)；72℃，5min；4℃，pause。優(yōu)選地，所述熒光定量pcr的反應體系為：上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，探針0.08μl，mix10μl，rox0.5μl，預擴增產物2μl，雙蒸水補足至20μl；所述熒光定量pcr反應程序為：50℃2min，95℃10min，95℃10min，60℃1min，40個循環(huán)。本發(fā)明有現(xiàn)有技術相比，具有以下技術效果：(1)本發(fā)明的海洋弧菌陽性對照物可作為試劑盒的陽性對照物或者試劑盒的研發(fā)過程中標準樣本，測試檢測試劑盒的特異性和敏感性。(2)本發(fā)明所述試劑盒及檢測方法可以同時檢測四種海洋弧菌，且靈敏度提高了100倍，基本對模板中100copies/μl的目標序列可以有效檢出，在海洋弧菌檢測中具有較大的應用前景。附圖說明圖1為四種弧菌16srdna基因同源區(qū)序列。圖2為vc梯度稀釋電泳圖；(m，dl2000marker；1，弧菌質粒原液；2，10倍稀釋液；3，102倍稀釋液；4，103倍稀釋液；5，104倍稀釋液；6，105倍稀釋液；7，106倍稀釋液)。圖3為vp梯度稀釋電泳圖；(m，dl2000marker；1，弧菌質粒原液；2，10倍稀釋液；3，102倍稀釋液；4，103倍稀釋液；5，104倍稀釋液；6，105倍稀釋液；7，106倍稀釋液)。圖4為va梯度稀釋電泳圖；(m，dl2000marker；1，弧菌質粒原液；2，10倍稀釋液；3，102倍稀釋液；4，103倍稀釋液；5，104倍稀釋液；6，105倍稀釋液；7，106倍稀釋液)。圖5為vv梯度稀釋電泳圖；(m，dl2000marker；1，弧菌質粒原液；2，10倍稀釋液；3，102倍稀釋液；4，103倍稀釋液；5，104倍稀釋液；6，105倍稀釋液；7，106倍稀釋液)。圖6為vc陽性。圖7位vp陽性圖8為va陽性圖9為vv陽性圖10為三重熒光定量pcr擴增曲線。圖11為三重熒光定量pcr靈敏度檢測。圖12為三重熒光定量pcr對海洋水樣的檢測。圖13為本發(fā)明試劑盒檢測方法示意圖。具體實施方式下面結合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明作出進一步地詳細闡述，所述實施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。實施例1四種海洋弧菌陽性參照物的制備本實施例所用菌株為：霍亂弧菌分離培養(yǎng)物(vibriocholerae，vc)，副溶血弧菌(vibrioparahemolyticus，vp)，溶藻弧菌(vibrioalginolyticus，va)，創(chuàng)傷弧菌(vibriovulnificus,vv)，以上菌株均由深圳出入境檢驗檢疫局技術中心水生室分離和保存。1、弧菌dna的提取分別用無菌接種針從保存在冰箱的vc、vp、va和vv這四種菌株的培養(yǎng)物中挑取菌種到堿性蛋白胨水的試管中，過夜培養(yǎng)，第二天，直接取四種弧菌的培養(yǎng)物約200μl，12000g/min離心5min，取沉淀物，用dna抽提試劑盒分別提取四種弧菌的總dna，-20℃存放備用。2、四種弧菌16srdna擴增引物的設計四種弧菌16srdna基因參考序列的genbank序列號(genbankno.)如下：vc(v.cholerae,lmg21698t)，nc_002505；vp(v.parahaemolytic,lmg2850t)，ba000031；vv(v.vulnificus,lmg13545t)，nc_005139；va(v.alginolyticus,lmg4409t)。根據(jù)上述弧菌的16srdna序列設計引物：27f：5’-agagtttgatcmtggctcag-3’；1492r：5’-tacggytaccttgttacgactt-3’；使該引物能夠通過普通pcr擴增出上述四種弧菌16srdna基因，使該引物擴增的基因序列完全包含圖1的序列，即包含han-hv和han-r-c的通用引物區(qū)域，使陽性對照擴增的靶序列的堿基數(shù)要多于han-hv和han-r-c引物擴增產物。3、弧菌16srdna的pcr擴增(1)分別以四種弧菌基因組dna為模板，以使用引物27f和1492r引物進行pcr擴增。pcr反應體系：extaq酶系統(tǒng)25μl，上游引物1μl，下游引物1μl，模板6μl，ddh2o17μl，共50μl體系，做四個平行。反應條件：95℃預變性3min、94℃變性45s、退火45s、72℃延伸1min20s為一個循環(huán)，進行31個循環(huán)后，72℃再延伸7min，擴增結束后，1％瓊脂糖凝膠電泳(100ml凝膠體系中加入5μl的andygolddnagelstain染料)。(2)pcr擴增產物的檢測使用1～1.5％瓊脂糖凝膠電泳進行檢查，使用電壓為110v，電泳時間25～30min，電泳結束后，使用bio-rad型凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結果確定為目的條帶后，切膠備用。4、弧菌重組質粒dna的制備與檢測(1)pcr擴增產物的純化用dna凝膠回收試劑盒進行pcr擴增產物回收。(takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.3.0)切膠前，用大孔的膠板電泳，于大孔中加入100μl，小孔中加marker。dna片段經瓊脂糖凝膠電泳分離，于長波紫外燈下切取含有目的片段的瓊脂糖凝膠，切成兩段放入兩個無菌的1.5ml的eppendorf管中，分別加入200μl的gm溶膠液(1％膠濃度，加入3個凝膠體積量的gm溶膠液)，振蕩，于37℃水浴5～10min，其間輕彈ep管，使凝膠完全溶化。然后將溶化的液體轉移至回收柱，柱子置于收集管中，于室溫靜置2min，14000rpm離心1min，棄濾液，用bufferwb洗兩次，每次700μl，14000rpm離心30s，最后14000rpm離心2min，將回收柱轉至干凈的1.5mlep管中，靜置5min，待乙醇揮發(fā)，加入ddh2o分三次洗脫，每次10μl于室溫放置3min，14000rpm離心1min，收集管中即為回收的dna片段，可直接用于dna酶切及連接等實驗，也可于-20℃保存?zhèn)溆谩?2)目的片段的連接本實驗選用takara的pmd18-t載體連接試劑盒。10μl連接反應體系：5μlligasebuffer(solutioni)、0.5μlt-vector、目的基pcr擴增純化提取液4.5μl，混勻后，在pcr儀中，設置16℃連接過夜。(3)連接產物的轉化取出制備好的e.colidh5α感受態(tài)細胞，置于冰上融化，取兩個1.5ml的ep管，分別加入50μl的感受態(tài)細胞，再將10μl連接產物加入，用移液器輕輕吹打混勻，在冰上放置5～10min，取出，置于42℃水浴，熱休克70～90s，取出置于冰上3～5min，在分別向兩管加入750μl的lb液體培養(yǎng)基，搖床37℃，220rpm，50min～1h，轉移至高速離心機中，9000rpm，3～5min，棄400μl上清液，每管剩余410μl再懸浮，分兩次，每次200μl涂在含100μg/mlamp的lb固體平板上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)約16h，翌日可見白色單菌落。(4)重組質粒dna的擴增在超凈臺中吸取5ml含100μg/mlamp的lb液體培養(yǎng)基至玻璃試管中，從含amp的lb固體培養(yǎng)基上挑取單菌落轉移至試管中，將試管標號，其中0號管是陰性對照，置于搖床中37℃，200rpm，培養(yǎng)16h。(5)菌落pcr鑒定重組質粒dna搖床培養(yǎng)8h時，對應培養(yǎng)的試管號，吸取3μl菌液做pcr模板，pcr體系為25μl：7.5μlddh2o、12.5μlextaq酶系統(tǒng)、1μl上游引物、1μl下游引物、3μl模板，進行pcr鑒定。(6)重組質粒的制備將菌落pcr鑒定為陽性的對應試管，提取質粒，按照(takaraminibestplasmidpurificationkitver.3.0)操作。每個菌株選取兩管，每管分出10μl，測序鑒定陽性質粒，剩余的-20℃保存，備用。測序結果為陽性的質粒大量提取和純化，然后用核酸蛋白分析儀測定質粒濃度，根據(jù)阿弗加德羅常數(shù)將濃度轉換為拷貝數(shù)，根據(jù)260nm與280nm波長下的光密度比值判斷其純度(當od260nm/od280nm>1.8為純品)，純品按公式計算拷貝數(shù)。結果：通過分子克隆技術將四種弧菌16srdna克隆到pmd-t載體，分別得到如下陽性質粒模板：pmd-vc、pmd-vp、pmd-vv和pmd-va，通過測序證明載體上的所有基因片段包含有通用引物han-hv和han-r的擴增片段區(qū)域，這些陽性模板將作為后期試劑盒研發(fā)測試的基本材料。經過計算所獲得的陽性質粒模板濃度及拷貝數(shù)如表9所示。表1四種弧菌核酸片段最適退火溫度和擴增片段大小及重組質粒5、四種弧菌16srdna模板的驗證(1)根據(jù)四種弧菌16srdna基因序列的同源區(qū)設計pcr兼并引物：han-hv：5’-gayttygcnwsnytntaycc-3’；han-r：5’-tcngtrtcnccrta-3’。(2)通用引物核酸擴增測試利用簡并引物，將已經測過序并確定為目標基因的四種弧菌16srdna基因的重組質粒為模板進行pcr條件摸索。pcr反應體系：extaq酶系統(tǒng)12.5μl，上游引物1μl(20μm)，下游引物1μl(20μm)，模板3μl，ddh2o7.5μl，共25μl體系。反應條件：95℃預變性3min、94℃變性45s、退火溫度設置12個溫度梯度(最低溫度為40℃，最高溫度為49℃)退火2min、72℃延伸2min為一個循環(huán)，進行31個循環(huán)后，72℃再延伸7min，擴增結束后，1％瓊脂糖凝膠電泳(100ml凝膠體系中加入5μl的andygolddnagelstain染料)觀察結果。結果：利用簡并引物分別對四種弧菌pcr擴增的退火溫度經摸索后，得出各自的最適退火溫度。對應vc、vp、va和vv的pcr退火溫度分別為45.1℃、46℃、42.9℃和49℃，反應體系為25μl體系：extaq酶系統(tǒng)12.5μl，上游引物1μl(20μm)，下游引物1μl(20μm)，模板3μl，ddh2o7.5μl。所用兼并引物能夠從重組質粒pmd-vc、pmd-vp、pmd-va和pmd-vv中擴增到目的片段，擴增片段大小分別為459bp，657bp，484bp，484bp，經過測序確證是相應的16srdna基因片段，即兼并引物能夠有效擴增所有重組質粒上插入的對應片段。(3)pcr靈敏度分別將含有四種弧菌16srdna基因的質粒進行梯度稀釋至10-6濃度。即，原液，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6。按優(yōu)化過的pcr條件操作，測試利用簡并引物對四種弧菌做普通pcr的最低檢測濃度，pcr反應條件同上。結果：表2為用hanson引物擴增4種弧菌預計擴增產物片段長度以及反應最適退火溫度，圖2～5為pcr反應結果。表2hanson引物針四種弧菌的最適退火溫度弧菌種類退火溫度片段大小vc46℃657bpvp43.9℃604bpva45.1℃459bpvv49℃484bp由圖2～5分析可知，vc和vp模板稀釋105倍時，即為普通pcr的檢測下限；va和vp模板稀釋104倍時，即為普通pcr的檢測下限；通過對五種弧菌進行的簡并pcr結果分析可知，hanson設計的簡并引物能較好的擴增出除va以外的四種弧菌，對vv的效果不是很理想。而由圖，vv的非特異性條帶較多。簡并引物對vc和vp的特異性相對較好。由圖2～5可以看出，vc，vp，va，vv四種弧菌經簡并pcr擴增后，所得目的條帶與預期值接近，只有擴增vc弧菌的dna聚合酶基因組大小與預期值相比偏小，經測序，該片段確為vp弧菌的dna聚合酶基因，但是大小604bp較760bp的預期值小了156bp。陽性重組質粒為模板，用通用引物擴增可以獲得預計大小的dna片段，獲得的擴增產物通過測序驗證為四種dna聚合酶基因的擴增產物，獲得的重組質粒的濃度及拷貝數(shù)如表1所示。因此，陽性重組質?？梢宰鳛殛栃阅０逶诤罄m(xù)研究中使用。實施例2四種弧菌的三重熒光定量pcr試驗樣品為實施例1制備的陽性質粒pmd-vc、pmd-vp、pmd-vv和pmd-va。1、引物和探針設計設計擴增四種弧菌16srdna基因的引物和探針，實驗用探針為taqmanmgb探針，在tamer之后再標記一個mgb(minorgroovebinder)，可使探針的tm值較高，即使探針片段較短，也可達到taqman探針的tm值要求(68-70℃)。表3realtimepcr引物序列弧菌名稱名稱序列(方向為5’to3’)霍亂弧菌vc-fggtgctccgagtggatagavc-rtgcttgagtgccctcttatgvc-ttcccaagctcgtccgcc(5′fam，3′bhq1)副溶血弧菌vp-fagaaccagctggggacaavp-rgtcgaggagattggtgaggvp-ttgcgcctgcaggctcc(5'cy3,3'bhq2)溶藻弧菌va-fcgagtctgtaccccagcava-rcggtatctttttccaatcgagva-tacggaggcatcagcccaga(5′hex，3′bhq1)創(chuàng)傷弧菌vv-ftgctacaagaacaaggaggtcvv-racctcatgctcaggtagtggvv-tggctgggtccgcttcga(5′rox，3′bhq2)2、單重pcr對引物和探針的驗證(1)將弧菌的上下游引物和分子信標探針同時加入反應體系中，于abi7500熒光定量pcr儀上進行檢測反應。分別選用0.2、0.4、0.6、0.8、1μmol/l的引物濃度和0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6μmol/l的探針終濃度，采用矩陣法篩選引物和探針的最佳濃度，以獲得最低的ct值和較高的熒光強度增加值(δrn)時的引物和探針濃度為最佳。(2)touchdownpcr以四種弧菌dna或者陽性質粒為模板(本研究中用陽性質粒做模板方便研究檢測方法的特異性和靈敏性)，以han-hv和han-r為引物，對待檢底物做初步擴增。反應體系和條件如下所示，通過此程序對樣品中含有所有目的核酸片段都能得到初步擴增，有效提高后續(xù)熒光定量pcr的模板量。表425μl反應體系的pcr反應的反應體系組成反應試劑加樣體積模板dna3μl2xextaqmixture12.5μlhan-forwardprimer1μlhan-reverseprimer1μl雙蒸水7.5μl總體積25μl反應條件：95℃，4min；94℃45s，42℃45s，72℃45s，2個循環(huán)；94℃45s，43℃45s，72℃45s，2個循環(huán)；94℃45s，44℃45s，72℃45s，2個循環(huán)；94℃45s，45℃45s，72℃45s，2個循環(huán)；94℃45s，46℃45s，72℃45s，2個循環(huán)；94℃45s，47℃45s，72℃45s，2個循環(huán)；94℃45s，48℃45s，72℃45s，2個循環(huán)；94℃45s，49℃45s，72℃45s，2個循環(huán)；94℃45s，45℃45s，72℃45s，15個循環(huán)；72℃，5min4℃，pause(3)熒光定量pcr將實施例1中的擴增產物稀釋100倍作為模板，用相應引物和探針做熒光定量pcr擴增，反應體系和條件如表5所示。表520μl體積的反應體系組成上游引物0.5μl下游引物0.5μl探針0.08μlmix10μlrox0.5μl模板touchdownpcr產物2μl雙蒸水6.3μl反應條件：50℃，2min95℃，10min95℃，10min60℃，1min，40個循環(huán)結果：引物濃度和探針濃度對realtimepcr的擴增效率有一定的影響，為了探索引物和探針濃度的相互關系，選用ccv重組質粒，以其不同濃度的引物和探針做realtimepcr，通過pcr的結果即循環(huán)數(shù)(ct值)分析擴增效率，ccv重組質粒模板2μl，熒光pcrmix(2×)10μl，上游引物xμl(20μm)，下游引物xμl(20μm)，探針yμl(50μm)，ddh2o處理水補足到20μl。結果見表6，從表中可以看出，以上述反應體系而言，引物加樣體積為0.5μl(終濃度為0.5μm)和探針加樣體積為0.08μl(終濃度為0.2μm)是反應體系較佳的引物與探針的比例。表6ccv重組質粒使用不同引物和探針濃度的擴增效率3、熒光定量pcr的靈敏性、特異性和重復性實驗對已知拷貝數(shù)的含有目的擴增片段的重組質粒進行10倍系列稀釋，對各稀釋度同時進行熒光pcr檢測，從而確定該方法的最低檢出限，評價熒光定量pcr的檢測靈敏度，并建立絕對定量標準曲線。對最低檢測限濃度的質粒再做十倍稀釋，經hanson的簡并pcr擴增后，將產物再用熒光定量pcr對其進行檢測，直至稀釋的質粒模板經簡并pcr后，熒光定量pcr也不能檢出目的基因，記下此時的最低檢測限，與原有最低檢測限相比，可得出經此法比原有的熒光定量pcr最低檢測限提高了多少個靈敏度。將含有四種弧菌16srdna序列的質粒兩兩混合，按照優(yōu)化過的條件，做熒光定量pcr，比較特異性。(選取質粒的ct值較近，即濃度相對較近的稀釋度，兩兩混合。)在同一次實驗中，對十倍系列稀釋的樣品進行熒光定量pcr檢測，每個樣品做6個平行的反應管，通過計算標準差(sd)和變異系數(shù)(cv，標準偏差/重復值的平均數(shù))來驗證熒光定量pcr批內的重復性。對上述各梯度稀釋的樣品進行組間重復實驗。(1)熒光定量pcr反應的靈敏性因為直接使用realtimepcr可以對模板中的目的dna片段檢測，所以一般認為realtimepcr的敏感性極高，可以達到日常檢測的目的。本研究在realtimepcr之前增加普通pcr初步擴增，研究對一般realtimepcr敏感性提高水平，結果如表7所示，從表中的數(shù)據(jù)可以看出通過用通用引物的pcr初步擴增將realtimepcr敏感性普遍提高了100倍，基本對模板中100copies/μl的目標序列可以有效檢出，因此，在realtimepcr之前增加的通用引物的touchdownpcr可以明顯提高四種病原的檢出率。表7五種弧菌的熒光定量pcr的靈敏性(2)熒光定量pcr反應的特異性對于特定檢測對象只能使用相應的引物和探針做出陽性反應的結果，而其它引物和探針只有陰性反應，見表8，證明設計的引物和探針具有很高的特異性。表8四種弧菌模板對其余弧菌檢測所用體系的檢測結果比較(3)熒光定量pcr的干擾性實驗如果樣本中含有多個弧菌成分，需要通過一步反應將目標序列檢出，這時候一個體系中所用檢測兩種或者多種靶序列的的引物和探針有可能相互之間干擾，進而影響檢測結果的準確性，本研究用三重反應體系分別檢測vc、vp、vv和vadna模板，以確定4種弧菌的探針、引物之間是否存在相互干擾現(xiàn)象。4、建立二重及三重real-timepcr的檢測方法在單重real-timepcr測試的基礎上，對探針引物濃度進行優(yōu)化后，建立三重熒光定量pcr反應體系20μl：2×qpcrsupermix-udg10μl，vc引物(上下游各20μm)0.5μl，vp引物(上下游各20μm)0.5μl，va引物(上下游各20μm)0.5μl，vc探針(10μm)0.5μl，vp探針(10μm)0.5μl，va探針(10μm)0.5μl，rox0.5μl，模板2μl，ddh2o3μl。反應條件：95℃，10min；95℃，15s；60℃，1min；40個循環(huán)。測試步驟依然是兩步pcr，首先作touchdownpcr對樣本中的模板初步擴增，然后通過二重及三重real-timepcr鑒別不同類型的核酸。(1)特異性試驗提取另外一種弧菌dna(創(chuàng)傷弧菌vv)做為模板，分別進行三重熒光定量pcr檢測，以確定三重熒光定量pcr反應的特異性。結果：由圖10可知，同一反應體系中，三種信號間的影響不大，可以有效的區(qū)分出來。三重熒光定量pcr體系優(yōu)化的實驗結果表明，不同濃度的引物和探針的的配比對檢測結果的影響較大，而三種引物和探針的濃度比為2:1時，效果較好。本實驗采用的，三種引物的濃度為0.5μmol/l，探針為0.25μmol/l。提取創(chuàng)傷弧菌vv做為模板，分別進行三重熒光定量pcr檢測，以確定該方法的特異性，結果這兩種弧菌都沒有擴增，說明該方法有較強特異性。(2)敏感性試驗將3種弧菌的dna陽性質粒到相同濃度，混勻進行10倍系列稀釋，得到2種弧菌dna濃度均為107拷貝/μl，106拷貝/μl，105拷貝/μl，104拷貝/μl，103拷貝/μl，102拷貝/μl，101拷貝/μl。利用已建立的三重熒光定量pcr的方法對其檢測。結果：對3種弧菌的混合稀釋的陽性標準品進行三重熒光定量pcr檢測，圖11所示，a、b、c分別為cv和cp的靈敏度測試結果。曲線從左至右一次代表拷貝數(shù)為107/μl～10/μl。有圖可知在模板濃度為107/μl～102/μl時，濃度與ct值成正比，而當模板濃度為10拷貝/μl時，ct值與模板濃度不成線性關系，且呈現(xiàn)弱陽性。故三重熒光定量pcr對兩種弧菌模板最低可檢測至102拷貝/μl。(3)干擾性試驗為確定2種弧菌的探針、引物之間是否存在相互干擾現(xiàn)象，我們用三重反應體系分別檢測vc和vp的dna模板，結果模板的擴增曲線，均只有一種特異性探針發(fā)生水解，得到一條擴增曲線，另外兩種探針檢測顯示為陰性，說明各探針、引物之間無相互干擾現(xiàn)象。(4)三重和單重熒光定量pcr方法的比較為比較三重熒光定量pcr與單重之間的差異，將兩種弧菌混合后，十倍稀釋，取混合液中，兩種弧菌的濃度為106拷貝/μl、105拷貝/μl、104拷貝/μl、103拷貝/μl四個稀釋度為模板，然后分別用單重實時熒光pcr和多重實時熒光pcr進行檢測，每組做三個平行，以確定單重和多重實時熒光pcr之間的差異。單重熒光定量pcr反應體系20μl：2×qpcrsupermix-udg10μl，引物(上下游各20μm)0.5μl，探針(10μm)0.5μl，rox0.5μl，模板2μl，ddh2o6μl。反應條件：95℃，10min；95℃，15s；60℃，1min；40個循環(huán)。結果：如表9可知，三重熒光定量pcr在對兩種弧菌的不同濃度模板檢測時，變異系數(shù)介于0.24％～2.42％之間，說明該法具有良好的穩(wěn)定性。對數(shù)據(jù)分析的結果，單重實時熒光pcr和三重熒光定量熒光pcr在同一濃度模板檢測上并沒有明顯差異。表9兩種不同稀釋度模板的單重和三重熒光定量pcr效果比較*注：三重熒光定量pcrct值與各自單重熒光定量pcrct值無顯著差異(p＞0.05)(5)三重熒光定量pcr對水樣的檢測本研究建立的三重熒光定量pcr方法對相應的水樣進行實測，以驗證方法的靈敏性和特異性。使用試劑盒從水樣中分別抽提四種弧菌的dna。并將得到的dna樣品按1：1混合，用建立的三重熒光定量pcr方法進行檢測。將含有vc、vp和va的dna混合，再利用建立的三重熒光pcr對其進行檢測。圖12結果證明，該法確實能有效的檢測并區(qū)分vc、vp和va，具有一定的實用意義。sequencelisting<110>廣東海洋大學深圳市檢驗檢疫科學研究院深圳市中大創(chuàng)新生物科技有限責任公司<120>一種同時檢測四種海洋弧菌的試劑盒及檢測方法<130>2016<160>14<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>han-hv<220><221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>nisa,c,g,ort<220><221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>nisa,c,g,ort<220><221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>nisa,c,g,ort<400>1gayttygcnwsnytntaycc20<210>2<211>14<212>dna<213>han-r<220><221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>nisa,c,g,ort<220><221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>nisa,c,g,ort<400>2tcngtrtcnccrta14<210>3<211>19<212>dna<213>vc-f<400>3ggtgctccgagtggataga19<210>4<211>20<212>dna<213>vc-r<400>4tgcttgagtgccctcttatg20<210>5<211>17<212>dna<213>vc-t<400>5tcccaagctcgtccgcc17<210>6<211>18<212>dna<213>vp-f<400>6agaaccagctggggacaa18<210>7<211>19<212>dna<213>vp-r<400>7gtcgaggagattggtgagg19<210>8<211>16<212>dna<213>vp-t<400>8tgcgcctgcaggctcc16<210>9<211>18<212>dna<213>va-f<400>9cgagtctgtaccccagca18<210>10<211>21<212>dna<213>va-r<400>10cggtatctttttccaatcgag21<210>11<211>19<212>dna<213>va-t<400>11acggaggcatcagcccaga19<210>12<211>21<212>dna<213>vv-f<400>12tgctacaagaacaaggaggtc21<210>13<211>20<212>dna<213>vv-r<400>13acctcatgctcaggtagtgg20<210>14<211>17<212>dna<213>vv-t<400>14ggctgggtccgcttcga17當前第1頁12