專利名稱：一種海洋弧菌的多重pcr反應(yīng)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及靶DNA片斷的檢測(cè)技術(shù)，具體涉及一種海洋弧菌的多重PCR反應(yīng)試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
由弧菌屬的細(xì)菌引起的弧菌病已經(jīng)嚴(yán)重危害了海水養(yǎng)殖業(yè)。海洋弧菌中的溶藻弧菌、哈維氏弧菌和副溶血弧菌是主要的致病菌，其能感染石斑魚、真鯛、鱸魚、大黃魚、牙鲆和大菱鲆等魚類動(dòng)物，也能感染蝦、三疣梭子蟹、鋸緣青蟹等甲殼類動(dòng)物，以及文蛤，鮑，牡蠣等貝類動(dòng)物，弧菌病具有發(fā)病快、傳染性高和死亡率高的特點(diǎn)，感染弧菌病的海洋動(dòng)物會(huì)發(fā)生表皮潰瘍，爛尾，腹水，爛眼等癥狀，因此弧菌病對(duì)養(yǎng)殖海洋動(dòng)物造成極大的危害，導(dǎo)致海水養(yǎng)殖業(yè)的極大經(jīng)濟(jì)損失。
對(duì)弧菌病的致病菌種的準(zhǔn)確快速的檢測(cè)是用藥防治的依據(jù)，用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR反應(yīng))檢測(cè)弧菌病的致病菌種，具有快速，敏感，特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，PCR反應(yīng)試劑盒是在PCR反應(yīng)管中裝有包括10×PCR反應(yīng)緩沖液(含Mg2+)、dNTP、Hot star Taq酶、致病菌種的DNA引物和滅菌去離子水混合的反應(yīng)液，其檢測(cè)方法是提取該弧菌病的致病菌種的DNA，把DNA加入到PCR反應(yīng)試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物與陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照品的電泳結(jié)果對(duì)比判斷，是否存在該DNA引物的致病菌種，從而找出弧菌病的致病菌種；但現(xiàn)有的PCR反應(yīng)試劑盒中一般只含有一種致病菌種的單對(duì)引物，因此每個(gè)PCR反應(yīng)試劑盒只能擴(kuò)增一種致病菌種的DNA，即一次只能檢測(cè)一種致病菌種，而導(dǎo)致弧菌病的致病菌種多種多樣，弧菌病的癥狀表現(xiàn)也多種多樣，這樣就給選擇用含有哪種致病菌種的DNA引物的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)帶來(lái)了困難，往往需要多次檢測(cè)才能找到致病菌種，有些弧菌病是受幾種海洋弧菌聯(lián)合感染，因此就需要對(duì)幾種致病菌種用不同的PCR反應(yīng)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，才能檢測(cè)出感染弧菌病的幾種致病菌種，這樣使得檢測(cè)致病菌種的時(shí)間延長(zhǎng)，檢測(cè)費(fèi)用也增加，并且耽誤了弧菌病的防治時(shí)間，導(dǎo)致了弧菌病的擴(kuò)散傳染，從而導(dǎo)致感染弧菌病的海洋動(dòng)物的病情加重和更多的海洋動(dòng)物感染弧菌病，使得海水養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種海洋弧菌的多重PCR反應(yīng)試劑盒及其檢測(cè)方法，其具有能同時(shí)檢測(cè)三種海洋弧菌的優(yōu)點(diǎn)，縮短了檢測(cè)弧菌病的致病菌種的時(shí)間，降低了檢測(cè)成本。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為一種海洋弧菌的多重PCR反應(yīng)試劑盒，包括PCR反應(yīng)液，所述的PCR反應(yīng)液由10×PCR反應(yīng)緩沖液(含Mg2+)、dNTP、Hot star Taq酶、致病菌種的DNA引物和滅菌離子水配制而成，所述的致病菌種的DNA引物為下述三種弧菌的DNA引物，即溶藻弧菌的DNA引物上游引物為5’-cga gta cag tca ctt gaa agc c-3’，下游引物為5’-cac aac aga act cgc gtt acc-3’，哈維氏弧菌的DNA引物上游引物為5’-gaa gca gca ctc acc gat-3’，下游引物為5’-ggt gaa gac tca tca gca-3’，副溶血弧菌的DNA引物上游引物為5’-gaa agt tga aca tca tca gca cga-3’，下游引物為5’-ggt cag aat caa acg ccg-3。
Hot star Taq酶是5U/μl的DNA聚合酶的熱啟動(dòng)版本。
dNTP是每種濃度為2.5mmol/L的dATP、dTTP、dCTP和dGTP的混合物。
三種弧菌的DNA引物是由生物公司合成，如表1所示，三種弧菌的DNA引物的兩兩之間無(wú)三對(duì)堿基以上的互補(bǔ)，引物的PCR反應(yīng)退火溫度為48℃～54℃，引物的PCR反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度大小接近，但兩兩之差仍大于100bp，因此能通過(guò)電泳把它們分開。
表1

所述的PCR反應(yīng)液為23.5μl，包括10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μl、dNTP2.0μl、Hotstar Taq酶0.2μl、最終濃度為0.4μmol/L～0.8μmol/L的溶藻弧菌引物0.5μl、最終濃度為0.4μmol/L～0.8μmol/L的哈維氏弧菌引物0.5μl、最終濃度為0.16μmol/L～0.8μmol/L的副溶血弧菌引物0.5μl，用滅菌去離子水定容。
溶藻弧菌引物的最終濃度為0.4μmol/L、哈維氏弧菌引物的最終濃度為0.4μmol/L、副溶血弧菌引物的最終濃度為0.4μmol/L。
一種海洋弧菌的檢測(cè)方法，包括采集和提取海洋弧菌的DNA的樣品模板，將樣品模板加入到多重PCR反應(yīng)試劑盒中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)后得到成像結(jié)果，所述的PCR反應(yīng)擴(kuò)增的試劑盒包括PCR反應(yīng)液，所述的PCR反應(yīng)液由10×PCR反應(yīng)緩沖液(含Mg2+)、dNTP、Hot star Taq酶、致病菌種的DNA引物和滅菌離子水配制而成，所述的致病菌種的DNA引物為下述三種弧菌的DNA引物，即溶藻弧菌的DNA引物上游引物為5’-cga gta cag tca ctt gaa agc c-3’，下游引物為5’-cac aac aga act cgc gtt acc-3’，哈維氏弧菌的DNA引物上游引物為5’-gaa gca gca ctc acc gat-3’，下游引物為5’-ggt gaa gac tca tca gca-3’，副溶血弧菌的DNA引物上游引物為5’-gaa agt tga aca tca tca gca cga-3’，下游引物為5’-ggt cag aat caa acg ccg-3。
PCR的擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s、54℃退火30s、68℃延伸1min20s，進(jìn)行4個(gè)循環(huán)后，退火溫度降低2℃，退火溫度每降低2℃后再進(jìn)行4個(gè)循環(huán)，到退火溫度降到48℃時(shí)，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，然后在68℃溫度下延伸7min。
成像顯示出的擴(kuò)增片段的特異性條帶分別為溶藻弧菌737bp，哈維氏弧菌382bp，副溶血弧菌271bp。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于由于海洋弧菌的多重PCR反應(yīng)試劑盒的致病菌種的DNA引物為下述的三種海洋弧菌的DNA引物溶藻弧菌的DNA引物上游引物為5’-cga gta cag tca ctt gaa agc c-3’，下游引物為5’-cac aac aga act cgc gtt acc-3’，哈維氏弧菌的DNA引物上游引物為5’-gaa gca gca ctc acc gat-3’，下游引物為5’-ggt gaa gac tca tca gca-3’，
副溶血弧菌的DNA引物上游引物為5’-gaa agt tga aca tca tca gca cga-3’，下游引物為5’-ggt cag aat caa acg ccg-3；這樣用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)就能檢測(cè)出與上述三種海洋弧菌的DNA引物相對(duì)應(yīng)的溶藻弧菌、哈維氏弧菌和副溶血弧菌；另外由于本發(fā)明的檢測(cè)方法利用上述的試劑盒檢測(cè)海洋動(dòng)物的弧菌病的致病菌種，因此能檢測(cè)出上述的三種海洋弧菌，這樣就縮短了檢測(cè)致病菌種的時(shí)間，降低檢測(cè)成本，從而能較快地找出感染弧菌病的海洋動(dòng)物的致病菌種，達(dá)到及時(shí)有效的防治，避免了更多的海洋動(dòng)物感染弧菌病，減少了海水養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失。


圖1為一種致病菌種感染的弧菌病的本發(fā)明檢測(cè)成像結(jié)果照片；M100bpDNA Ladder1、2為溶藻弧菌(737bp)，3、4為哈維氏弧菌(382bp)，5、6為副溶血弧菌(271bp)，7為陰性對(duì)照；圖2為二種和三種致病菌種聯(lián)合感染的弧菌病的本發(fā)明檢測(cè)成像結(jié)果照片；三種致病菌種聯(lián)合感染M100bpDNALadder1為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品溶藻弧菌(737bp)+哈維氏弧菌(382bp)+副溶血弧菌(271bp)；2～6為檢測(cè)結(jié)果溶藻弧菌(737bp)+哈維氏弧菌(382bp)+副溶血弧菌(271bp)；7陰性對(duì)照；二種致病菌種聯(lián)合感染M100bpDNA Ladder8、9為溶藻弧菌(737bp)+哈維氏弧菌(382bp)；10、11為哈維氏弧菌(382bp)+副溶血弧菌(271bp)；12、13為溶藻弧菌(737bp)+副溶血弧菌(271bp)；14陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
實(shí)施例1一種海洋弧菌的多重PCR反應(yīng)試劑盒，在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)管中裝有PCR反應(yīng)液23.5μl，PCR反應(yīng)液包括10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μl，dNTP 2.0μl、5U/μl的Hot star Taq酶0.2μl、最終濃度為0.4μmol/L的溶藻弧菌引物0.5μl、最終濃度為0.4μmol/L的哈維氏弧菌引物0.5μl、最終濃度為0.4μmol/L的副溶血弧菌引物0.5μl，加入滅菌去離子水定量到23.5μl；溶藻弧菌的DNA引物上游引物為5’-cga gta cag tca ctt gaa agc c-3’，下游引物為5’-cac aac aga act cgc gtt acc-3’，哈維氏弧菌的DNA引物上游引物為5’-gaa gca gca ctc acc gat-3’，
下游引物為5’-ggt gaa gac tca tca gca-3’，副溶血弧菌的DNA引物上游引物為5’-gaa agt tga aca tca tca gca cga-3’，下游引物為5’-ggt cag aat caa acg ccg-3；所有引物由生物公司合成。
實(shí)施例2與實(shí)施例1基本相同，所不同的只是溶藻弧菌引物的最終濃度為0.6μmol/L，哈維氏弧菌引物的最終濃度為0.6μmol/L，副溶血弧菌引物的最終濃度為0.4μmol/L。
實(shí)施例3一種海洋弧菌的檢測(cè)方法，其檢測(cè)步驟如下1、采集和提取海洋弧菌的DNA的樣品模板從感染弧菌病的大黃魚的肝臟中采集海洋弧菌的樣品；然后按下面步驟提取海洋弧菌的DNA的樣品模板；1)將樣品稀釋到裝有1.5ml TE緩沖液的微離心管中，用8000rpm離心1min，去上清后，2)加入到567μl的TE緩沖液中，反復(fù)吹打使之重懸，加入30μl 10％(W/V)SDS溶液，混勻，加入3μl濃度為20mg/ml的蛋白酶K，上下顛倒混勻，置于37℃水浴1h，每10分鐘上下顛倒混勻一次；3)加入100μl 5mol/L的NaCl，充分混勻，加入80μl CTAB/NaCl溶液，混勻，65℃水浴10min；4)加入等體積氯仿/異戊醇，用12000rpm離心5min，將上相移入一新的離心管；5)加入等量的酚∶氯仿∶戊醇(25∶24∶1)混合液，充分混勻混合液，呈乳濁液，室溫下用12000rpm離心5min，若有機(jī)相與水相不能充分分開，延長(zhǎng)時(shí)間重新離心；6)吸取上層水相于另一離心管中；7)加入0.6體積異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀，沉淀移至1ml70％乙醇中洗滌，12000rpm離心2min，棄上清；8)室溫下晾干，盡量除去乙醇，但不可使DNA過(guò)于干燥，得到的DNA沉淀懸浮于50μl TE(PH8.0)緩沖液中，就是海洋弧菌的DNA的樣品模板，在-20℃下貯存?zhèn)溆谩?br> 2、吸取1.5μl的樣品模板加入到實(shí)施例1的PCR反應(yīng)試劑盒中，然后在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s、54℃退火30s、68℃延伸1min20s，進(jìn)行4個(gè)循環(huán)后，退火溫度降低2℃，退火溫度每降低2℃后再進(jìn)行4個(gè)循環(huán)，到退火溫度降到48℃時(shí)，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，然后在68℃溫度下延伸7min；3、對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)將擴(kuò)增產(chǎn)物和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照品在1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，然后在用紫外凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像，得到圖1中的1、2的成像結(jié)果，從而檢測(cè)出感染弧菌病的大黃魚的致病菌種為溶藻弧菌737bp。
實(shí)施例4與實(shí)施例3基本相同，所不同的只是從感染弧菌病的鱸魚的腎臟采集海洋弧菌的樣品；得到圖2中的2～6的成像結(jié)果，從而檢測(cè)出感染弧菌病的鱸魚的致病菌種為溶藻弧菌737bp+哈維氏弧菌382bp+副溶血弧菌271bp，是三種海洋弧菌聯(lián)合感染。
實(shí)施例5與實(shí)施例3基本相同，所不同的只是從感染弧菌病的鋸緣青蟹的肝臟采集海洋弧菌的樣品；得到圖2中的10、11的成像結(jié)果，從而檢測(cè)出感染弧菌病的鋸緣青蟹的致病菌種為哈維氏弧菌382bp+副溶血弧菌271bp，是二種海洋弧菌聯(lián)合感染。
與實(shí)施例3基本相同，也可以對(duì)真鯛、石斑魚、牙鲆和大菱鲆等魚類動(dòng)物感染弧菌病的表皮潰瘍，爛尾，腹水，爛眼、肝臟，脾臟，腎臟，血液等進(jìn)行檢測(cè)；也能對(duì)感染弧菌病的甲殼類動(dòng)物和貝類動(dòng)物等海洋動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)，可以得到圖1中的1、2為溶藻弧菌(737bp)或3、4為哈維氏弧菌(382bp)或5、6為副溶血弧菌(271bp)成像結(jié)果的單種致病弧菌的感染，也可以得到圖2中的2～6成像結(jié)果的三種海洋弧菌聯(lián)合感染，以及圖2中的8、9為溶藻弧菌(737bp)+哈維氏弧菌(382bp)，10、11為哈維氏弧菌(382bp)+副溶血弧菌(271bp)，12、13為溶藻弧菌(737bp)+副溶血弧菌(271bp)成像結(jié)果的二種海洋弧菌聯(lián)合感染。
權(quán)利要求
1.一種海洋弧菌的多重PCR反應(yīng)試劑盒，包括PCR反應(yīng)液，所述的PCR反應(yīng)液由10×PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP、Hot star Taq酶、致病菌種的DNA引物和滅菌離子水配制而成，其特征在于所述的致病菌種的DNA引物為下述三種弧菌的DNA引物，即溶藻弧菌的DNA引物上游引物為5’-cga gta cag tca ctt gaa agc c-3’，下游引物為5’-cac aac aga act cgc gtt acc-3’，哈維氏弧菌的DNA引物上游引物為5’-gaa gca gca ctc acc gat-3’，下游引物為5’-ggt gaa gac tca tca gca-3’，副溶血弧菌的DNA引物上游引物為5’-gaa agt tga aca tca tca gca cga-3’，下游引物為5’-ggt cag aat caa acg ccg-3。
2.如權(quán)利要求1所述的一種海洋弧菌的多重PCR反應(yīng)試劑盒，其特征在于所述的PCR反應(yīng)液為23.5μl，包括10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μl、dNTP2.0μl、Hot star Taq酶0.2μl、最終濃度為0.4μmol/L～0.8μmol/L的溶藻弧菌引物0.5μl、最終濃度為0.4μmol/L～0.8μmol/L的哈維氏弧菌引物0.5μl、最終濃度為0.16μmol/L～0.8μmol/L的副溶血弧菌引物0.5μl，用滅菌去離子水定容。
3.如權(quán)利要求2所述的一種海洋弧菌的多重PCR反應(yīng)試劑盒，其特征在于溶藻弧菌引物的最終濃度為0.4μmol/L、哈維氏弧菌引物的最終濃度為0.4μmol/L、副溶血弧菌引物的最終濃度為0.4μmol/L。
4.一種海洋弧菌的檢測(cè)方法，包括采集和提取海洋弧菌的DNA的樣品模板，將樣品模板加入到多重PCR反應(yīng)試劑盒中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)后得到成像結(jié)果，所述的多重PCR反應(yīng)試劑盒包括PCR反應(yīng)液，所述的PCR反應(yīng)液由10×PCR反應(yīng)緩沖液、dNTP、Hot star Taq酶、致病菌種的DNA引物和滅菌離子水配制而成，其特征在于所述的致病菌種的DNA引物為下述三種弧菌的DNA引物，即溶藻弧菌的DNA引物上游引物為5’-cga gta cag tca ctt gaa agc c-3’，下游引物為5’-cac aac aga act cgc gtt acc-3’，哈維氏弧菌的DNA引物上游引物為5’-gaa gca gca ctc acc gat-3’，下游引物為5’-ggt gaa gac tca tca gca-3’，副溶血弧菌的DNA引物上游引物為5’-gaa agt tga aca tca tca gca cga-3’，下游引物為5’-ggt cag aat caa acg ccg-3。
5.如權(quán)利要求4所述的一種海洋弧菌的檢測(cè)方法，其特征在于擴(kuò)增反應(yīng)的PCR循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s、54℃退火30s、68℃延伸1min20s，進(jìn)行4個(gè)循環(huán)后，退火溫度降低2℃，退火溫度每降低2℃后再進(jìn)行4個(gè)循環(huán)，到退火溫度降到48℃時(shí)，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)，然后在68℃溫度下延伸7min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海洋弧菌的多重PCR反應(yīng)試劑盒及其檢測(cè)方法，包括PCR反應(yīng)液，PCR反應(yīng)液由10×PCR反應(yīng)緩沖液(含Mg
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101067155SQ20071006921
公開日2007年11月7日 申請(qǐng)日期2007年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月5日
發(fā)明者王國(guó)良, 祝璟琳, 金珊 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)