專利名稱：：一種培育低咖啡因茶樹的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種轉(zhuǎn)基因培育低咖啡因茶樹的方法。
背景技術(shù)：
：茶葉具有良好的保健功能，其中主要功能成分是茶多酚(兒茶素類化合物)。但茶葉中同時含3-5%的咖啡因?？Х纫蚴且环N嘌呤生物堿，化學(xué)名稱為1,3，7-三甲基黃嘌呤。盡管咖啡因?qū)θ梭w的長期影響尚不明確，但其短期副作用已越來越受到人們的重視，這些副作用包括引起心悸、胃腸失調(diào)、焦慮、震顫、.血壓升高和失眠等。通常一杯咖啡(150ml)含咖啡因50-70mg，一杯茶(150ml)含咖啡因40~80mg，而對咖啡因敏感的人攝取10mg就會引起不適癥狀。所以，低咖啡因的茶葉日益受到消費(fèi)者的歡迎。利用工業(yè)方法生產(chǎn)低咖啡因茶，不僅成本過高，而且導(dǎo)致滋味和香氣的損失。因此，研究生物技術(shù)和育種途徑培育低咖啡因茶樹用于生產(chǎn)低咖啡因茶產(chǎn)品具有重要意義和商業(yè)前景。目前培育低咖啡因茶樹的方法，主要是從現(xiàn)有的茶樹品種資源中進(jìn)行篩選，但由于現(xiàn)有茶樹資源有限以及已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的個別低咖啡因茶樹由于生長緩慢、產(chǎn)量低或感官品質(zhì)沒有達(dá)到生產(chǎn)的要求。所以至今還沒有低咖啡因茶樹品種在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明的目的是利用現(xiàn)有的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)茶樹品種，通過轉(zhuǎn)基因手段，抑制與咖啡因生物合成相關(guān)的基因的表達(dá)，從而降低茶葉咖啡因的含量。本發(fā)明提供一種通過轉(zhuǎn)基因手段培育低咖啡因茶樹的方法。為達(dá)到以上目的，是通過這樣的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的第一步茶樹甲基轉(zhuǎn)移酶(TCS)雙鏈干涉基因表達(dá)載體的構(gòu)建；第二步TCS雙鏈干涉基因遺傳轉(zhuǎn)化；第三步轉(zhuǎn)化植株培養(yǎng)。茶樹體內(nèi)咖啡因的生物合成途徑中最初嘌呤化合物是黃嘌呤核苷，從黃嘌呤核苷生物合成咖啡因的主要途徑是黃嘌呤核苷—7-甲基黃嘌呤核苷—7-甲基黃嘌呤—可可堿—咖啡因。其中第1，3和4步是甲基化反應(yīng)。甲基化反應(yīng)需要的甲基供體為S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，催化甲基轉(zhuǎn)移的酶是TCS，即TCS將甲基由SAM轉(zhuǎn)移給黃嘌呤核苷的1、3、7相應(yīng)位置上，最后形成咖啡因。TCS基因是控制TCS酶合成及其活力的關(guān)鍵因素，通過轉(zhuǎn)基因手段抑制TCS基因的表達(dá)將可以有效地降低TCS酶的活力，進(jìn)而降低茶葉咖啡因生物合成及其含量。圖1為轉(zhuǎn)基因茶樹咖啡因含量與對照植株一福鼎大白茶比較圖。其中A、B、C、D為使用本發(fā)明方法的轉(zhuǎn)基因培育植株，F(xiàn)D為對照植株一福鼎大白茶?？v座標(biāo)的咖啡因含量以每克鮮重(FW)中所含咖啡因量毫克表示。圖2為RT-PCR擴(kuò)增出TCS基因片段電泳圖。圖中1:DNAmarker(GeneRuler50bpDNAladder,上海生工生物工程有限公司)；2:TCS02;3:TCS03。圖3為Ac/和Swa/雙酶切T-TCS02、T-TCS03(A)和pFGC5941(來自美國俄咳俄州立大學(xué)擬南芥生物資源中心)(B)電泳圖。A:泳道1:DNAmarker(GeneRuler50bpDNAladder);泳道2:爿"/和Swa/雙酶切T-TCS02;泳道3:Ac/和Sw"/雙酶切T-TCS02;B:泳道l:質(zhì)粒pFGC5941;泳道2:Ac/和Swa/雙酶切pFGC5941;泳道3:DNAmarker。圖4為pFGC5941-TCS02(l)andpFGC5941-TCS03(l)的特異性引物PCR驗(yàn)證電泳圖。泳道l:DNAmarker(GeneRulerDNAladderMix);泳道24:pFGC5941-TCS02(1)的陽性克??；泳道59:pFGC5941-TCS03(1)的陽性克隆。圖5為pFGC5941-TCS02(1)andpFGC5941-TCS03(l)的通用引物PG02的PCR驗(yàn)證電泳圖。泳道l:DNAmarker(GeneRulerDNAladderMix);泳道2:pFGC5941(對照質(zhì)粒)；泳道35:pFGC5941-TCS02(l)的陽性克?。挥镜?~10:pFGC5941-TCS03(1)的陽性克隆。圖6為力a/禾BBaw///雙酶切T-TCS02禾flT-TCS03電泳圖。泳道1:DNAmarker(GeneRuler50bpDNAladder);泳道2:力a/和Saw///雙酶切T-TCS02;泳道3:J^a/和Saw///雙酶切T-TCS03。圖7為pFGC5941-TCS02(A)和pFGC5941-TCS03(B)的通用引物PG01的PCR驗(yàn)證電泳圖。PG01泳道1:DNAmarker(GeneRulerDNAladderMix);A:泳道2,4,5,78:假陽性克?。挥镜?，6:pFGC5941-TCS02陽性克??；B:泳道2~7，9:假陽性克??；泳道8:pFGC5941-TCS03陽性克隆。圖8為pFGC5941-TCS02禾卩pFGC5941-TCS03導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌的PCR驗(yàn)證電泳圖。泳道1:DNAmarker(GeneRuler50bpDNAladder);泳道2:pFGC5941導(dǎo)入Arfe-zogew^15834;泳道3~5:pFGC5941-TCS02導(dǎo)入AWz/zoge"^15834;泳道67:pFGC5941陽TCS03導(dǎo)入Artog面15834。具體實(shí)施例方式1.TCS基因片段克隆和RNAi干涉載體(PFGC5941-TCS*PCR-TG1)構(gòu)建1)TCS基因片段克隆用TRIzo產(chǎn)試劑(InvitrogenLifeTechnologies)提取茶樹(福鼎大白茶)嫩芽總RNA和第一鏈cDNA合成試劑盒(BioBasicInc.)合成cDNA第一鏈。然后用兩對自行設(shè)計的特異性引物TCS02和TCS03(表1)擴(kuò)增TCS獲得基因片段，上游引物5'端包含限制性內(nèi)切酶Wal與Ad的酶切位點(diǎn)(TCTAGA和GGCGCGCC)和兩個保護(hù)堿基(AA)，下游引物5'端包含BawM與Svral的酶切位點(diǎn)(GGATCC禾aATTTAAAT)和兩個保護(hù)堿基(AA)。表1下劃線處為酶切位點(diǎn)。25piPCR反應(yīng)體系為ddH2019.5pi,10xPCR反應(yīng)緩沖液2.5nl,25mMMgCl21.5^1，10mMdNTPs0.5上下游引物各0.25pl，TaqDNA聚合酶(BioBasicInc.)0.4^(2個單位)，cDNA0.5|i。PCR反應(yīng)的程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min,然后進(jìn)入以下循環(huán)94。C變性50s，退火lmin，72'C延伸90s，35個循環(huán)結(jié)束后繼續(xù)72'C延伸10min。1%瓊脂糖電泳檢測(圖2)。表1TCS基因克隆的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2)茶樹TCS基因RNAi干涉載體的構(gòu)建T-TCS02和T-TCS03經(jīng)Ac/和Swa/f來自大連寶生生物工程有限公司)雙酶切獲得了TCS基因的目的條帶(圖3A泳道2和泳道3)。干涉載體質(zhì)粒pFGC5941(圖3B泳道O經(jīng)和^m/雙酶切，形成一條線性質(zhì)粒DNA條帶(圖3B泳道2)。回收目的條帶和pFGC5941(來自美國俄咳俄州立大學(xué)擬南芥生物資源中心)的線性質(zhì)粒DNA條帶(圖3B泳道2)、純化、連接和轉(zhuǎn)化，TCS基因的PCR片段插入到pFGC5941中，分別命名為pFGC5941-TCS02(1)禾口pFGC5941-TCS03(1)(其中"1"代表PCR片段第一次次插入pFGC5941中)，分別用特異性引物(圖4)和通用引物PG02(圖5)進(jìn)行PCR鑒定。在圖5中可以看出對照質(zhì)粒用通用引物PG02擴(kuò)增的片段為大約280bp(圖5,泳道l),而陽性克隆由于插入了659bp(TCS02)和525bp(TCS03)的片段，所以擴(kuò)增出約1000bp(圖5，泳道3~5)和900bp(圖5，泳道6~10)的條帶。T-TCS02和T-TCS03經(jīng)Wa/和5am///(來自大連寶生生物工程有限公司)雙酶切獲得了TCS基因的目的條帶(圖6泳道2和泳道4)。回收目的條帶和pFGC5941TCS02(1)和pFGC5941-TCS03(l)的線性質(zhì)粒DNA條帶、純化、連接和轉(zhuǎn)化，TCS基因的PCR片段反向插入到pFGC5941TCS02(1)和pFGC5941-TCS03(l)中，分別稱為pFGC5941-TCS02(圖7，A泳道3和泳道6)和pFGC5941-TCS03(圖7，B泳道7)。在圖7中可以看出假陽性克隆用通用引物PG01擴(kuò)增的片段為大約280bp(圖7A，泳道2，4，5，7~8和B泳道2~6，9)，而陽性克隆由于插入了659bp(TCS02)和525bp(TCS03)的片段，所以擴(kuò)增出約1000bp(圖7A，泳道3和6)和900bp(圖7A，泳道7)的條帶。3)干涉載體的測序驗(yàn)證與導(dǎo)入發(fā)根農(nóng)桿菌重組質(zhì)粒和對照質(zhì)粒pFGC5941用三親交配法和凍融交替法導(dǎo)入到發(fā)根農(nóng)桿菌15834(來自上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)研究所)中，分別用通用引物PGOl，PG02和ro/C基因引物鑒定證明轉(zhuǎn)化成功(圖8)。圖8中PG01禾卩PG02擴(kuò)增15834-pFGC5941的產(chǎn)物長度約為280bp(PGOl和PG02泳道1)，而15834-pFGC5941-TCS02和15834-pFGC5941-PG03擴(kuò)增長度約為1000bp(PGOl和PG02泳道3~5)禾B900bp(PGOl和PG02泳道6~7)，說明含有插入的目的序列。同時15834-pFGC5941、15834-pFGC5941陽TCS02禾卩15834-pFGC5941-TCS03都擴(kuò)增出w/C基因的片段，說明這些質(zhì)粒己經(jīng)導(dǎo)入到發(fā)根農(nóng)桿菌15834中。2發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因和茶樹遺傳轉(zhuǎn)化1)轉(zhuǎn)化受體制備以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加2.0mg/LBAP、0.5mg/LIBA和2mg/LGA3、30g/L蔗糖和6.8g/L瓊脂。培養(yǎng)基在高壓滅菌前用0.1MNaOH溶液調(diào)pH值為5.8，121'C滅菌15min。冷卻后切取茶樹品種"浙農(nóng)129"和"浙農(nóng)25"的莖段(長度約1cm)接種于培養(yǎng)上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25士2'C，光照強(qiáng)度20001ux，每天光照16h，黑暗8h，每3個月繼代培養(yǎng)一次。以上述培養(yǎng)獲得的無菌苗作為基因轉(zhuǎn)化受體。2)遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化之前將發(fā)根農(nóng)桿菌15834置于含100mg/L利福平的YMB固體培養(yǎng)基上，在28°C黑暗培養(yǎng)活化兩次(每次12h)。挑取單菌落接種于20ml含100mmol/L乙酰丁香酮(AS，上海生工生物工程有限公司)液體YMB培養(yǎng)基中，28°C，250r/min震蕩培養(yǎng)至OD600為0.5-0.8用于侵染。將上述作為轉(zhuǎn)化受體的無菌苗置于發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，侵染10-50min，無菌濾紙吸干多余的菌液，轉(zhuǎn)移于含100mmol/LAS的YMB培養(yǎng)基(共培養(yǎng)培養(yǎng)基)，黑暗共培養(yǎng)2d后，無菌水沖洗3~4次，用1000mg/L頭孢噻肟鈉(上海生工生物工程有限公司)浸泡20min以殺死農(nóng)桿菌，用無菌濾紙吸干材料表面水分，轉(zhuǎn)移于含500mg/L頭孢噻肟鈉的MS培養(yǎng)基(抑菌培養(yǎng)基)。25±2°C，黒暗培養(yǎng)。經(jīng)過10天后，可以發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)出發(fā)狀根。3)轉(zhuǎn)化植株培養(yǎng)將上述具有發(fā)狀根的幼苗轉(zhuǎn)移到在附加0.010.1mg/LIAA的MS培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，使之形成健壯的茶苗。方法同上述"轉(zhuǎn)化受體制備"。6個月后對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行咖啡因含量檢領(lǐng)J，發(fā)現(xiàn)有4個植株的咖啡因含量低于供試的對照福鼎大白茶(FD)，其中植株A的咖啡因含量僅為對照的1/3。試驗(yàn)植株總數(shù)是200個，獲得陽性克隆16個，其中4株咖啡因含量降低50%以下，占比例2%(圖1)。本實(shí)施例由于利用現(xiàn)有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)茶樹品種進(jìn)行改造，可以較好地克服自然界現(xiàn)有低咖啡因茶樹資源在產(chǎn)量和品質(zhì)方面存在的缺陷，容易培育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的低咖啡因茶樹品種。序列表Upper:5，-AATCTAGAGGCGCGCCCAGCGGGTCCAAACTCS02ACAT-3,Lower:5'-AAGGATCCATCTCCACT-3，TTAAATTGATCCGTCCCTCTUoper:5，-AATCTAGAGGCGCGCCGCCCTTCAAAGGCCTCS03TGTCGTCTG-3'Lower:5，-AAGGATCCATCCACTA-3'TTAAATTGATCCGTCCCTCTTCS02Upper:AATCTAGAGGCGCGCCCAGCGGGTCCAAACACAT34Lower:AAGGATCCATTTAAATTGATCCGTCCCTCTCTCCACT37TCS03Upper:AATCTAGAGGCGCGCCGCCCTTCAAAGGCCTGTCGTCTG39Lower:AAGGATCCATTTAAATTGATCCGTCCCTCTCCACTA3權(quán)利要求1、一種培育低咖啡因茶樹的方法，其特征在于構(gòu)建茶樹甲基轉(zhuǎn)移酶(TCS)雙鏈干涉基因表達(dá)載體(PFGC5941-TCS·PCR-TG1)，將TCS雙鏈干涉基因遺傳轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化植株。2、如權(quán)利要求l所述培育低咖啡因茶樹的方法，其特征在于構(gòu)建茶樹甲基轉(zhuǎn)移酶(TCS)雙鏈干涉基因表達(dá)載體(PFGC5941-TCS*PCR-TG1)所用TCS基因來自福鼎大白茶嫩芽，擴(kuò)增TCS基因片段采用了以下序列表達(dá)的兩對特異性引物TCS02和TCS03:TCS02Upper:5，-AA—TCTAGAGGCGCGCCCAGCGGGTCCAAACACAT-3'Lower:5，-AAGGATCCATTTAAATTGATCCGTCCCTCTCTCCACT-3'TCS03Upper:5，-AATCTAGAGGCGCGCCGCCCTTCAAAGGCCTGTCGTCTG-3'Lower:5，-AAGGATCCATTTAAATTGATCCGTCCCTCTCCACTA-3'全文摘要一種培育低咖啡因茶樹的方法，涉及轉(zhuǎn)基因培育低咖啡因茶樹的技術(shù)。包括構(gòu)建茶樹甲基轉(zhuǎn)移酶(TCS)雙鏈干涉基因表達(dá)載體(PFGC5941-TCS·PCR-TG1)，將TCS雙鏈干涉基因遺傳轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化植株。所用TCS基因來自福鼎大白茶嫩芽，擴(kuò)增TCS基因片段采用了以下序列表達(dá)的兩對特異性引物TCS02、TCS03。文檔編號C12N15/82GK101096683SQ20071006913公開日2008年1月2日申請日期2007年5月31日優(yōu)先權(quán)日2007年5月31日發(fā)明者倩葉,張廣輝,杜穎穎,晨林,梁月榮,陸建良申請人:浙江大學(xué)