專利名稱：：一種隱孔菌發(fā)酵工藝的質(zhì)量控制方法一種隱孔菌發(fā)酵工藝的質(zhì)量控制方法(一)
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種隱孔菌發(fā)酵工藝的質(zhì)量控制方法。(二)
背景技術(shù)：
：隱孔菌俗名松橄欖、樹荷苞、樹疙瘩、荷色菌、木魚菌、香木蘭、黑邁子(云南)、一口萆(日本)。屬于真菌界、擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)、層菌綱(Hyme廳ycetes)、非褶目[Aphyllophorales，舊系統(tǒng)作多孑L菌目(Polyporales)]、多孑L菌科(Polyporaceae)、瞎、孑L菌屬(Cryptoporus)。分布于中國的四川、江蘇、浙江、湖北、吉林、云南、海南、福建等省，朝鮮、曰本、歐洲、北美洲也有分布。關(guān)于隱孔菌的藥用價(jià)值早有報(bào)道，藍(lán)茂(1397-1476)《滇南本草》記載味苦、甘，性微寒。治大腸下血，積熱之毒。療(內(nèi)夕卜)九種誇瘡，(附方)治牙齒疼，將松橄欖于疼牙上咬住，疼即止。韓國李氏等人(1981)得到的熱水提取物中的多糖蛋白具有抗癌活性。江蘇省植物研究所等編著(1990)的《新華本草綱目》記載味微苦，性平。有止咳、平喘、解毒等功能。用于治氣管炎、哮喘，還可用于小兒斷奶(云南麗江民間常用)，徐錦堂等編《中國藥用真菌學(xué)》(1997)第三十二章隱孔菌全面記載了隱孔菌的國內(nèi)外的報(bào)道、藥用價(jià)值、形態(tài)結(jié)構(gòu)、生活習(xí)性、生活史、生活條件、培養(yǎng)技術(shù)等。關(guān)于隱孔菌的人工栽培未見報(bào)道，但華啟洪等對(duì)隱孔菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行了研究，并申請(qǐng)了中國專利(申請(qǐng)?zhí)?4117227.9)，而后杭州泰士生物技術(shù)有限公司對(duì)隱孔菌的液體發(fā)酵技術(shù)和藥用價(jià)值進(jìn)行了進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)隱孔菌的液體發(fā)酵物對(duì)過敏性哮喘和過敏性鼻炎有很好的療效，并申請(qǐng)了中國專利(申請(qǐng)?zhí)朑1126498.5)。此后柯傳奎等發(fā)現(xiàn)隱孔菌多糖是隱孔菌發(fā)酵產(chǎn)物的主要活性成分，對(duì)過敏性哮喘和成人型呼吸窘迫綜合征等有好的效果，申請(qǐng)了專利(申請(qǐng)?zhí)?00510060463.8)。關(guān)于隱孔菌的化學(xué)成分也有報(bào)道華啟洪、金國梁等《中國藥學(xué)雜志》1993.28(2):P75~76報(bào)道了隱孔菌19種揮發(fā)油成分研究；華啟洪、金國梁等《植物資源與環(huán)境》1993.2(1):P60-61報(bào)道了隱孔菌糖、氨基酸、微量元素等化學(xué)成分研究；馬偉光等《云南植物研究》1994.I6(2):PW6-:20()報(bào)道了從野生隱孔菌中分離的四個(gè)麥角甾醇類化合物；吳錦忠、黃年來《福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)》1997.7(2)P21-26報(bào)道了隱孔菌發(fā)酵培養(yǎng)物和野生隱孔菌中氨基酸、糖類和水提取物、乙醇提取物、石油醚提取物之間的薄層分析結(jié)果比較。ShinichiKitamura等在CarbohydrateResearch263(1994)111-121報(bào)道從隱孔菌中提取出來一種多糖有抗腫瘤活性。Xiao-yanZHAO等在ActaPharmacolSin2004Apr,25(4):503-507中報(bào)道從隱孔菌發(fā)酵產(chǎn)物中提取的多糖具有抑制氣道高反應(yīng)性的作用。周建倉等在中國藥理學(xué)通報(bào)2002apr:18(2):1"~1"中報(bào)道從隱孔菌發(fā)酵產(chǎn)物中提取的多糖有抑制肺組織釋放白三烯和抗變態(tài)反應(yīng)作用。目前天然的隱孔菌已經(jīng)極少，人工隱孔菌發(fā)酵過程主要通過常規(guī)理化指標(biāo)測(cè)定控制，而多篇文獻(xiàn)報(bào)道多糖是隱孔菌的主要活性成分，因此對(duì)發(fā)酵過程及終產(chǎn)品的多糖測(cè)定就顯的十分必要，本發(fā)明就是提供了一個(gè)對(duì)多糖控制的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明既是為了提供一種隱孔菌發(fā)酵工藝的質(zhì)量控制方法，通過對(duì)發(fā)酵過程多糖和終產(chǎn)物多糖的單糖組成變化控制產(chǎn)品的質(zhì)量。為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是量取發(fā)酵中間產(chǎn)物200ml,過濾，得到菌絲體和發(fā)酵液。將發(fā)酵液濃縮至20ml，加無水乙醇80ml，邊加邊攪拌，放置1小時(shí)待沉淀完全后過濾，沉淀干燥后即得粗多糖。取粗多糖約O.02g，加入2M的H2S042ml,密封，混勻溶解，于125。C烘箱中反應(yīng)1小時(shí)，放至室溫，3500r/min離心IO分鐘，上清用損的NaOH調(diào)溶液pH至7.0。水解液1.Oml,加入1.Oml的NaOH(0.3M)和1.Oml的PMP甲醇溶液(0.5M)于水解管中，混勻，密封，于70。C水浴中反應(yīng)30min，取出放冷至室溫，用HC1調(diào)pH至7.0，加入2ml氯仿萃取，振搖，3500rpm/min離心10分鐘，反復(fù)萃取3次，水層過0.45um膜即可。將過膜后的濾液注入液相色鐠儀分析單糖的種類和比例。液相條件為紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長250nm,SB-C8反相色語柱，流動(dòng)相磷酸鹽緩沖液(pH5.8):乙睛=80:20，流速lml/min?；蛘叻Q取隱孔菌菌絲體5g，加水編超聲提取1小時(shí)，3500r/min離心10分鐘，上清濃縮至10ml，加無水乙醇40ml，邊加邊撹拌，放置1小時(shí)待沉淀完全后過濾，沉淀干燥后即得粗多糖。取粗多糖約0.02g，加入2M的三氟乙酸2ml，密封混勻，于于125。C烘箱中反應(yīng)1小時(shí)，放至室溫，在氮?dú)饬飨麓蹈伤庖?。加入lml甲醇，混勻后在氮?dú)饬飨麓蹈伞４蹈珊蟮臉悠芳尤胝麴s水lml，硼氫化鈉粉末25mg，混勻反應(yīng)2小時(shí)。滴入醋酸中止反應(yīng)至無氣泡為止。在氮?dú)饬飨麓蹈煞磻?yīng)液，加0.1%(V/V)的鹽酸-曱醇2ml，混勻，氮?dú)獯蹈?，重?fù)3次。剩余物105。C烘箱加熱1小時(shí)除去水分。加入0.5ml吡啶和0.5ml醋酸酐，封管后在沸水浴中反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行氣相色譜分析單糖組成。所述隱孔菌發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單流程為配制培養(yǎng)基—接種—發(fā)酵培養(yǎng)-發(fā)酵中間產(chǎn)物—發(fā)酵結(jié)束—菌絲體和發(fā)酵外液分離—分別干燥得到隱孔菌菌絲體粉和隱孔菌發(fā)酵液粉。或者發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵產(chǎn)物不進(jìn)行分離直接干燥得隱孔菌發(fā)酵物粉。所述隱孔菌發(fā)酵中間產(chǎn)物指的是在隱孔菌發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的菌絲體和不含菌絲體的發(fā)酵外液。在不同的發(fā)酵時(shí)間取樣得到不同發(fā)酵時(shí)間的隱孔菌發(fā)酵中間產(chǎn)物。所述隱孔菌發(fā)酵物粉指的是隱孔菌發(fā)酵完畢后將發(fā)酵產(chǎn)物不進(jìn)行分離即隱孔菌菌絲體和發(fā)酵外液混合干燥得到的產(chǎn)物。所述隱孔菌多糖可由如下方法制備得到將隱孔菌菌絲體粉力口適量水提取，水提液濃縮后加入4倍體積的乙醇沉淀，離心得到沉淀，干燥即為粗多糖。將隱孔菌發(fā)酵液適當(dāng)濃縮后加入4倍體積的乙醇沉淀，離心得到沉淀，干燥即為粗多糖。取隱孔菌發(fā)酵液粉加適量水溶解后加5倍體積的乙醇沉淀，離心得到沉淀干燥即為粗多糖。取隱孔菌發(fā)酵物粉加適量水溶解后加5倍體積的乙醇沉淀，離心得到沉淀干燥即為粗多糖。上述方法中，所述的測(cè)定多糖的單糖組成的方法可以有很多種，比如高效液相法、氣相法、薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法等等。在發(fā)酵過程中，測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液中的隱孔菌多糖，結(jié)果表明變化很有規(guī)律(見附圖)。在0h的時(shí)候發(fā)酵液多糖主要由培養(yǎng)基貢獻(xiàn)，單糖組成主要是葡萄糖，發(fā)酵開始以后隱孔菌的生長開始消耗培養(yǎng)基多糖并向發(fā)酵液中分泌自身合成的多糖，導(dǎo)致發(fā)酵液中的多糖的單糖組成有規(guī)律的變化，多糖中甘露糖和半乳糖的百分含量顯著增加。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到一定時(shí)間后，發(fā)酵液中的多糖的單糖組成趨向穩(wěn)定。發(fā)酵液中多糖的單糖變化規(guī)律給發(fā)酵終點(diǎn)判斷提供了依據(jù)，可以作為發(fā)酵工藝主要的控制指標(biāo)之一。結(jié)合發(fā)酵工藝的其它指標(biāo)可以更好的控制發(fā)酵過程。本發(fā)明所述的控制隱孔菌發(fā)酵工藝質(zhì)量的有益效果主要體現(xiàn)在(1)本發(fā)明所述的測(cè)定方法可以反應(yīng)出不同發(fā)酵時(shí)間隱孔菌發(fā)酵液多糖的單糖組成變化，為確定發(fā)酵終點(diǎn)提供參考(實(shí)施例4表1)。(2)本方法對(duì)隱孔菌菌絲體多糖的單糖組成分析可以用來作為產(chǎn)品的鑒別標(biāo)準(zhǔn)(實(shí)施例5表2)。(四)附圖隱孔菌發(fā)酵液多糖的單糖組成隨發(fā)酵時(shí)間變化具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不l又限于此實(shí)施例1:隱孔菌菌絲體多糖的單糖組成測(cè)定稱取隱孔菌菌絲體粉5g,加水40ml超聲提取1小時(shí)，3500r/min離心10分鐘，上清濃縮至10ml，加無水乙醇40ml，邊加邊攪拌，放置1小時(shí)待沉淀完全后過濾，沉淀干燥后即得粗多糖。取粗多糖約0.02g，加入2M的三氟乙酸2ml,密封混勻，于125。C烘箱中反應(yīng)1小時(shí)，放至室溫，在氮?dú)饬飨麓蹈伤庖?。加入lml曱醇，混勻后在氮?dú)饬飨麓蹈伞４蹈珊蟮臉悠芳尤胝麴s水lml，硼氫化鈉粉末25mg,混勻反應(yīng)2小時(shí)。滴入醋酸中止反應(yīng)至無氣泡為止。在氮?dú)饬飨麓蹈煞磻?yīng)液，加O.1%(V/V)的鹽酸-曱醇2ml，混勻，氮?dú)獯蹈桑貜?fù)3次。剩余物105。C烘箱加熱1小時(shí)除去水分。加入0.5ml吡啶和0.5ml醋酸肝，封管后在沸水浴中反應(yīng)l小時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行氣相色譜分析單糖組成。1。/。0V-2"填充柱(2mx0.3cm),進(jìn)樣器和檢測(cè)器(FID)均為250。C;柱溫195°C;H230mL/min;空氣200mL/min;載氣為高純N2:10mL/min;進(jìn)樣量0.6iaL。實(shí)施例2:隱孔菌菌絲體多糖的單糖組成測(cè)定量取發(fā)酵中間產(chǎn)物200ml，過濾，得到菌絲體和發(fā)酵液。將菌絲體加水200ml,混勻后過濾，濾々并加水100ml煮沸1小時(shí)，過濾，濾液濃縮至20ml，加無水乙醇80ml，邊加邊攪拌，放置1小時(shí)待沉淀完全后過濾，沉淀干燥后即得粗多糖。取粗多糖約0.02g，加入2M的H2S042ml，密封，混勻溶解，于125。C烘箱中反應(yīng)l小時(shí)，放至室溫，3500r/min離心IO分鐘，上清用4M的NaOH調(diào)溶液pH至7.0。水解液1.Oml，加入1.Oml的NaOH(0.3M)和1.Oml的PMP甲醇溶液(0.5M)于水解管中，混勻，密封，于70。C水浴中反應(yīng)30min，取出放冷至室溫，用HC1調(diào)pH至7.0，加入2ml氯仿萃取，振搖，3500rpm/min離心10分鐘，反復(fù)萃取3次，水層過0.45um膜即可。將過膜后的濾液注入液相色鐠儀分析單糖的種類和比例。液相條件為紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長250nm，SB-C8反相色譜柱，流動(dòng)相磷酸鹽緩沖液(pH5.8):乙睛=80:20,流速lml/min。實(shí)施例3:隱孔菌發(fā)酵液多糖的單糖組成測(cè)定量取發(fā)酵中間產(chǎn)物200ml,過濾，得到菌絲體和發(fā)酵液。將發(fā)酵液濃縮至20ml,加無水乙醇80ml，邊加邊攪拌，放置1小時(shí)待沉淀完全后過濾，沉淀干燥后即得粗多糖。取粗多糖約O.02g,加入2M的H2S042ml，密封，混勻溶解，于125。C烘箱中反應(yīng)1小時(shí)，放至室溫，3500r/min離心IO分鐘，上清用4M的NaOH調(diào)溶液pH至7.0。水解液1.Oml，加入1.Oml的NaOH(0.3M)和1.Oml的PMP曱醇溶液(0.5M)于水解管中，混勻，密封，于7(TC水浴中反應(yīng)30min，取出放冷至室溫，用HC1調(diào)pH至7.0，加入2ml氯仿萃取，振搖，3500rpm/min離心10分鐘，反復(fù)萃取3次，水層過0.45um膜即可。將過膜后的濾液注入液相色譜儀分析單糖的種類和比例。液相條件為紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長250nm，SB-C8反相色躲，流動(dòng)相磷酸鹽緩沖液(pH5.8):乙睛-80:20，流速lml/min。實(shí)施例4:不同發(fā)酵時(shí)間隱孔菌發(fā)酵液多糖的單糖組成測(cè)定從發(fā)酵開始(Oh)至發(fā)酵終點(diǎn)U09h)間隔一定時(shí)間分別取樣，按照實(shí)施例3中的方法分離發(fā)酵液并對(duì)發(fā)酵液中多糖的單糖組成進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明發(fā)酵液多糖的單糖組成呈一定規(guī)律變化，如下表1和說明書附圖表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)施例5:不同發(fā)酵產(chǎn)品中提取的多糖的單糖組成分析分別稱取發(fā)酵烏靈菌粉、發(fā)酵蟲草菌粉、隱孔菌菌絲體粉、發(fā)酵蟲草頭孢菌粉、發(fā)酵豬苓菌粉和發(fā)酵擬青霉菌粉各5g，加水40ml回流提取1小時(shí)，3500r/min離心IO分鐘，上清濃縮至10ml，加無水乙醇40ml，邊加邊攪拌，》文置1小時(shí)待沉淀完全后過濾，沉淀干燥后即得粗多糖。各粗多糖樣品按照實(shí)施例2中的方法測(cè)定單糖組成，結(jié)果表明發(fā)酵隱孔菌菌粉多糖的單糖組成與其他幾種發(fā)酵產(chǎn)品有顯著的區(qū)別，如下表2:表2<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權(quán)利要求1、一種隱孔菌發(fā)酵工藝的質(zhì)量控制方法，其特征在于量取發(fā)酵中間產(chǎn)物200ml，過濾，得到菌絲體和發(fā)酵液，將發(fā)酵液濃縮得到濃縮液20ml，冷卻到室溫，濃縮液加無水乙醇80ml，邊加邊攪拌，放置1小時(shí)待沉淀完全后過濾，沉淀干燥后即得粗多糖A；稱取隱孔菌菌絲體粉、隱孔菌發(fā)酵液粉和隱孔菌發(fā)酵物粉各5g，分別加水40ml超聲提取1小時(shí)，3500r/min離心10分鐘，上清濃縮得到10ml濃縮液，冷卻到室溫，加無水乙醇40ml，邊加邊攪拌，放置1小時(shí)待沉淀完全后過濾，沉淀干燥后即得粗多糖B、C和D，取粗多糖A、B、C和D各約0.02g，分別加入2mol/L的H2SO4溶液2ml，密封，混勻溶解，于125℃反應(yīng)1小時(shí)，放至室溫，3500r/min離心10分鐘，上清用4mol/L的NaOH水溶液調(diào)pH至7.0，量取此水解液1.0ml于水解管中，加入0.3mol/LNaOH水溶液和0.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液各1.0ml，混勻，密封，于70℃水浴中反應(yīng)30min，取出放冷至室溫，用鹽酸調(diào)pH至7.0，加入2ml氯仿萃取，反復(fù)3次，水層用0.45um膜濾過，將過膜后的濾液注入液相色譜儀分析，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖判斷單糖的種類和比例；液相條件為紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長250nm，SB-C8反相色譜柱，流動(dòng)相為pH5.8的磷酸鹽緩沖液和乙睛以體積比80∶20組成，流速1ml/min；多糖A的單糖組成可以作為發(fā)酵控制指標(biāo)；多糖B、多糖C和多糖D的單糖組成可以分別作為隱孔菌菌絲體粉、隱孔菌發(fā)酵液粉和隱孔菌發(fā)酵物粉的質(zhì)量控制指標(biāo)。2、如權(quán)利要求1所述的一種隱孔菌發(fā)酵工藝的質(zhì)量控制方法，其特征在于隱孔菌菌絲體粉和隱孔菌發(fā)酵液粉加水提取可采用超聲提取，也可以采用回流提取、索氏提取和浸漬提取等方法。3、如權(quán)利要求1所述的一種隱孔菌發(fā)酵工藝的質(zhì)量控制方法，其特征在于粗多糖的水解可以選擇有機(jī)酸如三氟乙酸，三氯乙酸等，也可以選擇無機(jī)酸如硫酸，鹽酸等，也可以選擇酶試劑如混合非淀4分多糖水解酶，復(fù)合酶及其它酶類。4、如權(quán)利要求1所述的一種隱孔菌發(fā)酵工藝的質(zhì)量控制方法，其特征在于測(cè)定粗多糖的單糖組成的方法可以采用高效液相法也可以采用氣相色譜法、薄層色語法、毛細(xì)管電泳法等方法。5、如權(quán)利要求1所述的一種隱孔菌發(fā)酵工藝的質(zhì)量控制方法，其特征在于隱孔菌菌絲體粉、隱孔菌發(fā)酵液粉和隱孔菌發(fā)酵物粉可以用自身的多糖的單糖組成作為質(zhì)量控制指標(biāo)，隱孔菌發(fā)酵過程可以用隱孔菌發(fā)酵液中的多糖的單糖組成作為指標(biāo)。6、如權(quán)利要求1所述的隱孔菌發(fā)酵液中多糖的單糖組成作為發(fā)酵質(zhì)控指標(biāo)在發(fā)酵過程中的應(yīng)用。7、如權(quán)利要求l所述的隱孔菌菌絲體粉、隱孔菌發(fā)酵液粉和隱孔菌發(fā)酵物粉多糖的單糖組成在隱孔菌菌絲體粉、隱孔菌發(fā)酵液粉和隱孔菌發(fā)酵物粉鑒別和質(zhì)量控制中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提出了一種質(zhì)量控制方法，可以用于隱孔菌發(fā)酵過程及發(fā)酵終產(chǎn)品質(zhì)量控制。方法的主要特征是取隱孔菌發(fā)酵液或者發(fā)酵終產(chǎn)物隱孔菌菌絲體粉、隱孔菌發(fā)酵液粉，隱孔菌發(fā)酵物粉中的一種，加水適量提取，分離得到提取液，加乙醇至80％，分離得到粗多糖。分析粗多糖的單糖種類和比例，以此判斷發(fā)酵的終點(diǎn)和鑒別終產(chǎn)品的質(zhì)量。本方法的專一性強(qiáng)，能較好的體現(xiàn)出隱孔菌發(fā)酵過程中糖類物質(zhì)組成的變化，終產(chǎn)品中多糖的單糖組成和同類其他發(fā)酵產(chǎn)品相比有比較顯著的區(qū)別，為隱孔菌發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量控制提供了方法和依據(jù)。文檔編號(hào)C12N1/14GK101109007SQ20071006919公開日2008年1月23日申請(qǐng)日期2007年6月12日優(yōu)先權(quán)日2007年6月12日發(fā)明者萍張,李艷偉,楊勇杰,柯傳奎,柴黎燕,歐陽小軍申請(qǐng)人:柯傳奎;楊勇杰