專利名稱：昆蟲β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及昆蟲β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因序列及其dsRNA的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在我國長(zhǎng)期施用有機(jī)氯、有機(jī)磷等化學(xué)殺蟲劑防治害蟲，導(dǎo)致一系列問題農(nóng)藥殘留導(dǎo)致農(nóng)業(yè)環(huán)境污染；昆蟲出現(xiàn)抗藥性，防治成本提高；有毒農(nóng)藥危害人類身體健康等。目前已有將生物殺蟲劑應(yīng)用于害蟲防治，但往往作用時(shí)間較長(zhǎng)，效果緩慢。為更為有效地進(jìn)行植物保護(hù)，迫切需要研發(fā)新型的害蟲防治方法。RNA干擾(RNAi)是一種通常由雙鏈RNA分子引起的特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，于2006年獲得諾貝爾獎(jiǎng)。這一發(fā)現(xiàn)不僅是基因功能研究方法上的突破，同時(shí)也為人類的疾 病治療和作物害蟲防治開辟了新的途徑。2008年，Price和Gatehouse總結(jié)了眾多研究結(jié)果后，提出了基于RNAi的害蟲防治策略。基于RNA干擾技術(shù)的害蟲防治具有如下優(yōu)勢(shì)1)選擇對(duì)害蟲專一的基因進(jìn)行干擾，對(duì)高等動(dòng)物和和人類是安全的；2)防治害蟲具有專一性，對(duì)非靶標(biāo)生物無殺傷作用；3)對(duì)環(huán)境無毒無害。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種昆蟲β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因及其dsRNA在致死害蟲中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO
I。該序列是通過對(duì)飛蝗EST數(shù)據(jù)庫的搜索，得到17條飛蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因基因片段，通過序列拼接和比對(duì)后，進(jìn)一步克隆獲得。該序列長(zhǎng)2667bp，包含1845bp開放閱讀框。本發(fā)明提供的一種昆蟲β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因，其核苷酸序列是SEQ IDNO :2，是根據(jù)SEQ ID NO :1設(shè)計(jì)上游引物SEQ ID NO :3和下游引物SEQ ID NO :4，通過PCR擴(kuò)增獲得SEQ ID Ν0:2，其含有Τ7啟動(dòng)子。進(jìn)一步利用試劑盒合成dsRNA。所述dsRNA是用上游引物SEQ ID NO 3和下游引物SEQ ID NO 4合成PCR產(chǎn)物，經(jīng)Wizardrft'SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)試劑盒純化后按照 T7RiboMAXTMExpress RNAi System (Promega)試劑盒說明體外轉(zhuǎn)錄合成。SEQ ID NO 2合成的dsRNA在致死害蟲中的應(yīng)用注射上述dsRNA到昆蟲體腔，結(jié)果表明SEQ ID NO 2合成的dsRNA可以特異性地沉默β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因LmNAGl的mRNA表達(dá)，并導(dǎo)致飛蝗蛻皮困難而死亡。


圖I :2齡飛蝗注射SEQ ID NO :2合成的dsRNA后出現(xiàn)蛻皮困難而死亡的表型。A為注射dsGFP的對(duì)照，B為注射SEQ ID NO 2合成的dsRNA。
圖2 :5齡飛蝗注射SEQ ID NO :2合成的dsRNA后出現(xiàn)蛻皮困難而死亡的表型。A為注射dsGFP的對(duì)照，B為注射SEQ ID NO 2合成的dsRNA。圖3 :飛蝗注射SEQ ID NO 2合成的dsRNA后飛蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因LmNAGl的不同時(shí)間點(diǎn)mRNA表達(dá)，β-actin做為內(nèi)參基因。24，48，72為注射dsRNA后的小時(shí)數(shù)。**P〈0. 01。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :飛蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因片段及其dsRNA的獲得I、飛蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因片段的獲得I)飛蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因在飛蝗表達(dá)序列標(biāo)簽EST數(shù)據(jù)庫的搜索
基于飛蝗的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)數(shù)據(jù)庫，采用生物信息學(xué)方法對(duì)飛蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因進(jìn)行搜索，經(jīng)過序列分析及比對(duì)后，共獲得17條飛蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因片段。經(jīng)拼接后，獲得的飛蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因(LmNAGl)序列全長(zhǎng)2667bp,開放閱讀框1845bp。2)飛蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因引物的設(shè)計(jì)基于已獲得LmNAGl的堿基序列,采用primer premier5. O軟件設(shè)計(jì)引物。所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成。3)飛蝗總RNA獲得選取大小一致雌雄各半飛蝗5齡若蟲，四頭一組，冷凍于液氮中，待提取RNA，具體操作步驟參照TaKaRa Trizol試劑盒。4)第一鏈cDNA的合成 參照M-MLV反轉(zhuǎn)錄TaKaRa試劑說明書，進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。5)飛蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因序列的獲得根據(jù)天根MasterMix說明書進(jìn)行PCR，進(jìn)一步克隆獲得的飛蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因。6)飛蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因堿基序列的分析利用Expasy網(wǎng)站中相關(guān)在線軟件和GENED0C、基因探索者等軟件分析所得序列，之后在NCBI網(wǎng)站中使用BLAST功能進(jìn)行序列同源性比對(duì)。2、飛蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因dsRNA合成I)飛蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因dsRNA引物的設(shè)計(jì)基于本研究所得到飛蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因的序列SEQ ID NO :1，采用primer premier5. O軟件設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)dsRNA引物,其序列分別為SEQ ID NO :3和SEQ IDNO :4。所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成。2)飛蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因dsRNA的合成上述dsRNA 引物合成 PCR 產(chǎn)物，經(jīng)Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)試劑盒純化后按照 T7RiboMAXTM Express RNAi System(Promega)試劑盒說明體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA。dsRNA濃度采用酶標(biāo)儀SpectraMax 190測(cè)定,并濃縮至終濃度為3 μ g/μ I。實(shí)施例2 :飛蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因dsRNA致死2齡飛蝗
I、飛蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因dsRNA注射將I μ I (3 μ g)SEQ ID NO :2的dsRNA用25 μ I規(guī)格微量注射器注射到2齡飛蝗第2日齡若蟲二、三腹節(jié)之間，共注射30只，雌雄各半。注射相同體積濃度的dsGFP至對(duì)照組體內(nèi)。將注射后飛蝗置于28°C恒溫生化培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。2、注入dsRNA后2齡飛蝗表型的觀察2齡若蟲經(jīng)注射dsRNA后，注射dsGFP對(duì)照組3天后開始蛻皮并全部成功蛻至三齡，平均蛻皮時(shí)間為15-20分鐘，蛻至三齡后蟲體形態(tài)活力正常，并于半天后開始正常進(jìn)食。注射dsLmNAGl的處理組若蟲共30頭，與對(duì)照組若蟲相比均出現(xiàn)延遲I天蛻皮的現(xiàn)象，并且蛻皮過程的持續(xù)時(shí)間均>lh，其中有9頭若蟲最終不能完成蛻皮導(dǎo)致死亡，能夠蛻至三齡的處理組若蟲蛻皮后出現(xiàn)身體柔軟、活力不足、進(jìn)食量減少等現(xiàn)象。當(dāng)三齡若蟲蛻至四齡時(shí)，對(duì)照組蟲體仍然能夠正常順利地完成蛻皮，隨后蛻至五齡乃至成蟲。而處理組21頭若蟲中，有6頭蛻皮困難而導(dǎo)致死亡，至此處理組若蟲的死亡率達(dá)到50. 0%，蛻至四齡的若蟲 最終可以發(fā)育至成蟲。蛻皮困難并最終導(dǎo)致蟲體死亡的15頭若蟲都出現(xiàn)統(tǒng)一的表型(圖
1):頭部、胸部及腹部舊表皮均能夠開裂并剝離，但蛻至附肢時(shí)，新舊表皮無法分離，蟲體開始出現(xiàn)反復(fù)掙扎，時(shí)間長(zhǎng)達(dá)數(shù)小時(shí)，最終導(dǎo)致死亡。實(shí)施例3 :飛蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因dsRNA致死5齡飛蝗I、飛蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因dsRNA注射將2 μ I (6 μ g)SEQ ID NO :2的dsRNA用25 μ I規(guī)格微量注射器注射到5齡飛蝗第2日齡若蟲二、三腹節(jié)之間，共注射40只，雌雄各半。注射相同體積濃度的dsGFP至對(duì)照組體內(nèi)。將注射后飛蝗置于28°C恒溫生化培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)。2、注入dsRNA后5齡飛蝗表型的觀察五齡若蟲注射dsRNA后，對(duì)照組蟲體3天后開始蛻皮并在注射后第5天全部成功發(fā)育至成蟲,蛻皮時(shí)間約為20min，蛻皮發(fā)育為成蟲后蟲體狀態(tài)良好。注射dsLmNAGl的處理組若蟲共40頭，與對(duì)照組相比未出現(xiàn)蛻皮延遲的現(xiàn)象，但蛻皮持續(xù)時(shí)間仍均>lh，其中有I頭于注射后3天死亡、2頭于注射后4天死亡、18頭于注射后5天(即五齡第七天)死亡，僅有19頭若蟲能夠蛻至成蟲，死亡率達(dá)到52. 5%。19頭死亡若蟲出現(xiàn)三種不同的表型(圖
2):第一種為蝗蝻蛻皮時(shí)僅前胸背板及頭部沿脊線開裂少許，開裂部分可見新表皮，后腹部?jī)H蛻出一小段從而死亡；第二種表型是附肢新舊表皮無法分離，且新翅也無法從舊表皮翅芽中蛻出；第三種則是前胸背板脊線開裂部分增大，可一直延長(zhǎng)至下腹部背板，前胸背板處新表皮脹裂,體液溢出導(dǎo)致蟲體死亡。以上三種表型出現(xiàn)的幾率基本相同。3、飛蝗β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因沉默檢測(cè)對(duì)于5齡dsRNA注射后不同時(shí)間點(diǎn)的沉默效率檢測(cè)，選擇注射后24h、48h和72h的整蟲蟲體作為RNA提取對(duì)象，每組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。提取各樣品的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，用RT-PCR和Real-time PCR檢測(cè)目的基因(LmNAGl)和管家基因(β -actin)的相對(duì)表達(dá)量，以計(jì)算目的基因的沉默效率(圖3)。
權(quán)利要求
1.一種昆蟲β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID Ν0:1。
2.一種昆蟲β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID Ν0:2。
3.如權(quán)利要求2所述的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因，含有Τ7啟動(dòng)子。
4.如權(quán)利要求2所述的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因合成的dsRNA，所述dsRNA是用上游引物SEQ ID NO :3和下游引物SEQ ID NO :4合成PCR產(chǎn)物，經(jīng)fizard SV Gel andPCR Clean-Up System (Promega)試劑盒純化后按照 T7RiboMAX Express RNAi System(Promega)試劑盒說明體外轉(zhuǎn)錄合成。
5.如權(quán)利要求5所述的dsRNA在致死蝗蟲中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種昆蟲β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因(NAG)的序列及其雙鏈RNA(dsRNA)的應(yīng)用方法，它可沉默特定的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因，使害蟲死亡。對(duì)飛蝗β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因進(jìn)行克隆和測(cè)序后，得到序列為SEQ ID NO1的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因；然后選擇序列為SEQ ID NO2的該基因片段，用于dsRNA的合成。該基因dsRNA注入昆蟲體腔后，昆蟲生長(zhǎng)過程發(fā)育遲緩；無法順利蛻皮進(jìn)入下一齡期，導(dǎo)致死亡。本發(fā)明為基于RNA干擾的害蟲防治提供新的靶標(biāo)。
文檔編號(hào)C12N15/56GK102876691SQ20121035667
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月21日
發(fā)明者李大琪, 容爍, 李濤, 張建珍, 馬恩波 申請(qǐng)人:山西大學(xué)