專利名稱：一種霍亂弧菌流行株分子鑒定方法及其issr-pcr引物及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間聚合酶鏈反應(yīng)(inter simple sequencerepeat-polymerase chain reaction, ISSR-PCR)技術(shù)的食源致病菌分子鑒定方法。具體涉及區(qū)分霍亂弧菌流行株與非流行株的ISSR - PCR快速分子鑒定方法；還涉及所述方法中使用的對(duì)于霍亂弧菌流行株基因組具有特征性分子分型作用的引物。
背景技術(shù)：
霍亂(Cholera)是一個(gè)古老的烈性腸道傳染病，被稱為“摧毀地球最可怕的瘟疫之一”。其臨床表現(xiàn)為急性腹瀉、嘔吐，瀉吐頻繁、量大，為米泔水樣，從而導(dǎo)致脫水、電解質(zhì)紊亂及周圍循環(huán)衰竭，嚴(yán)重者可致休克、酸中毒，如不及時(shí)搶救，病死率甚高。輕癥患者有時(shí)類似腸炎，易于漏診或誤診，其危害性同樣不可忽視。由于該病有來(lái)勢(shì)迅猛，傳播迅速等特點(diǎn)， 易引起世界大流行，被確定為國(guó)際檢疫傳染病。我國(guó)在傳染病防治法中規(guī)定霍亂屬于甲類傳染病，必須重點(diǎn)監(jiān)測(cè)和檢疫。革蘭氏陰性菌-霍亂弧菌(Vibrio Cholerae，VC)是引起霍亂的病原菌。目前已有200多種霍亂弧菌O抗原血清群被鑒定，但只有01群和0139群霍亂弧菌能導(dǎo)致霍亂，并引發(fā)世界性大流行?；魜y弧菌可區(qū)分為兩類菌株，即流行株(Epidemigenic strain)和非流行株(Non-Epidemigenic strain)。這兩類菌株在致病力、分子遺傳學(xué)特征和引起疾病的流行病學(xué)特點(diǎn)方面均有顯著不同。流行株的致病力強(qiáng)，具有引起流行和大流行的潛力；非流行株存在于自然水體中，一般不致病或僅引起散發(fā)的腹瀉病例。流行株具有特征性的染色體DNA酶切圖譜，與非流行株的酶譜截然不同。CT基因檢測(cè)也證明，流行株與非流行株存在有與沒(méi)有CT基因的根本區(qū)別。近10年間WHO每年統(tǒng)計(jì)的霍亂全球報(bào)告病例數(shù)均在10-30萬(wàn)例以上，由于漏報(bào)和不報(bào)等因素的存在，實(shí)際病例數(shù)要遠(yuǎn)高于這個(gè)數(shù)字，而2006-2010年近5年的數(shù)據(jù)顯示霍亂病例呈大幅增加的趨勢(shì)，疫情又趨嚴(yán)峻，一些發(fā)展中國(guó)家霍亂流行尤為嚴(yán)重。目前全球最新的流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)是世界衛(wèi)生組織(WHO)于2011年7月29日在WeeklyEpidemiologicalRecord[2011, 86, 325 - 340]上發(fā)布的2010年全球霍亂概況[網(wǎng)頁(yè)地址http://www. who.int/cholera/statistics/en/index, html]。數(shù)據(jù)顯不2010年全球報(bào)告給WHO的霍亂病例數(shù)顯著增加并達(dá)到了 2000年來(lái)的最高點(diǎn)，總計(jì)有317，534例，與2009年相比增加43%，與2000年相比增加了 130% ;而2010年的死亡人數(shù)也達(dá)到7543例，與2009年相比增加了 52%，病死率達(dá)到了 2. 38%。大幅增長(zhǎng)的病例數(shù)據(jù)同時(shí)也警示我們，由于國(guó)際旅行人員流動(dòng)的增加可能會(huì)促使霍亂的進(jìn)一步跨地區(qū)傳播，甚至引起世界范圍的大流行。我們知道，由于人員流動(dòng)的國(guó)際化趨勢(shì)，霍亂等重大傳染病能迅速地跨地區(qū)傳播，已成為當(dāng)前傳染病預(yù)防控制面臨的重點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題。因此，建立簡(jiǎn)易、快速、準(zhǔn)確的霍亂弧菌分子分型方法對(duì)于指導(dǎo)疾病控制部門和國(guó)境口岸衛(wèi)生檢疫部門開展霍亂弧菌的監(jiān)測(cè)和大流行的防控具有重要意義。
目前，針對(duì)霍亂弧菌流行株的鑒定，經(jīng)典的方法有免疫血清學(xué)診斷結(jié)合PCR檢測(cè)、染色體DNA酶切圖譜分析、脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)(pulsed field gelelectrophoresis, PFGE)技術(shù)和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA (Randomly Amplified PolymorphicDNA, RAPD)技術(shù)等。血清學(xué)診斷比較粗糙，只能分出O抗原的不同血清群，試劑成本較高，穩(wěn)定性也較差；而PCR則用來(lái)檢測(cè)CT基因是否存在。染色體DNA酶切圖譜分析操作繁瑣，圖譜的區(qū)別鑒定難度較大。PFGE是分子分型技術(shù)，穩(wěn)定性較好，但是操作復(fù)雜，對(duì)設(shè)備和技術(shù)條件要求甚高，并且也較難特異性的區(qū)分出流行株和非流行株。RAPD也屬分子分型技術(shù)，雖然操作簡(jiǎn)便，但分型能力不夠高，容易錯(cuò)誤鑒定。簡(jiǎn)單序列重復(fù)(simple sequence repeats, SSR),又稱微衛(wèi)星DNA,即為一至多個(gè)核苷酸的3次以上串聯(lián)重復(fù)，如CACACACA，是原核生物中廣泛存在的一種遺傳標(biāo)記，部分SSRs表現(xiàn)出長(zhǎng)度和位置的高度多態(tài)性。簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間聚合酶鏈反應(yīng)(inter simplesequence repeat-polymerase chain reaction, ISSR-PCR)是Zietkewiecz 于 1994年發(fā)明的，利用SSR序列多態(tài)性，建立在PCR基礎(chǔ)上的一種新型、簡(jiǎn)易的分子指紋分析鑒定技術(shù)，它 不需要復(fù)雜的技術(shù)設(shè)計(jì)及昂貴的試劑和儀器設(shè)備，克服了以往分子分型技術(shù)的不足，更為簡(jiǎn)便高效，分辨力強(qiáng)，圖譜穩(wěn)定，并且針對(duì)某些遺傳背景的菌株能夠產(chǎn)生特異性的PCR擴(kuò)增片段，提高了分子鑒定的能力和準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于ISSR-PCR技術(shù)的對(duì)霍亂弧菌流行株基因組具有特異性分子鑒定作用的引物及試劑盒；本發(fā)明還提供了一種利用上述引物基于ISSR-PCR技術(shù)對(duì)霍亂弧菌流行株和非流行株進(jìn)行分子鑒定的方法。本發(fā)明一種霍亂弧菌流行株與非流行株分子鑒定用引物所采用的技術(shù)方案是，一種霍亂弧菌流行株分子鑒定用ISSR-PCR引物，所述引物的堿基序列表示如下引物pGA5 5，-ACGAGAGAGAGA-3，。一種霍亂弧菌流行株分子鑒定用試劑盒，所述試劑盒包括如上所述的引物pGA5。所述試劑盒還包括2 X ISSR-PCR反應(yīng)液和Taq DNA聚合酶，所述2 X ISSR-PCR反應(yīng)液包括如下組分20mM 的 ρΗ8· 3 的 Tris-HCl，IOOmM 的 KC1，4mM 的 MgCl2,0. 6mM 的 dNTP，2.4“] 的引物？6八5。試劑盒反應(yīng)體系總體積為25 μ L，含有2 X ISSR-PCR反應(yīng)液12. 5 μ L，待檢測(cè)基因組DNAlOOng 500ng，Taq DNA聚合酶I. 5U，其余為滅菌超純水。一種霍亂弧菌流行株分子鑒定方法，其特征在于包括如下步驟(I)提取待測(cè)試樣品DNA ；(2)采用如上任一所述的試劑盒對(duì)待測(cè)試樣品DNA進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增和電泳；(3)分析電泳圖譜，判定檢測(cè)結(jié)果。所述鑒定方法還包括3個(gè)參比對(duì)照DNA :分別為01群霍亂弧菌非流行株、01群霍亂弧菌流行株及0139群霍亂弧菌流行株。所述鑒定方法的ISSR-PCR反應(yīng)條件是95°C預(yù)變性3min，然后在94°C 40sec,45°C 60sec,72°C 120sec條件下進(jìn)行3步PCR循環(huán)擴(kuò)增，循環(huán)次數(shù)為30次，最后在72°C保溫 IOmin。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明通過(guò)提供對(duì)霍亂弧菌流行株具有特異性分子鑒定作用的I條ISSR-PCR引物，及包含上述引物的試劑盒及檢測(cè)方法，來(lái)檢測(cè)某一分離獲得的霍亂弧菌菌株基因組DNA，進(jìn)而確定該霍亂弧菌菌株是否為流行株。本發(fā)明所述分子鑒定方法具有以下優(yōu)點(diǎn)①操作簡(jiǎn)便只需通過(guò)常規(guī)的PCR擴(kuò)增和電泳分析就能得到檢測(cè)結(jié)果；②成本低廉=ISSR-PCR檢測(cè)所需試劑成本很低，單次檢測(cè)不超過(guò)50元；③特異性強(qiáng)通過(guò)精心設(shè)計(jì)并結(jié)合大量樣本篩查優(yōu)化選擇出的I條ISSR-PCR引物能產(chǎn)生一條約350bp的特異性擴(kuò)增片段，能準(zhǔn)確的區(qū)分霍亂弧菌流行株和非流行株。④重復(fù)性好不同時(shí)間、不同操作者的數(shù)次實(shí)驗(yàn)所獲得的指紋圖譜穩(wěn)定。


圖I是實(shí)施例四中，采用本發(fā)明的ISSR-PCR方法對(duì)25份霍亂弧菌進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，其中，I VC01 ；2 VC02 ；3 VC03 ；4 VC04 ；5 VC05 ；6 VC06 ；7 VC07 ；8 VC08 ；9 VC09 ；10 VC10 ；11 VC11 ；12 VC12 ；13 VC13 ；14 VC14 ；15 VC15 ；16 VC16 ；17 VC17 ；18 VC18 ；19 VC19 ；20 VC20 ；21 VC21 ；22 VC22 ；23 VC23 ；24 VC24 ；25 VC25 ；M IOObp DNAMarker0
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體的霍亂弧菌流行株ISSR-PCR分子鑒定方法的研究過(guò)程來(lái)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。實(shí)施例一 ISSR — PCR引物的設(shè)計(jì)首先從美國(guó)NCBI的基因庫(kù)下載霍亂弧菌的全基因組DNA序列，然后根據(jù)霍亂弧菌流行株和非流行株之間基因組DNA序列多態(tài)性位點(diǎn)存在顯著差異的普遍性，系統(tǒng)分析霍亂弧菌全基因組DNA中簡(jiǎn)單序列重復(fù)(SSR)這一遺傳標(biāo)記的序列特征和分布數(shù)量，設(shè)計(jì)一組ISSR-PCR引物，然后選擇100份不同類型的霍亂弧菌菌株(包括01群VC非流行株、01群VC流行株、0139群VC流行株，以上菌株部分分離自水產(chǎn)品，部分分離自海水，部分分離自霍亂病人)進(jìn)行ISSR-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選，最后本發(fā)明優(yōu)選出如下I條引物引物pGA5:5’ -ACGAGAGAGAGA-3’，序列編號(hào)為 SEQ ID NO. I ；為保證引物的質(zhì)量，委托大連寶生物工程有限公司以HPLC的純度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行合成。實(shí)施例二 霍亂弧菌ISSR-PCR分子鑒定方法的試劑組成針對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系一些重要的影響因素進(jìn)行條件的優(yōu)化。I.方法首先確定ISSR-PCR反應(yīng)體系中Mg2+濃度、dNTP的濃度及引物的濃度最佳值。(I) Mg2+濃度的確定按照表I的反應(yīng)體系配制2X ISSR-PCR反應(yīng)液，其中分別添加并調(diào)節(jié)Mg2+的終濃度至5. 0mM、4. OmM,3. OmM,2. OmMU. 0mM、0. 5mM,以霍亂弧菌基因組DNA為模板進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后比較不同Mg2+濃度對(duì)擴(kuò)增效率和指紋圖譜的影響。表I
權(quán)利要求
1.ー種霍亂弧菌流行株分子鑒定用ISSR-PCR引物，其特征在于所述引物的堿基序列表示如下引物 pGA5 :5’ -ACGAGAGAGAGA-3’。
2.ー種霍亂弧菌流行株分子鑒定用試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括如權(quán)利要求I所述的引物PGA5。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括2X ISSR-PCR反應(yīng)液和Taq DNA聚合酶，所述2 X ISSR-PCR反應(yīng)液包括如下組分20mM 的 ρΗ8· 3 的 Tris-HCl，IOOmM 的 KCl, 4mM 的 MgCl2,0. 6mM 的 dNTP, 2. 4 μ M 的引物pGA5。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于試劑盒反應(yīng)體系總體積為25μ L，含有2 X ISSR-PCR反應(yīng)液12. 5 μ L，待檢測(cè)基因組DNA IOOng 500ng，Taq DNA聚合酶為1.5U，其余為滅菌超純水。
5.ー種霍亂弧菌流行株分子鑒定方法，其特征在于包括如下步驟 (1)提取待測(cè)試樣品DNA; (2)采用如權(quán)利要求2 4任一所述的試劑盒對(duì)待測(cè)試樣品DNA進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增和電泳； (3)分析電泳圖譜，判定檢測(cè)結(jié)果。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鑒定方法，其特征在于所述鑒定方法還包括3個(gè)參比對(duì)照DNA 分別為Ol群霍亂弧菌非流行株、01群霍亂弧菌流行株及0139群霍亂弧菌流行株。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鑒定方法，其特征在于所述鑒定方法的ISSR-PCR反應(yīng)條件是 95°C預(yù)變性 3min，然后在 94°C 40sec，45°C 60sec，72°C 120sec 條件下進(jìn)行 3 步 PCR 循環(huán)擴(kuò)增，循環(huán)次數(shù)為30次，最后在72°C保溫lOmin。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種霍亂弧菌流行株分子鑒定方法及其ISSR-PCR引物及試劑盒，該ISSR-PCR引物的堿基序列表示如下5’-ACGAGAGAGAGA-3’。本發(fā)明通過(guò)提供對(duì)霍亂弧菌流行株具有特異性分子鑒定作用的1條ISSR-PCR引物，及包含上述引物的試劑盒及檢測(cè)方法，來(lái)檢測(cè)某一分離獲得的霍亂弧菌菌株基因組DNA，進(jìn)而確定該霍亂弧菌菌株是否為流行株。本發(fā)明所述分子鑒定方法具有以下優(yōu)點(diǎn)①操作簡(jiǎn)便；②成本低廉；③特異性強(qiáng)，能準(zhǔn)確的區(qū)分霍亂弧菌流行株和非流行株；④重復(fù)性好。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102839219SQ201210356579
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月21日
發(fā)明者莫秋華, 林繼洪, 梁玉英, 楊澤, 杜田, 趙俊華, 史詠梅, 王琪 申請(qǐng)人:珠海國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心