專利名稱：具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的蛋白質(zhì)及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有β-Ν-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的蛋白質(zhì)及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
幾丁質(zhì)又名甲殼素、幾丁聚糖，是N-乙酰氨基葡萄糖的β_1，4糖苷鍵多聚物。幾丁質(zhì)廣泛存在于低等植物、菌類、藻類，節(jié)肢動(dòng)物蝦、蟹及昆蟲的外殼和軟骨，高等植物的細(xì)胞壁等，是自然界中僅次于纖維素的第二大天然生物有機(jī)資源，年生物合成量達(dá)100億噸。微生物對(duì)幾丁質(zhì)的有效降解通過(guò)幾丁質(zhì)酶(chitinase，EC 3. 2. I. 14)和幾丁二糖酶即 β -N-乙酸氨基葡萄糖苷酶(β -N-acetylglucosaminidase, Nag, EC 3. 2. I. 52)等的協(xié)同作用得以實(shí)現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的蛋白質(zhì)及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，獲自維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii),命名為NAG565 蛋白，是如下(a)或(b)或(C)(a)序列表中序列I自N末端第23至883位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(c)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶功能的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a)或(b)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表I所示的標(biāo)簽。表I標(biāo)簽的序列
標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2-10(通常為6個(gè))HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc—myc10EQKLISEEDL
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上述(C)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。 上述(C)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過(guò)將(a)或(b)的編碼基因中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表I所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼所述蛋白的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述基因可為如下I)或2)或3)或4)的DNA分子I)序列表中序列2自5’末端第第67至2649位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的蛋白的DNA分子；4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的蛋白的DNA分子。所述嚴(yán)格條件為在O. IXSSPE(或O. I X SSC), O. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。含有所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。可用現(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。所述表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，它們可單獨(dú)使用或與其它的啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。 翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于鑒定及篩選，可對(duì)所用表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。也可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接根據(jù)表型篩選。所述重組表達(dá)載體具體可為所述基因插入載體pET28a(+)的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。所述重組菌具體可為將所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌得到的重組菌。所述大腸桿菌優(yōu)選為大腸桿菌BL21 (DE3)。本發(fā)明還保護(hù)一種制備所述蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟(I)培養(yǎng)所述重組菌并在培養(yǎng)過(guò)程中加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)；(2)將完成步驟(I)的培養(yǎng)體系離心收集沉淀，超聲破碎后收集上清液即為含有所述蛋白質(zhì)的溶液。所述方法具體包括如下步驟(I)將所述重組菌培養(yǎng)至OD6tltl = 0.6,然后加入IPTG并使其初始濃度為lmol/L， 然后18°C振蕩培養(yǎng)12h ；(2)將完成步驟(I)的培養(yǎng)體系離心收集沉淀，超聲破碎后收集上清液，即為含有所述蛋白質(zhì)的溶液。所述方法更具體包括如下步驟(I)所述重組菌在液體LB培養(yǎng)基(含100 μ g/mL卡那霉素)中37°C振蕩培養(yǎng)至 OD600 = O. 6，然后加入IPTG并使其初始濃度為lmol/L，然后18°C、180 X g振蕩培養(yǎng)12h ；(2)將完成步驟(I)的培養(yǎng)體系10，OOOXg離心5min收集沉淀，超聲破碎后收集上清液，即為含有所述蛋白質(zhì)的溶液。擴(kuò)增所述基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述引物對(duì)具體可為序列表的序列3所示DNA片段和序列表的序列4所示DNA片段組成的引物對(duì)。本發(fā)明還保護(hù)所述蛋白作為β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的應(yīng)用。所述應(yīng)用中，所述蛋白的底物可為 pNP-GlcNAc、pNP- (GlcNAc) 2、pNP- (GlcNAc) 3、幾丁二糖、幾丁三糖、幾丁四糖、幾丁五糖和幾丁六糖中的至少一種。本發(fā)明還保護(hù)所述蛋白在制備飼料中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)是一種幾丁二糖酶，具有高比活力、寬松的應(yīng)用范圍和良好的穩(wěn)定性，可作為飼料添加劑應(yīng)用于水生動(dòng)物的養(yǎng)殖，具有重大應(yīng)用前景。


圖I 為 CTP 溶液和 NAG565 蛋白液的 SDS-PAGE 分析，M =Marker ；I CTP 溶液；2 NAG565蛋白液。圖2為NAG565蛋白的最適pH。圖3為NAG565蛋白的pH穩(wěn)定性。圖4為NAG565蛋白的最適溫度。 圖5為NAG565蛋白的熱穩(wěn)定性。 圖6為NAG565蛋白的蛋白酶抗性。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法，均按照以下實(shí)驗(yàn)手冊(cè)或文獻(xiàn)中的相關(guān)章節(jié)或部分來(lái)進(jìn)行，包括 Sambrook 等人,Molecular Cloning, ALaboratory Manual (第 3 版· 2001) ；Kriegler, Gene Transfer and Expression A Laboratory Manual(1990);和 Curren t Protocols inMolecularBiology (Ausubel等人編，1994)。實(shí)施例中檢測(cè)蛋白濃度的方法為Bradford 法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5 α 感受態(tài)細(xì)胞、大腸桿菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自北京全式金公司。連接酶購(gòu)自NEB公司。胰蛋白酶(Trypsin)、 α-糜蛋白酶(a-Chymotrypsin)、蛋白酶 K (Proteinase K)、膠原蛋白酶(Collagenase) 為 Sigma(USA)產(chǎn)品。胃蛋白酶(Pepsin)為 Amano Enzyme Inc. (Japan)產(chǎn)品。IPTG 為 Promega公司產(chǎn)品。Anti-His抗體、羊抗鼠IgG-HRP及Western Blot膜封閉液均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。
載體pET28a(+):購(gòu)自 Invi trogen 公司。對(duì)硝基酹(4-Nitrophenol或pNP):購(gòu)自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)N7660。pNP-GlcNAc (4-Nitrophenyl N-acetyl-a-D-glucosaminide):購(gòu)自 Sigma 公司， 產(chǎn)品目錄號(hào)N8759。P NP- (GlcNAc) 2 (4-Nitrophenyl N, N，-Diacetylchitobiose):購(gòu)自 Sigma 公司， 產(chǎn)品目錄號(hào)N6133。P NP- (GlcNAc) 3 (4-Nitrophenyl N, Nj, N^-Triacetylchitotriose):購(gòu)自 Sigma 公司，產(chǎn)品目錄號(hào)N8638。氣單胞菌(Aeromonas sp. )B565,已于2010年12月03日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3 號(hào))，保藏號(hào)為CGMCC No. 4403。將序列表的序列I所不的蛋白質(zhì)命名為NAG565蛋白，由883個(gè)氣基酸殘基組成， 自N末端第I至22位為信號(hào)肽。將NAG565蛋白的編碼基因命名為NAG565基因，其開(kāi)放閱讀框如序列表的序列2所示(2649bp)。實(shí)施例I、NAG565蛋白的制備一、重組質(zhì)粒 NAG565_pET28a(+)的構(gòu)建I、提取氣單胞菌B565的基因組DNA。2、以步驟I的基因組DNA為模板，用Fl和Rl組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。Fl (序列表的序列 3) :5’ -CCCGAATTCGCCGATGCCGCCAAGCAGGC-3，；Rl (序列表的序列 4) :5’ -TATGCGGCCGCGACGCGGCTGGTGCGCT-3’。3、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶切步驟2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。4、用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI雙酶切載體pET28a(+)，回收載體骨架(約 5300bp)。5、將步驟3的酶切產(chǎn)物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 NAG565-pET28a(+)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒NAG565_pET28a (+)進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在載體pET28a(+)的EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列2自5，末端第67至 2649位核苷酸所示的DNA片段。二、重組菌和對(duì)照菌的構(gòu)建將重組質(zhì)粒NAG565_pET28a (+)熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到重組菌。將載體pET28a(+)熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，得到對(duì)照菌。三、NAG565蛋白和對(duì)照蛋白的制備I、將步驟二構(gòu)建的重組菌接種于3mL液體LB培養(yǎng)基(含100 μ g/mL卡那霉素)， 37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，得到種子液。2、將100 μ L種子液轉(zhuǎn)接至IOmL液體LB培養(yǎng)基(含100 μ g/mL卡那霉素)中， 37°C振蕩培養(yǎng)約3h (OD600 = O. 6)，加入IPTG(使其初始濃度為lmol/L ；IPTG為誘導(dǎo)劑)， 18°C、180Xg振蕩培養(yǎng)12h(從加入IPTG開(kāi)始計(jì)時(shí))。3、將步驟2得到的培養(yǎng)液10，OOOXg離心5min，分別收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞沉淀。4、將步驟3得到的細(xì)胞沉淀用pH8. 0、20mM的Tris-HCl緩沖液重懸，超聲破碎，然
6后10，000 Xg離心lOmin，收集上清，即為含細(xì)胞總蛋白的溶液(簡(jiǎn)稱CTP溶液)。將步驟二構(gòu)建的對(duì)照菌代替重組菌進(jìn)行步驟I至4的操作，獲得含細(xì)胞總蛋白的溶液(簡(jiǎn)稱對(duì)照溶液)。四、CTP溶液和對(duì)照溶液的酶活測(cè)定(pNP-GlcNAc法)酶活(U)單位定義每分鐘分解pNP-GlcNAc釋放I μ mo I對(duì)硝基酚(pNP)所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位(IU)。單位體積內(nèi)待測(cè)溶液的酶活除以單位體積內(nèi)待測(cè)溶液的蛋白含量，即為蛋白的比活力。酶活測(cè)定方法將pNP-GlcNAc溶于緩沖液中，使其終濃度為1禮，即為底物溶液。 試驗(yàn)管將10 μ L待測(cè)溶液、240 μ L緩沖液和250 μ L底物溶液在試管中混合并搖勻，37°C 溫育5min，然后加入2mL O. 5M NaOH水溶液終止反應(yīng)，在405nm處測(cè)OD值。對(duì)照管在試管中依次加入10 μ L待測(cè)溶液，240 μ L緩沖液、2mL O. 5M NaOH水溶液和250 μ L底物溶液，在405nm處測(cè)OD值。將對(duì)硝基酹作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線函數(shù)為y = (O. 169x-0. 0153) X100XN/5 ；y :酶活(U/mL)，x :0D 值，100 :將 10 μ L 待測(cè)溶液中的酶活折算為ImL的酶活性，N:稀釋倍數(shù)。分別將步驟三的3得到的培養(yǎng)上清、步驟三的4得到的CTP溶液和步驟三得到的對(duì)照溶液作進(jìn)行酶活測(cè)定。酶活測(cè)定中采用的緩沖液為ΡΗ7. 0、20mM的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。對(duì)照溶液的酶活為OU/ml，CTP溶液的酶活為1562U/ml (比活力為1243U/mg)。 結(jié)果表明，NAG565蛋白主要在大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)。五、NAG565蛋白的純化將步驟四得到的CTP溶液進(jìn)行His標(biāo)簽融合蛋白親和層析純化。His標(biāo)簽融合蛋白親和層析的填充物為Ni-NTA樹(shù)脂，購(gòu)自上海生工生物工程公司 (產(chǎn)品目錄號(hào)BSP033)，裝柱量為ImL0洗脫過(guò)程中的各個(gè)緩沖液如下(pH均為7. 6)NTA-O :含 20mmol/L Tris-HCl,O. 5mol/L NaCl，10g/100ml 甘油，其它為水；NTA-20 :含 20mmol/L Tris-HCl，20mmol/L 咪唑，0. 5mol/L NaCl，10g/100ml 甘油， 其它為水；NTA-40 :含 20mmol/L Tris-HCl，40mmol/L 咪唑，0. 5mol,
其它為水；
它為水
7L NaCl，10g/100ml 甘油，
NTA-60 20mmol/L Tris-HCl，60mmol/L 咪唑，0. 5mol/L NaCl，10g/100ml 甘油，其 NTA-80 20mmol/L Tris-HCl，80mmol/L 咪唑，0. 5mol/L NaCl，lOg/lOOml 甘油，其
它為水；NTA-100 20mmol/L Tris-HCl, IOOmmoI/L 咪唑，0. 5mol/ 其它為水；NTA-200 20mmol/L Tris-HCl, 200mmol/L 咪唑，0. 5mol/ 其它為水；NTA-300 20mmol/L Tris-HCl, 300mmol/L 咪唑，0. 5mol/ 其它為水。洗脫過(guò)程(每次加5mL，完全流出柱子后再加5mL)
L NaCl，10g/100ml 甘油， L NaCl，10g/100ml 甘油， L NaCl，10g/100ml 甘油，
(I)柱子用水平衡20mL ；(2)用 NTA-O 平衡 20mL，上樣 5mLCTP 溶液；(3)用 NTA-O 洗脫 25mL (去雜蛋白)，然后依次用 NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA_80、 NTA-100、NTA-200、NTA-300各5mL洗脫，并收集NTA40-80洗脫的過(guò)柱后溶液(NAG565蛋白液)。將步驟四制備的CTP溶液和步驟五制備的NAG565蛋白液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，見(jiàn)圖I，純化后的蛋白顯示95kDa的單一條帶，與預(yù)期分子量相符。六、NAG565蛋白的酶活測(cè)定將步驟五得到的NAG565蛋白液作為待測(cè)溶液，其它完全同步驟四。NAG565蛋白液的酶活力為2257U/mL，比活力為7328U/mg。實(shí)施例2、NAG565蛋白的酶學(xué)性質(zhì)將實(shí)施例I的步驟五得到的NAG565蛋白液作為待測(cè)溶液，依次進(jìn)行如下各個(gè)酶學(xué)性質(zhì)之間一、NAG565 蛋白的最適 pH酶活測(cè)定方法同實(shí)施例I的步驟四。酶活測(cè)定中分別采用如下緩沖液pH3. 0,0. IM的乙酸鈉緩沖液，pH4. 0,0. IM的乙酸鈉緩沖液，PH5. 0,0. IM的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、pH6. 0,0. IM的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH7. 0,0. IM的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH8. 0,0. IM的Tris-HCl緩沖液， ρΗ9· 0、0· IM 的 Tris-HCl 緩沖液，pHlO. 0,0. IM 的甘氨酸-NaOH 緩沖液，pHll. 0,0. IM 的甘氨酸-NaOH緩沖液。NAG565蛋白在ρΗ7·0的環(huán)境中酶活最高，比活力為7301U/mg。以該最高比活力為 100%，計(jì)算NAG565蛋白在其它pH環(huán)境中的相對(duì)酶活，見(jiàn)圖2。NAG565蛋白在pH8.0的環(huán)境中，可以保持80 %以上的相對(duì)酶活。二、NAG565蛋白的pH穩(wěn)定性酶活測(cè)定方法將pNP-GlcNAc溶于緩沖液中，使其終濃度為1禮，即為底物溶液。試驗(yàn)管將10 μ L待測(cè)溶液和240 μ L緩沖液在試管中混合并37°C溫育12小時(shí)， 然后加入250 μ L底物溶液混合并37°C溫育5min，然后加入2mL O. 5M NaOH水溶液終止反應(yīng)，在405nm處測(cè)OD值。對(duì)照管將10 μ L待測(cè)溶液和240 μ L緩沖液在試管中混合并37°C溫育12小時(shí)， 然后依次加入2mL O. 5M NaOH水溶液和250 μ L底物溶液，在405nm處測(cè)OD值。NAG565蛋白在ρΗ7·0的環(huán)境中穩(wěn)定性最高，37°C溫育12小時(shí)后的比活力為 6350U/mg。以該最高比活力為100%，計(jì)算NAG565蛋白在其它pH環(huán)境中37°C溫育12小時(shí)后的相對(duì)酶活，見(jiàn)圖3。NAG565蛋白在pH范圍為5. 0-9. O間都很穩(wěn)定，保持70%以上的相對(duì)酶活。三、NAG565蛋白的最適溫度酶活測(cè)定中除了溫育溫度，其它同實(shí)施例I的步驟四。酶活測(cè)定中分別采用如下溫育溫度(TC、20°C、30°C、37°C、50°C、60V和70°C。酶活測(cè)定中采用pH7. 0、0. IM的磷酸
氫二鈉-檸檬酸緩沖液。
NAG565蛋白在37°C的環(huán)境中酶活最高，比活力為7321U/mg。以該最高比活力為 100%，計(jì)算NAG565蛋白在其它溫度環(huán)境中的相對(duì)酶活，見(jiàn)圖4。NAG565蛋白在20°C的緩沖中，可以保持40 %左右的酶活。四、NAG565蛋白的熱穩(wěn)定性酶活測(cè)定方法將pNP-GlcNAc溶于緩沖液中，使其終濃度為1禮，即為底物溶液。試驗(yàn)管在試管中將10 μ L待測(cè)溶液不同溫度(0°C、20°C、3(rC、37°C、5(rC、6(rC 或70°C )溫育30min，然后加入240 μ L緩沖液和250 μ L底物溶液，混勻，37°C溫育5min，然后加入2mL O. 5M NaOH水溶液終止反應(yīng)，在405nm處測(cè)OD值。對(duì)照管在試管中將10 μ L待測(cè)溶液不同溫度溫育30min，然后依次加入240 μ L 緩沖液、2mL O. 5M NaOH水溶液和250 μ L底物溶液，在405nm處測(cè)OD值。酶活測(cè)定中采用pH7. 0,0. IM的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。NAG565蛋白在30°C的環(huán)境中穩(wěn)定性最高，30°C溫育30min后的比活力為6187U/ mg。以該最高比活力為100%，計(jì)算NAG565蛋白在其它溫度環(huán)境中30°C溫育30min后的相對(duì)酶活，見(jiàn)圖5。NAG565蛋白在70°C以上完全失去活性，在30_70°C之間，隨著處理溫度的升高，酶活逐漸降低，30°C以下的處理對(duì)酶活性沒(méi)有影響。實(shí)施例3、NAG565蛋白的動(dòng)力學(xué)常數(shù)在37°C測(cè)定實(shí)施例I的步驟五得到的NAG565蛋白對(duì)不同濃度(1、2、5、10、50、 100,500,1000 μ mol/L)的底物的反應(yīng)初速度(酶活檢測(cè)方法同實(shí)施例I的步驟四)， 經(jīng)Lineweaver-Burk繪圖得出該酶對(duì)3種底物的Km和Vmax值。底物分別為pNP-GlcNAc、 pNP- (GlcNAc)2 和 pNP- (GlcNAc)3O結(jié)果見(jiàn)表2。在3種底物中，pNP-GlcNAc的Km值最小，Vmax值最大。表2NAG565蛋白對(duì)各種底物的動(dòng)力學(xué)常數(shù)
底物KmKnaxμ mol/ Lμ mol/ (L · min)pNP-GlcNAc2702366. 4pNP-(GlcNAc)2980501. 2pNP- (GlcNAc)31050276. O實(shí)施例4、NAG565蛋白的底物特異性一、NAG565蛋白對(duì)幾丁寡糖的降解I、將底物(幾丁寡糖)以4mM的濃度溶解于pH7.0、10mM的磷酸緩沖液中，即為底物溶液。幾丁寡糖分別采用以下幾種幾丁二糖、幾丁三糖、幾丁四糖、幾丁五糖或幾丁六糖，均購(gòu)自TRC公司。2、取O. ImL步驟I的幾丁寡糖底物溶液，加5 μ g實(shí)施例I的步驟五制備的NAG565 蛋白，即為初始體系(初始體系中含有O μ g/mL的還原糖);將初始體系37°C酶解6h，得到終止體系；以O(shè). lmLpH7. OUOmM的磷酸緩沖液作為幾丁寡糖底物溶液的陰性對(duì)照。3、根據(jù)DNS法測(cè)定產(chǎn)物中的還原糖含量(采用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線， 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下Y = 2521. l*A0D+20. 41 ;Y代表與初始體系相比終止體系中還原糖的增加量，單位為μ g/mL, Δ OD為終止體系的OD值減去初始體系的OD值)，以此表征NAG565 蛋白作為β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶降解幾丁寡糖的能力。陰性對(duì)照組的還原糖增加量為0μ g/mL，幾丁二糖組的還原糖增加量為1505. 3 μ g/mL，幾丁三糖組的還原糖增加量為 907. 8μ g/mL，幾丁四糖組的還原糖增加量為796. 9 μ g/mL，幾丁五糖組的還原糖增加量為 708. 7 μ g/mL，幾丁六糖組的還原糖增加量為403. 6 μ g/mL。可以確定NAG565蛋白對(duì)幾丁寡糖具有一定的降解作用。二、NAG565蛋白對(duì)其它底物的識(shí)別方法同步驟一，差異僅在于用如下底物代替幾丁寡糖4-MethylumbelIiferyl-N-Acetyl- a -D-Glucosaminide(Sigma)、4-Methylumbelliferyl-a -D-Glucoside(Sigma)、4-Methylumbelliferyl-a -D-Galactoside(Sigma)、4-Methylumbelliferyl-a -D-Xyloside(Sigma)、4-Methylumbel-Liferyl-a -D-Cellobiopyranoside(Sigma)、Glycol-chi tosan(Sigma)、羧甲基纖維素；殼聚糖粉末。NAG565蛋白對(duì)上述底物均沒(méi)有降解能力。結(jié)果表明，NAG565蛋白對(duì)β -N-乙酰氨基葡萄糖苷鍵具有專一性。實(shí)施例5、NAG565蛋白對(duì)相關(guān)化學(xué)試劑的抗性檢測(cè)實(shí)施例I的步驟五得到的NAG565蛋白對(duì)不同金屬離子或化學(xué)試劑的抗性。 酶活檢測(cè)方法參見(jiàn)實(shí)施例I的步驟四，差別僅在于在反應(yīng)體系中加入不同的金屬離子或化學(xué)試劑(K+、Na+、Ca2+、Li+、Co2+、Cr3+、Ni2+、Cu2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+、Ag+、Hg2+、EDTA、SDS 或 β -巰基乙醇；終濃度均為5mM)，以未加金屬離子和化學(xué)試劑的反應(yīng)體系作為對(duì)照。酶活測(cè)定中采用PH7. 0,0. IM的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。結(jié)果見(jiàn)表3。Na+、Mn2+對(duì)NAG565蛋白的酶活有促進(jìn)作用。Co2+、Cr3+、Cu2+等對(duì) NAG565蛋白的酶活有不同程度的抑制作用，Ag+和Hg2+幾乎完全抑制NAG565蛋白的酶活， 而K+、Ca2+、Mg2+等對(duì)NAG565蛋白的酶活的影響很小，可以忽略不計(jì)。NAG565蛋白對(duì)陰性表面活性劑-SDS具有一定的抵抗能力。表3金屬離子及相關(guān)化學(xué)試劑對(duì)NAG565蛋白的影響
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，為如下(a)或(b)或(C)(a)序列表中序列I自N末端第23至883位氣基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(c)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有β -N-乙酰氨基葡萄糖苷酶功能的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求I所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于它為如下I)或2)或3)或4)的DNA分子1)序列表中序列2自5’末端第第67至2649位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的蛋白的DNA分子；4)與I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為將權(quán)利要求2 或3所述基因插入載體pET28a(+)的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。
6.如權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于所述重組菌為將權(quán)利要求4或5所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌得到的重組菌。
7.一種制備權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟(1)培養(yǎng)權(quán)利要求6所述重組菌并在培養(yǎng)過(guò)程中加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)；(2)將完成步驟(I)的培養(yǎng)體系離心收集沉淀，超聲破碎后收集上清液即為含有權(quán)利要求I所述蛋白質(zhì)的溶液。
8.擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)。
9.權(quán)利要求I所述蛋白作為β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求I所述蛋白在制備詞料中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的蛋白質(zhì)及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，為如下(a)或(b)或(c)(a)序列表中序列1自N末端第23至883位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(c)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶功能的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)可以高效降解pNP-GlcNAc，從而可以作為飼料添加物用于制備飼料中。本發(fā)明具體有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A23K1/165GK102586208SQ20121006538
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月13日
發(fā)明者周志剛, 姚斌, 張宇婷, 徐俐, 李映紅, 李青, 楊雅麟, 霍鳳敏 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所