專利名稱：α(1,3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶重組載體、病毒體及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說是涉及一種α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶重組載體，特征是該重組體的基因表達(dá)盒是由啟動(dòng)子-包含α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因cDNA-多聚嘌呤核苷酸構(gòu)成的特征序列，能夠高效感染人的各種靶細(xì)胞，使之表達(dá)α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶，引起靶細(xì)胞表面大量表達(dá)半乳糖表位，激發(fā)免疫排斥反應(yīng)，達(dá)到清除靶細(xì)胞的目的。制備方法主要應(yīng)用基因克隆，純化，重組，表達(dá)等基因工程和細(xì)胞工程技術(shù)。這種載體可以用于腫瘤、疣、胬肉等新生物的基因治療或/和免疫治療，以及用于腫瘤、疣、胬肉等新生物細(xì)胞進(jìn)行免疫修飾，制成疫苗進(jìn)行預(yù)防。
背景技術(shù)：
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，特別是基因工程和細(xì)胞工程技術(shù)的發(fā)展，惡性腫瘤的基因治療成為人們研究的熱點(diǎn)。目前，全球共有600多項(xiàng)基因治療方案獲準(zhǔn)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)，有些治療方案已獲得一定療效，初步顯示了基因治療的前景。作為可用于基因治療的各種載體，本身不具有任何治療疾病的意義，無臨床應(yīng)用價(jià)值；而作為可用于各種治療目的基因，由于直接導(dǎo)入靶細(xì)胞及其在靶細(xì)胞內(nèi)直接表達(dá)的有一定難度，只具有潛在的治療作用，沒有實(shí)際的臨床價(jià)值。只有將具有潛在治療作用的基因與可轉(zhuǎn)移基因的載體結(jié)合，通過后者介導(dǎo)，將目的基因?qū)氚屑?xì)胞并表達(dá)，才能達(dá)到真正的臨床治療效果。因此，構(gòu)建治療基因與基因載體的融合序列是實(shí)現(xiàn)基因治療的關(guān)鍵。將目的基因的表達(dá)盒與載體進(jìn)行融合常用的方法是在真核細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，過程復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而使用在原核細(xì)胞(大腸桿菌)中實(shí)現(xiàn)同源重組、構(gòu)建融合表達(dá)載體的基因工程技術(shù)則可有效解決上述問題。
缺乏特異性，靶向性及高效性的基因轉(zhuǎn)移載體一直是腫瘤基因治療的一個(gè)難題，目前，用于基因治療的載體主要分為病毒載體和非病毒載體兩大類。常用的病毒載體有腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等。腺病毒載體是常用的基因載體，它的優(yōu)點(diǎn)在于轉(zhuǎn)染效率高、可操作性好、能攜帶較大的目的基因片斷、可制備高效價(jià)的病毒顆粒，易于工業(yè)化生產(chǎn)，即能感染分裂期細(xì)胞，也能感染非分裂期細(xì)胞，具有安全、致病性低等優(yōu)點(diǎn)。也有不足之處，一是感染缺乏特異性，二是具有免疫原性。因此，對(duì)腺病毒載體進(jìn)行存利去弊的改進(jìn)是發(fā)展基因治療的必由之路。研究表明，腺病毒載體E1或E3缺失區(qū)攜帶外源性基因可實(shí)現(xiàn)目的基因的較長時(shí)間的表達(dá)，且可降低其免疫源性，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能攜帶外源基因整合進(jìn)靶細(xì)胞基因組中實(shí)現(xiàn)目的基因穩(wěn)定持久的表達(dá)，但逆轉(zhuǎn)錄病毒體外繁殖滴度低、轉(zhuǎn)染效率低，只感染分裂期細(xì)胞，在染色體里是隨機(jī)整合；其他可用于基因轉(zhuǎn)移的病毒載體和非病毒載體均存在不同的利弊。
大量證據(jù)提示人體內(nèi)存在預(yù)先形成的抗體，即天然抗體(NAb)，是種間移植存在超急排斥現(xiàn)象(HAR)的基礎(chǔ)。HAR中的人的天然抗體可以廣泛識(shí)別豬抗原，但實(shí)際上，90％以上人血清內(nèi)的補(bǔ)體依賴性排異反應(yīng)天然抗體只識(shí)別異種(豬)抗原的一個(gè)結(jié)構(gòu)，即α(1，3)半乳糖基(gal)，它是異種(豬)抗原的抗原表位(決定簇)，這些抗原都特異性地?cái)y帶一個(gè)α(1，3)半乳糖基抗原表位，α(1，3)半乳糖基的形成，主要由α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶催化，這種酶在低等動(dòng)物和新世界猴體內(nèi)表達(dá)，人、猿、及舊世界猴體內(nèi)都缺乏這種酶。由于人體不表達(dá)α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶，也不攜帶α(1，3)半乳糖的抗原表位(決定簇)，因此頻繁地與該抗原接觸使得體內(nèi)的天然抗體有很高的效價(jià)。人細(xì)胞，特別是腫瘤細(xì)胞，引入異種(豬)的α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因，使之表達(dá)α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶，引起腫瘤細(xì)胞表面大量表達(dá)半乳糖表位，半乳糖表位引發(fā)了人體內(nèi)的天然抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，進(jìn)而腫瘤特異性抗原的暴露引發(fā)特異性免疫反應(yīng)，達(dá)到治療或/和預(yù)防腫瘤的目的。這種方法充分利用體內(nèi)存在的天然抗體，是一種簡便，經(jīng)濟(jì)的基因治療或/和免疫治療方案。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在將具有潛在治療作用的基因與可轉(zhuǎn)移基因的載體進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，而提供一種病毒載體與α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因的重組載體，能夠在基因工程改造過的特定細(xì)胞中繁殖、生產(chǎn)，并可在真核細(xì)胞中表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞膜表面產(chǎn)生較多α(1，3)半乳糖基表位。結(jié)果令人鼓舞，半乳糖表位引發(fā)了人體內(nèi)的天然抗體對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用以及腫瘤特異性抗原的暴露引發(fā)的特異性免疫反應(yīng)，達(dá)到了治療或/和預(yù)防腫瘤的目的。本發(fā)明的目的還在于提供重組載體的制備方法及其用于制備治療或/和預(yù)防腫瘤藥物的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種病毒載體與α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因的重組載體，該重組載體是將由DNA克隆技術(shù)構(gòu)建的病毒載體與α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)盒相結(jié)合，構(gòu)建成一個(gè)能在基因工程改造過的特定細(xì)胞中擴(kuò)增、繁殖，也能在真核細(xì)胞中表達(dá)α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶的融合序列。
具體地說是涉及一種α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶表達(dá)載體，特征是能夠高效感染人的各種腫瘤細(xì)胞，使之表達(dá)α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶，引起腫瘤細(xì)胞表面大量表達(dá)半乳糖表位，激發(fā)免疫排斥反應(yīng)，達(dá)到清除腫瘤的目的。制備方法主要應(yīng)用基因克隆，重組，純化，表達(dá)等基因工程和細(xì)胞工程技術(shù)。這種載體可以用于腫瘤的基因治療以及免疫治療。
該重組載體的載體可以為質(zhì)粒載體，DNA病毒或PNA病毒載體的任何一種，其優(yōu)選載體為腺病毒載體或含有腺病毒載體序列的復(fù)合載體；最優(yōu)選載體為腺病毒載體。
本發(fā)明提供一株重組5型腺病毒，已于2005年5月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)進(jìn)行保藏，登記入冊編號(hào)為CGMCCNo.1383。
所述α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因可以是α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因的任一種，最優(yōu)選的基因?yàn)樨iα(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因。
本項(xiàng)發(fā)明提供了這種重組載體的制備和應(yīng)用方法一、重組α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因重組腺病毒載體和/或重組腺病毒顆粒的制備方法提供了一種用分子生物學(xué)中基因克隆，表達(dá)，純化，重組等基因工程和細(xì)胞工程技術(shù)制備重組載體的方法。該重組載體的載體可以為DNA病毒或PNA病毒的任一種，其優(yōu)選載體為腺病毒載體或含有腺病毒載體序列的復(fù)合載體；最優(yōu)選載體為腺病毒載體。這種方法在載體中引入α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因，組成轉(zhuǎn)染效率高、可操作性強(qiáng)的重組α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因重組腺病毒載體和/或重組腺病毒顆粒。
例如，豬的重組α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因腺病毒體這樣準(zhǔn)備(a)構(gòu)建豬的重組α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因腺病毒載體在腺病毒載體(pShuttle)序列中，定點(diǎn)引入豬的α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶的cDNA，組成α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因腺病毒穿梭載體；(b)將(a)中組成α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因腺病毒穿梭載體轉(zhuǎn)入原核細(xì)胞中篩選，挑取陽性克隆，酶切以及測序確定正確陽性克隆，并進(jìn)行擴(kuò)增獲取重組載體DNA；
(c)將(b)中擴(kuò)增的重組載體DNA與同源重組質(zhì)粒如PBHG共轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞，產(chǎn)出適量豬的α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因的腺病毒體(復(fù)制缺陷的病毒顆粒)，該重組腺病毒顆粒組成組合之一是含有MCMV啟動(dòng)子-Sus scrofa a1，3GT-polyA表達(dá)盒。該重組腺病毒為5型腺病毒，其基因組中E1和E3缺失。；(d)將上述病毒顆粒純化制備成制劑，如液體劑型、半固體劑型、固體型或氣體劑型。
二、重組載體或病毒體的應(yīng)用方法此項(xiàng)發(fā)明提供了應(yīng)用上述重組病毒體進(jìn)行腫瘤等新生物治療或/和預(yù)防的方法。本發(fā)明的重組載體或病毒體可用于制備成合適的劑型，如液體劑型、半固體劑型、固體型或氣體劑型。本發(fā)明的重組載體中治療基因的啟動(dòng)子可以換成人體器官特異性啟動(dòng)子，達(dá)到靶向性治療的目的。本發(fā)明的重組載體可用于對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行免疫修飾，制成腫瘤疫苗預(yù)防腫瘤。
例如，豬的重組α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因腺病毒體治療尖銳濕疣這樣實(shí)施(a)豬的重組α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因腺病毒體制備成質(zhì)量符合臨床試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的半固體制劑；然后(b)尖銳濕疣表面涂敷(a)中半固體制劑，引起尖銳濕疣細(xì)胞表面大量表達(dá)α(1，3)半乳糖基表位，激發(fā)免疫排斥反應(yīng)，達(dá)到清除和/或預(yù)防尖銳濕疣的目的。
例如，豬的重組α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因腺病毒體瘤內(nèi)注射這樣實(shí)施(a)豬的重組α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因腺病毒體制備成質(zhì)量符合臨床試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的注射液；然后(b)體表腫瘤瘤體內(nèi)直接注射(a)中注射液，體內(nèi)腫瘤用介入方法西向腫瘤瘤體內(nèi)注射(a)中注射液，引起腫瘤細(xì)胞表面大量表達(dá)α(1，3)半乳糖基表位，激發(fā)免疫排斥反應(yīng)，達(dá)到清除和/或預(yù)防腫瘤的目的。
豬的重組α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因腺病毒體前列腺靶向性改造這樣實(shí)施(a)克隆純化人的前列腺特異性抗原基因的啟動(dòng)子，調(diào)控試驗(yàn)證實(shí)有效；然后(b)正確定向克隆入豬的重組α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因腺病毒重組載體，替代原有啟動(dòng)子。
豬的重組α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因腺病毒體修飾腫瘤細(xì)胞疫苗這樣制備和應(yīng)用
(a)培養(yǎng)擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞，用豬的重組α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因腺病毒體轉(zhuǎn)染修飾；(b)篩選轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞陽性克隆或不篩選；(c)物理或化學(xué)方法進(jìn)有效周期抑制；(d)制成腫瘤細(xì)胞疫苗制劑應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1例如，豬的重組α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因腺病毒在針劑這樣制備(a)制備豬組織或有核細(xì)胞的cDNA文庫，根據(jù)AF221509.Sus scrofaclone.mRNA序列設(shè)計(jì)引物，上游引入EcoR I位點(diǎn)，下游引入Sal I酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增豬α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因(alpha1，3 galactosyltransferase；a1，3GT)；(b)將(a)中組成α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因克隆入pUC18載體中，獲得重組質(zhì)粒PUC18-a1，3GT。然后用EcoRI+Sal I酶切，回收a1，3GT基因片段，EcoRI+SalI酶切載體質(zhì)粒pDC316，回收載體骨架片段，構(gòu)建成功重組質(zhì)粒PDC316-a1，3GT，測序兩個(gè)反應(yīng)測通，拼接以后的序列如下TGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTGCTCGAAGTCGACTCAGATGTTATTTCTAACCAAATTATACTCTTTTTTCTGCCAAGCTATCTTGACAATCCTAATATCCACAGACATGCCTATATGATAATCCCAGCAGTATTCTGGGGATAAGATTTTAGTGGGTTTGTTGAGAAGGAAATACTTGTTTAGATGGCTTTCATCATGCCACTCGGCTTCTATGTCATTTTCCTTGTCCTGGAGGATTCCCTTGAAGCACTCCTGAGTGATGTTTAGAACCTGAGTGGGTGTTCCCCCAAAAATGGCTGCGTGGTAATAAAAATCCCCCTGGCCAAACGGAATGTAGGCTGCGGACTCCTTCCGCCTCTCGTAGGTGAACTCGTCAGGATGTGCCTTGTACCACCAGGCCTGTAGCTGAGCCACCGACTGGCCCAGGGTCTCCACCCCAAAGTTGTTTTGGAAGACCTGATCCACGTCCATGCAGAAGAGGAAGTCCACCTCGTGCTGGATGTGGGCCAGGATGTGCTCCCCGATGGTCTTCATGCGCATCATGCTGATGTCTTGCCACCTCTTCTCGGACTTGATCTCAAACACTTTAAAGGAACGCAGAGGACCCAGCTCTATCAAAGGCATCCTGGAGATATCATCCACCATGATGTAAAAGATGACTTTGTGGCCAACCATGAAGTATGTATTTGCAGATATTAAGAACTCCTCCAAGTAATGCTCAATGTATCTTCCGACAGCAAAAACCGTCAAGCCCACGGTAATTTTCTGTTTGGCATAATAATTATCTAAGACGGCTCTGTTGTAAGTGCCTTCCCATACCACTGGAGCCTTCCATCTGGTTATGGTCACGACCTCTGGGCGTTTCTCAGGATTAAACCAGTCCACTAGCGGAAGCTCTCCTCTGTTGTCTTCTTTTCTTTGTTCCTTTTCGTTGCCTATAGCGTCTTCTTCTTCGTGGTAACTGTGAGTCCCATTGTTAAACCAGCTCGGAAACCACCAGCCCCTCTGAGCACTGCTGCCAACTTCTGGGTTTTTTGACTGGTATATCCAGAACAAAGAACCTTCTGGGCTGTTGATGTATTCCCAAAACACAACCATTACAGTTGAGACAAGCAGCATTGACAGAACCACTCTTCCTTTGACATTCATGAATTCGATCTGCGTTCTACGGT上述序列AF221509.Sus scrofa clone.mRNA序列完全一致。
(c)擴(kuò)增后大提質(zhì)粒，與大質(zhì)粒PBHG共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，產(chǎn)生重組腺病毒Ad5-a1，3GT，進(jìn)行三輪單克隆挑選，保證病毒的均一性和穩(wěn)定性。擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，擴(kuò)大總產(chǎn)量通常在1012～1013vp(小試，80個(gè)125cm2瓶)和1014～1015vp(中試，5L發(fā)酵罐)左右。兩步層析工藝，即陰離子柱層析和凝膠過濾層析，進(jìn)行腺病毒的純化，進(jìn)行如下檢測1)提取Ad5-a1，3GT基因組，經(jīng)酶切及PCR鑒定含有目的基因a1，3GT片斷大小正確，2)病毒顆粒滴度檢測，通過OD260的檢測或點(diǎn)雜交的方法，推算(VP/ml，v.g./ml)，3)病毒感染滴度，主要有TCID50方法(IU/ml)和空斑計(jì)數(shù)法(PFU/ml)，4)純度檢測PHLC和OD260/280比值經(jīng)過純化的腺病毒，該比值應(yīng)該在1.2～1.4。過高或過低，說明殘余的雜蛋白和RNA較多，5)表達(dá)檢測，適量Ad5-a1，3GT感染人細(xì)胞(如人黑色素瘤細(xì)胞RPMI8322)，使人類細(xì)胞表達(dá)人類不具有的αGal1-3βGal1-4βGlcNAc1-R，簡稱α-Gal，用植物凝集素Griffonia Simplicifolia IB4(GSIB4)isolectin與這種半乳糖高度親和特性，進(jìn)行GSIB4-FITC染色驗(yàn)證；(d)將上述病毒顆粒制備成各種制劑，如注射液，緩沖液采用10mM TrisHCl pH8.0，2mM MgCl2，4％ sucrose，進(jìn)一步制備成產(chǎn)品，如注射針劑。
實(shí)施例2一個(gè)較好的具體實(shí)例是，腫瘤瘤體內(nèi)注射治療腫瘤，方法如下(a)豬的重組α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因腺病毒體制備成質(zhì)量合格注射制劑；然后(b)體表腫瘤瘤體內(nèi)直接注射，體內(nèi)腫瘤用介入方法完成腫瘤瘤體內(nèi)注射，劑量為10-100000vp/cell，優(yōu)選1000vp/cell，引起腫瘤細(xì)胞表面大量表達(dá)α(1，3)半乳糖基表位，激發(fā)免疫排斥反應(yīng)；(c)根據(jù)情況可重復(fù)注射，直至達(dá)到病情穩(wěn)定或清除腫瘤的目的。
實(shí)施例3豬的重組α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因腺病毒體前列腺癌靶向性改造，方法如下(a)從列腺癌中克隆純化人的前列腺癌特異性抗原基因的啟動(dòng)子，序列如下cactagagga gcaccttagg aattgacctg tggatctcaa cttcgttagg gttaaaagat60tatttgttgg gcaagggtag gaccaataac ctcattcaca atgcattcat tgattcgttg120attcacagag caaatacttc tgaacaactc ctgtgtttct ggcactgttc taggcaccag180tgatatagga gccaacaaga cagacatgtc actgctctca tggagctgca tttcagtgca240tggaggcaga aaacaaacaa acaaataaat aaataaataa ataaataaga taatttttaa300tagcaacgtg tcaacatagt gtgacgggaa ggagcatgat gagacagaag gaaggtttaa360actgggaaat ctgagaaatg gtatggttgt atgtgggttg gcattcttgc atgatgggag420tggccacctg ctttcatatt ctgaagtcag agtgttccag acagaagaaa tagcaagtgc480cgagaagctg gcatcagaaa aacagagggg agatttgtgt ggctgcagcc gagggagacc540aggaagatct gcatggtggg aaggacctga tgatacagag580(b)正確定向克隆入豬的重組α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因腺病毒重組載體，包含上述序列372 to 460，替代原有啟動(dòng)子。
實(shí)施例4豬的重組α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因腺病毒體修飾腫瘤細(xì)胞疫苗制備和應(yīng)用，方法如下(a)培養(yǎng)擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞，用豬的重組α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因腺病毒體(1000vp/cell)轉(zhuǎn)染；(b)篩選轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞陽性克隆或不篩選，物理或化學(xué)方法進(jìn)有效周期抑制，優(yōu)選gamma射線照射方法；(c)用緩沖液(10mM Tris HCl pH8.0，2mM MgCl2，4％ sucrose)制成腫瘤細(xì)胞疫苗制劑，即用或-80度凍存；(d)上述腫瘤疫苗制劑應(yīng)用部位和方法不固定，如果是實(shí)體瘤，優(yōu)先選擇腫瘤附近，注射方式可選擇皮下，顱內(nèi)，皮內(nèi)，靜脈內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)等注射方式，優(yōu)選肌內(nèi)注射方式。
序列表<110>泉?jiǎng)?，?yán)<120>α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶重組載體、病毒體及其制備和應(yīng)用<130>
<140>200510080551.4<141>20050705<160>2<170>PatentIn Version 3.1<210>1<211>1116<212>DNA<213>豬屬，馴化豬種(Sus scrofa，domestic pig)<220>
<221>CDS<400>1atgaatgtca aaggaagagt ggttctgtca atgctgcttg tctcaactgt aatggttgtg 60ttttgggaat acatcaacag cccagaaggt tctttgttct ggatatacca gtcaaaaaac120ccagaagttg gcagcagtgc tcagaggggc tggtggtttc cgagctggtt taacaatggg180actcacagtt accacgaaga agaagacgct ataggcaacg aaaaggaaca aagaaaagaa240gacaacagag gagagcttcc gctagtggac tggtttaatc ctgagaaacg cccagaggtc300gtgaccataa ccagatggaa ggctccagtg gtatgggaag gcacttacaa cagagccgtc360
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權(quán)利要求
1.一種重組載體，是載體基因和α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶表達(dá)編碼區(qū)的重組體，通過基因工程和細(xì)胞工程方法制備，能夠在靶細(xì)胞或宿主細(xì)胞中表達(dá)α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶，用于非特異性腫瘤、疣、胬肉等新生物治療或器官特異性啟動(dòng)子等指導(dǎo)的靶向性治療以及用于對(duì)腫瘤、疣、胬肉等新生物細(xì)胞進(jìn)行免疫修飾，制成疫苗進(jìn)行預(yù)防。
2.權(quán)利要求1所述的載體，其特征是該重組體的載體可以為質(zhì)粒載體，DNA病毒或RNA病毒載體的任何一種，其優(yōu)選載體為腺病毒載體或含有腺病毒載體序列的復(fù)合載體；最優(yōu)選載體為腺病毒載體。
3.權(quán)利要求1所述的載體，其特征是該重組體的基因表達(dá)盒是由啟動(dòng)子-包含α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因cDNA-多聚嘌呤核苷酸構(gòu)成的特征序列。
4.權(quán)利要求3所述的載體，其特征是所述基因表達(dá)盒的上游為任一真核細(xì)胞啟動(dòng)子、原核細(xì)胞啟動(dòng)子或病毒啟動(dòng)子，下游為任何真核基因的多聚嘌呤核苷酸。
5.權(quán)利要求2所述的載體，其特征是腺病毒復(fù)制的必須基因缺失，引入α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)框，所述α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因可以是α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因的任何一種，最優(yōu)選的基因?yàn)樨iα(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因。
6.權(quán)利要求2所述的載體，其特征是腺病毒載體的E1A和E1B區(qū)缺失，引入α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)框。
7.權(quán)利要求1所述的載體，其特征是應(yīng)用時(shí)采用任何合適的可接受的藥理學(xué)劑型或/和給藥方式。
8.挽救野生型α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶功能缺失的細(xì)胞的方法是一定量的權(quán)利要求1所述的重組載體通過接觸并進(jìn)入野生型α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因缺失的細(xì)胞，在細(xì)胞中有效表達(dá)野生型α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶蛋白來挽救細(xì)胞。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其特征是α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶功能缺失的細(xì)胞是α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因缺失的細(xì)胞，α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶功能缺失的細(xì)胞是人或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
10.一種生產(chǎn)重組腺病毒的方法，包括(a)將含有表達(dá)α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶元件的腺病毒質(zhì)粒載體用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞；并且(b)分析培養(yǎng)的宿主細(xì)胞出現(xiàn)的細(xì)胞病變效應(yīng)，監(jiān)測同源重組的病毒產(chǎn)量。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其特征是這種腺病毒質(zhì)粒具有復(fù)制缺限，而宿主細(xì)胞能夠彌補(bǔ)這種缺陷；這種腺病毒質(zhì)粒缺失功能性E1A和E1B基因，而宿主細(xì)胞是功能性能E1基因表達(dá)細(xì)胞；這種宿主細(xì)胞是293細(xì)胞，這種宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基是MEM培養(yǎng)基。
12.權(quán)利要求1所述的載體，用于新生物治療或制備疫苗預(yù)防新生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說是涉及一種α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶重組載體，特征是該重組體的基因表達(dá)盒是由啟動(dòng)子－包含α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因cDNA－多聚嘌呤核苷酸構(gòu)成的特征序列，能夠高效感染人的各種靶細(xì)胞，使之表達(dá)α(1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶，引起靶細(xì)胞表面大量表達(dá)半乳糖表位，激發(fā)免疫排斥反應(yīng)，達(dá)到清除靶細(xì)胞的目的。制備方法主要應(yīng)用基因克隆，純化，重組，表達(dá)等基因工程和細(xì)胞工程技術(shù)。這種載體可以用于腫瘤、疣、胬肉等新生物的基因治療或/和免疫治療，以及用于腫瘤、疣、胬肉等新生物細(xì)胞進(jìn)行免疫修飾，制成疫苗進(jìn)行預(yù)防。
文檔編號(hào)C12N15/861GK1891829SQ20051008055
公開日2007年1月10日 申請(qǐng)日期2005年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月5日
發(fā)明者嚴(yán)泉?jiǎng)?申請(qǐng)人:嚴(yán)泉?jiǎng)?br>