專利名稱：一種ɑ-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，涉及一種糖基轉(zhuǎn)移酶，具體涉及一種a -1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白，其催化a-半乳糖表位的形成。
背景技術(shù)：
a -I，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶存在于一些動物如牛，鼠等體內(nèi)，人類不具備此酶。該酶在特定的底物上形成a -1，3半乳糖基后成為一種能被人體內(nèi)天然存在的抗體所識別的表位，此表位通常稱為a-半乳糖表位；這是人類異體移植產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)的生物學(xué)基礎(chǔ)，因此，a -1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶可用于合成抗免疫排斥反應(yīng)的藥物。 后來研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過該酶修飾處理后的人體腫瘤細(xì)胞等能更有效地被自身免疫系統(tǒng)所識別，進(jìn)而更有效地被清除，這種修飾的細(xì)胞或細(xì)胞碎片因此被稱為自體疫苗。基于上述原因，提供大量并有活性的a-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶具商業(yè)意義。到目前為止，a -I，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在細(xì)菌中表達(dá)均形成包涵體，或絕大部分形成包涵體，即不可溶的非活性的狀態(tài)。雖然利用蛋白質(zhì)的復(fù)性及變性方法可以改變蛋白質(zhì)的不可溶的非活性的狀態(tài)，但其費(fèi)時費(fèi)力，效果差且污染環(huán)境。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題為不采用蛋白質(zhì)的復(fù)性及變性技術(shù)方案而實(shí)現(xiàn)a_l，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在細(xì)菌中具生物活性的可溶性表達(dá)。本發(fā)明的一個目的是提供一種融合蛋白，由TRX蛋白與a -I，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合形成，具有催化a -半乳糖表位形成活性。硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)是一種具有氧化還原活性的小分子蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量12kD，廣泛存在于所有生物體中。作為機(jī)體內(nèi)一種重要的氧化還原調(diào)節(jié)蛋白，硫氧還蛋白(TRX)具有多種生物學(xué)功能。TRX是非常有效的自由基清除劑，能保護(hù)細(xì)胞免受諸如腫瘤壞死因子(TNF)以及H2O2等引起的氧化損傷。此外，TRX還通過修復(fù)受損傷的蛋白、抑制凋亡和調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)對細(xì)胞起保護(hù)作用。目前研究證實(shí)TRX在組織的缺血再灌注損傷和神經(jīng)退行性病變的防治中發(fā)揮了重要作用。在實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)方案過程中，具體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計和實(shí)施方式可以是在本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的知識和方法范圍內(nèi)作任何等同的替代或變換或改變，并不限于該申請文件所具體陳述的范圍。例如，a-l，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因，除了通常用全長基因外，還可以用其功能域。我們已用了一種功能域，當(dāng)然還有其他氨基酸多一些或少一些的功能域，只要功能域保持催化a-半乳糖表位形成的功能(催化結(jié)構(gòu)功能)即可。類似等同的替代或變換或改變，在此不--列舉。作為優(yōu)選，所述a -I，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶包括其催化結(jié)構(gòu)功能域a I, 3GTcd部分。更優(yōu)選地，所述a _1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶還包括用于純化的序列。為了進(jìn)一步簡化a _1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白的純化，本發(fā)明所述融合蛋白還可以包含任何本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知的例如GST或His-tag等蛋白或結(jié)構(gòu)功能域。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，a -1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的上游設(shè)計選擇了 His-tag以便后續(xù)純化之用，當(dāng)然His-tag也可設(shè)計在整個融合蛋白的上游或下游，或者使用其他純化功能的蛋白序列。本發(fā)明所述的融合蛋白，其為可溶狀態(tài)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，提供的融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。本發(fā)明為了避免包涵體的形成，直接在細(xì)菌中產(chǎn)生可溶性的具有酶學(xué)活性的蛋白，采取了如下技術(shù)方案克隆a _1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因，把該基因直接克隆到常用的表達(dá)載體上，結(jié)果形成了包涵體；更改不同的載體或者更改不同的受體菌仍然形成包涵體；接著，借助于蛋白融合技術(shù)，把該基因與TRX基因，即一種氧化還原蛋白thioredoxin基因融合在一起,使 a _1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶以融合蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果該融合蛋白在通常的各種培養(yǎng)條件下均形成可溶性表達(dá)，并且重要的是該融合蛋白完全具有a -1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性。另外，本發(fā)明所述融合蛋白的表達(dá)量較高，占可溶性細(xì)菌裂解物的20%以上。本發(fā)明還提供產(chǎn)生根據(jù)所述a _1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白的細(xì)菌。作為優(yōu)選，其為大腸桿菌DH5a或大腸桿菌BL21 (DE3)。本發(fā)明的又一個目的是提供一種生產(chǎn)所述a -I，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白的方法。目前常用的是重組DNA技術(shù)，一般包括四步①獲得目的基因； 與克隆載體連接，形成新的重組DNA分子用重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，并能在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺傳；④對轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定。⑤對獲得外源基因的細(xì)胞或生物體通過培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。作為優(yōu)選，所述方法為制備包含a-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因與TRX基因的重組DNA,將所述重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，培養(yǎng)獲得a -1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的融合蛋白。更優(yōu)選地，所述重組DNA包括用于純化的DNA序列部分。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中提供的產(chǎn)生方法，具體步驟為步驟I、以如SEQ ID No. I所示序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其上游引物序列如SEQID No. 4所示；下游引物序列如SEQ ID No. 5所示；步驟2 :將PCR產(chǎn)物與pET_32a質(zhì)粒載體用KpnI及XhoI兩種限制性內(nèi)切酶的作用下酶切；步驟3 :在T4DNA連接酶的作用下，連接載體與基因；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，培養(yǎng)獲得a-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的融合蛋白。作為優(yōu)選所述細(xì)菌為大腸桿菌DH5 a或大腸桿菌BL21 (DE3)。本發(fā)明借助于蛋白融合技術(shù)，把a(bǔ)-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因與TRX基因，即一種氧化還原蛋白thioredoxin基因融合在一起,使a-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶以融合蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)，并形成可溶性表達(dá)，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明所述融合蛋白完全具有a-l，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性，且表達(dá)量較高，占可溶性細(xì)菌裂解物的20%以上，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前
旦
o


圖I為本發(fā)明所述a _1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白的純化凝膠電泳照片，其中，第I欄分子量標(biāo)準(zhǔn)；第2欄菌體總蛋白；
第3欄菌體破碎離心后的上清蛋白；第4欄純化的a -I，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白；第5欄純化的a -I，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開了一種a _1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白及制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述的a-l，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白及制備方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施例I克隆a -I，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因利用本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法，我們克隆到的a -1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列如SEQ ID No. I所示，該基因所對應(yīng)的a-l，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列如SEQID No. 2所示。為了后續(xù)克隆的方便，基因的上游加有NdeI等限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，基因的下游加有BamHI位點(diǎn)。實(shí)施例2a-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)克隆的構(gòu)建將上述實(shí)施例I所克隆到的a -1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因用PCR的方法引入限制性內(nèi)切酶NdeI和BamHI的酶切位點(diǎn)，所用的上游引物序列為5’GAATACCATATGGAAAGCAAGCTTAAGCTATCG3’ ；下游引物序列為5 ’ GAAGGATCCTTATCAGACATTAITTCTAAC3 ’。將回收后的 PCR產(chǎn)物，pET-15b質(zhì)粒載體均用NdeI (NEB)及BamHI (NEB)兩種限制性內(nèi)切酶作用下酶切3小時；瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果后回收載體及基因片段；在了40嫩連接酶(NEB)的作用下，連接該載體與該基因；將連接產(chǎn)物直接加入到冰浴融化的大腸桿菌DH5 a的感受態(tài)中，孵育30分鐘后42°C水浴熱擊轉(zhuǎn)化；最后篩選的轉(zhuǎn)化子用測序驗(yàn)證序列正確的a -1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)克隆。實(shí)施例3a -I，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶與TRX融合表達(dá)克隆的構(gòu)建將上述實(shí)施例I所克隆到的a -1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因用PCR的方法引入限制性內(nèi)切酶KpnI和XhoI的酶切位點(diǎn)，所用的上游引物序列為5’ GAATACGGTACCGAAAGCAAGCTTAAGCTATCG3’(序列如 SEQ ID No. 4 所示)；下游引物序列為
5’ GAACTCGAGTTATCAGACATTAITTCTAAC3’(序列如 SEQ ID No. 4 所示)；將回收后的PCR產(chǎn)物與pET_32a質(zhì)粒載體均用KpnI及XhoI兩種限制性內(nèi)切酶的作用下酶切3小時；瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果后回收載體及基因；在T4DNA連接酶(NEB)的作用下，連接載體與基因；將連接產(chǎn)物直接加入到冰浴融化的大腸桿菌DH5 a的感受態(tài)中，孵育30分鐘后42°C水浴熱擊轉(zhuǎn)化；最后篩選的轉(zhuǎn)化子用測序驗(yàn)證序列正確的a -1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白表達(dá)克隆。本實(shí)施例選擇pET_32a質(zhì)粒載體是利用其上游含有TRX基因序列；當(dāng)然也可以把TRX基因用PCR方法插于到其他含有a-I，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列的載體上，可以同樣實(shí)現(xiàn)a-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白表達(dá)克隆構(gòu)建的目的。實(shí)施例4a -I，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶克隆的I升表達(dá)把上述實(shí)施例2已證實(shí)的a-I，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)克隆DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL2KDE3)，然后從LB平板上挑取單菌落，挑取的單菌落在4毫升含有50微克/毫升的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，過夜培養(yǎng)物隨后按1:250的比例加入到2個500毫升的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)18小時以上，然后4°C離心收集培養(yǎng)物，沉淀的菌體用超聲波破碎儀處理，4°C離心收集上清，取上清經(jīng)SDS-PAGE檢測表達(dá)狀況表明表達(dá)的絕大部分或全部為不可溶的包涵體。實(shí)施例5a-I，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白克隆的I升表達(dá)把上述實(shí)施例3已證實(shí)的a -1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白表達(dá)克隆DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL2KDE3)，后從LB平板上挑取單菌落，挑取的單菌落在4毫升含有50微克/毫升的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，過夜培養(yǎng)物隨后按1:250的比例加入到2個500毫升的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)18小時以上，然后4°C離心收集培養(yǎng)物，沉淀的菌體用超聲波破碎儀處理，4°C離心收集上清，取該上清經(jīng)SDS-PAGE檢測該a -I，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白克隆的表達(dá)表明表達(dá)的絕大部分或全部為可溶狀態(tài)。實(shí)施例6a-1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白的純化上述實(shí)施例5制得的上清加載于已用5倍床體積的平衡液處理的鎳親和層吸住中，上清加完后用10倍床體積的平衡液除去未結(jié)合或非特異結(jié)合的細(xì)菌蛋白或其他雜質(zhì)，a -1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白最后用含200mM咪唑的洗脫液獲得。該融合蛋白經(jīng)此一步親和層析的純度達(dá)80%以上，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。該融合蛋白透析后可以直接用于a-l，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶生物活力的測定。當(dāng)然，進(jìn)一步利用例如凝膠過濾層析等方法可使該融合蛋白得到進(jìn)一步純化，酶的比活力得到相應(yīng)的提高。另外，由于我們選擇的pET_32a質(zhì)粒載體在TRX與插入的a-l，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶之間含有凝血酶的識別位點(diǎn)，所以可以用凝血酶把a(bǔ) -1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶功能域釋放出來；也可以選擇設(shè)計其他用途類似的蛋白內(nèi)切酶類來到達(dá)同樣的目的。是否釋放則完全依賴具體商業(yè)目的，因?yàn)樵揳-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白具有游離的a-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶所具有的催化功能。實(shí)施例7
a -I，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白的活性測定用96孔板培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞至合適密度；用4%PFA (多聚甲醛)室溫固定A549細(xì)胞30分鐘，用PBS洗兩次，每次5分鐘；然后用神經(jīng)氨酸酶在37°處理20分鐘，室溫下PBS洗兩次；在室溫下加入100微升含IOmM TrisHCl pH7. 0，IOmM氯化錳，0. 1%牛血清白蛋白，0. 3mM尿嘧啶二磷酸-半乳糖的緩沖液，同時加入適量的上述實(shí)施例6純化的a -I，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白，該反應(yīng)置37°下25分鐘；后用IOOmM EDTA的二鈉鹽終止反應(yīng)。隨后即按通常的ELISA反應(yīng)測定a _1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的活力。在與未加入該融合蛋白的對照孔相比，加入上述實(shí)施例6純化的a-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白的反應(yīng)孔即呈顯色反應(yīng)，表明具 催化a-半乳糖表位形成的活性，亦可作進(jìn)一步定量分析。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，其特征在于，由TRX蛋白與a-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合形成，具有催化a-半乳糖表位形成活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的融合蛋白，其特征在于所述a-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶包括其催化結(jié)構(gòu)功能域ct I, 3GTcd部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的融合蛋白，其特征在于所述a-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶還包括用于純化的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的融合蛋白，其特征在于所述用于純化的序列為GST或His-tag結(jié)構(gòu)域。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的融合蛋白，其特征在于其為可溶狀態(tài)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的融合蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQID、No. 3所示。
7.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述融合蛋白的細(xì)菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的細(xì)菌，其特征在于，其為大腸桿菌DH5a或大腸桿菌BL21(DE3)。
9.一種生產(chǎn)權(quán)利要求I至6任一項所述融合蛋白的方法。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于制備包含a-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因與TRX基因的重組DNA，將所述重組DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，培養(yǎng)獲得a_l，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的融合蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于所述重組DNA包括用于純化的DNA序列部分。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于具體步驟為 步驟I、以如SEQ ID No. I所示序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其上游引物序列如SEQ IDNo. 4所示；下游引物序列如SEQ ID No. 5所示; 步驟2 :將PCR產(chǎn)物與pET-32a質(zhì)粒載體用KpnI及XhoI兩種限制性內(nèi)切酶的作用下酶切； 步驟3 :在T4DNA連接酶的作用下，連接載體與基因；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，培養(yǎng)獲得a-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的融合蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于所述細(xì)菌為大腸桿菌DH5ci或大腸桿菌 BL21 (DE3)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白及其制備方法。本發(fā)明所述α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白包含TRX，催化α-半乳糖表位形成。本發(fā)明還提供產(chǎn)生該α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白的細(xì)菌。本發(fā)明所述融合蛋白完全具有α-1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性，為可溶性表達(dá)且表達(dá)量較高，占可溶性細(xì)菌裂解物的20%以上，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/19GK102703399SQ20121019513
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月13日
發(fā)明者云升, 王云虹, 蔡傳奇, 郭海軍, 閆宇鵬 申請人:北京京蒙高科干細(xì)胞技術(shù)有限公司