專利名稱：一種小鼠淋巴細(xì)胞誘變方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小鼠淋巴細(xì)胞誘變方法。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞作為機(jī)體組成的起源細(xì)胞，具有多向分化潛能和自我復(fù)制能力的原始未分化細(xì)胞，是形成哺乳類各組織器官的祖宗細(xì)胞。干細(xì)胞在形態(tài)上通常具有共性，呈現(xiàn)出圓形或橢圓形形態(tài)，干細(xì)胞體積較小，細(xì)胞核相對較高大。干細(xì)胞作為一種尚未充分分化和成熟的細(xì)胞，在誘導(dǎo)環(huán)境條件下具有形成各種組織器官組成細(xì)胞的潛在功能，被醫(yī)學(xué)界稱之為“萬能細(xì)胞”。干細(xì)胞的用途非常廣泛，涉及到醫(yī)學(xué)的多個(gè)領(lǐng)域。干細(xì)胞具有較強(qiáng)的自我更新和增殖能力，目前已成為轉(zhuǎn)基因的載體細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ES細(xì)胞)則具有二倍體生殖嵌合和四倍體互補(bǔ)誕生后代的能力，為動(dòng)物的遺傳育種和新品種培育奠定了基礎(chǔ)，ES細(xì)胞還具有在體外誘導(dǎo)分化形成精子和卵子的能力，因此，是一種重要的遺傳資源用于動(dòng)物生殖發(fā)育的各個(gè)方面。獲得來源于自身機(jī)體遺傳性能一致的干細(xì)胞是當(dāng)前干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)，2006年日本科研人員Takahashi第一次報(bào)道通過外源性導(dǎo)入四種限定基因0ct4、Sox2、c_Myc和Klf4使小鼠皮膚成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPS細(xì)胞)后，到目前為止，已從包括人、猴、大鼠、豬和牛等多個(gè)物種、多種類型體細(xì)胞中成功誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS細(xì)胞，從而人類能夠成功使成體細(xì)胞重編程形成干細(xì)胞。但是，研究發(fā)現(xiàn)iPS細(xì)胞的產(chǎn)生過程中需要病毒介導(dǎo)限定基因才能夠獲得成功。因此，病毒作為潛在的致癌因子限制了 iPS細(xì)胞的臨床應(yīng)用。目前，尋找一種無公害體細(xì)胞形成干細(xì)胞的自然誘導(dǎo)方法是當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種小鼠淋巴細(xì)胞誘變方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種小鼠淋巴細(xì)胞誘變方法，包括以下步驟
(1)淋巴細(xì)胞的分離
取綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠，綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠為商品化轉(zhuǎn)基因小鼠，頸部脫臼處死，酒精腹部消毒，在無菌條件下打開腹腔，取出小鼠脾臟，PBS液洗滌后，在200目尼龍網(wǎng)膜內(nèi)輕輕研磨形成單個(gè)細(xì)胞，并經(jīng)PBS液洗滌后收集，離心去上清液，用無血清DMEM培養(yǎng)液重懸備用；
(2)小鼠ES細(xì)胞的培養(yǎng) 取12. 5天小鼠胎兒成纖維細(xì)胞用高糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿后，用含2. 5 mg/ml胰酶-0. 2mg/mlEDTA的細(xì)胞消化液消化傳代培養(yǎng)，取鋪滿培養(yǎng)皿的胎兒成纖維細(xì)胞用10 U g/ml的絲裂霉素作用2. 5小時(shí)，用含2. 5 mg/ml胰酶-0. 2 mg/ml EDTA的細(xì)胞消化液消化后接種至0. 1%明膠處理的培養(yǎng)皿上于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，取接種后第3天均勻鋪滿培養(yǎng)皿的細(xì)胞用作飼養(yǎng)層；小鼠ES細(xì)胞Rl細(xì)胞系為商品化細(xì)胞系，取第26代小鼠ES細(xì)胞Rl細(xì)胞系接種到小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，添加含1000 U/ml HF的高糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，小鼠ES細(xì)胞每兩天傳代一次；
(3)淋巴細(xì)胞與ES細(xì)胞的融合
用含2. 5 mg/ml胰酶-0. 2 mg/ml EDTA的細(xì)胞消化液消化小鼠ES細(xì)胞，收集離心去上清液，用無血清DMEM培養(yǎng)液重懸，把小鼠淋巴細(xì)胞與ES細(xì)胞按I :2 10比例進(jìn)行混勻，離心去上清液，用50%PEG溶液進(jìn)行作用90秒，無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋重選，離心去上清液，添加含1000 U/ml LIF的高糖DMEM培養(yǎng)液，接種細(xì)胞于小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng);
(4)誘變細(xì)胞的分離培養(yǎng)
培養(yǎng)2天后，熒光顯微鏡下選擇表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞集落，在顯微鏡下分選細(xì)胞克隆集落，接種到新的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，添加含1000 U/ml LIF的高糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞集落在飼養(yǎng)層上生長2天后，用含2. 5 mg/ml胰酶-0.2 mg/ml EDTA的細(xì)胞消化液消化細(xì)胞集落，重新接種細(xì)胞于小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。本發(fā)明的有益效果是
淋巴細(xì)胞作為動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的一種重要組成細(xì)胞，具有來源廣泛、取材方面等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明借助細(xì)胞融合技術(shù)誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)變形成干細(xì)胞，形成的干細(xì)胞具有小鼠ES細(xì)胞的形態(tài)、基因表達(dá)、體外分化能力等特征，有效避免了病毒在干細(xì)胞誘導(dǎo)中的潛在危害。因此，該方法將為小鼠體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成干細(xì)胞并得到廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，同時(shí)，也為動(dòng)物或人類的干細(xì)胞研究和利用提供重要借鑒。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。圖I是本發(fā)明小鼠淋巴細(xì)胞誘變方法實(shí)施例的淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)形成的干細(xì)胞集落形態(tài)。
具體實(shí)施例方式I試驗(yàn)材料與方法 1.1淋巴細(xì)胞的分離
取綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠，綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠為商品化轉(zhuǎn)基因小鼠，頸部脫臼處死，酒精腹部消毒，在無菌條件下打開腹腔，取出小鼠脾臟，PBS液洗滌后，在200目尼龍網(wǎng)膜內(nèi)輕輕研磨形成單個(gè)細(xì)胞，并經(jīng)PBS液洗滌后收集，離心去上清液，用無血清DMEM培養(yǎng)液重懸備用。I. 2小鼠ES細(xì)胞的培養(yǎng)
取12. 5天小鼠胎兒成纖維細(xì)胞用高糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿后，用含2. 5 mg/ml胰酶-0. 2mg/mlEDTA的細(xì)胞消化液消化傳代培養(yǎng)，取鋪滿培養(yǎng)皿的胎兒成、纖維細(xì)胞用10 U g/ml的絲裂霉素作用2. 5小時(shí)，用含2. 5 mg/ml胰酶-0. 2 mg/ml EDTA的細(xì)胞消化液消化后接種至0. 1%明膠處理的培養(yǎng)皿上于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，取接種后第3天均勻鋪滿培養(yǎng)皿的細(xì)胞用作飼養(yǎng)層；小鼠ES細(xì)胞Rl細(xì)胞系為商品化細(xì)胞系，取第26代小鼠ES細(xì)胞Rl細(xì)胞系接種到小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，添加含1000 U/ml HF的高糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，小鼠ES細(xì)胞每兩天傳代一次。1.3淋巴細(xì)胞與ES細(xì)胞的融合
用含2. 5 mg/ml胰酶-0.2 mg/ml EDTA的細(xì)胞消化液消化小鼠ES細(xì)胞，收集離心去上清液，用無血清DMEM培養(yǎng)液重懸，把小鼠淋巴細(xì)胞與ES細(xì)胞按I :2 10比例進(jìn)行混勻，離心去上清液，用50%PEG溶液進(jìn)行作用90秒，無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋重選，離心去上清液，添加含1000 U/ml LIF的高糖DMEM培養(yǎng)液，接種細(xì)胞于小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng)。1.4誘變細(xì)胞的分離培養(yǎng)培養(yǎng)2天后，熒光顯微鏡下選擇表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞集落，在顯微鏡下分選細(xì)胞克隆集落，接種到新的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，添加含1000 U/ml LIF的高糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞集落在飼養(yǎng)層上生長2天后，用含2. 5 mg/ml胰酶-0.2 mg/ml EDTA的細(xì)胞消化液消化細(xì)胞集落，重新接種細(xì)胞于小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。1.5誘變細(xì)胞集落的干細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)鑒定
細(xì)胞集落經(jīng)4%多聚甲醛固定，1%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉30分鐘，添加一抗為兔抗0ct4、山羊抗Nanog、小鼠抗SSEAl按I :200稀釋后4°C孵育過夜。PBS液洗3次，CY3紅色熒光標(biāo)記的二抗按I :200稀釋后室溫避光孵育I h，PBS液洗3次，用I ii g/ml的DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色I(xiàn)min后熒光鏡下觀察結(jié)果。
I. 6誘變細(xì)胞集落的體外分化能力鑒定
細(xì)胞集落用PBS液洗滌，加入含2. 5 mg/ml胰酶的細(xì)胞消化液放置于培養(yǎng)箱消化3min，用手輕輕震動(dòng)拍打培養(yǎng)皿，收集脫落的細(xì)胞集落，離心，PBS液洗滌，再離心后用去除1000 U/ml LIF的高糖DMEM培養(yǎng)液重懸，接種細(xì)胞至低貼附的細(xì)菌培養(yǎng)皿中培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；接種培養(yǎng)的第2天，從低貼附的細(xì)菌培養(yǎng)皿中連同擬胚體一起將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫靜止，待細(xì)胞集落形成的擬胚體自然沉淀到離心管底后，轉(zhuǎn)移擬胚體接種到新的低貼附的細(xì)菌培養(yǎng)皿中，補(bǔ)加去除1000 U/ml LIF的高糖DMEM培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。擬胚體在低貼附的細(xì)菌培養(yǎng)皿中培養(yǎng)一周后，從低貼附的細(xì)菌培養(yǎng)皿中連同擬胚體一起將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫靜止，待細(xì)胞集落形成的擬胚體自然沉淀到離心管底后，轉(zhuǎn)移擬胚體接種到明膠包被的普通細(xì)胞培養(yǎng)皿中，補(bǔ)加去除1000 U/ml LIF的高糖DMEM培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一周后即可用于體外三胚層分化能力檢測。2試驗(yàn)結(jié)果
2.1誘變細(xì)胞集落的生長狀態(tài)
小鼠脾臟是B淋巴細(xì)胞的發(fā)源地，從小鼠脾臟分離的B淋巴細(xì)胞為單個(gè)細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)不具有增殖能力，通常情況下細(xì)胞很快發(fā)生死亡，綠色熒光蛋白標(biāo)記的B淋巴細(xì)胞同小鼠ES細(xì)胞融合后，淋巴細(xì)胞能夠迅速增殖并表達(dá)綠色熒光蛋白，因此，形成表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞集落，從顯微鏡下分離的細(xì)胞集落經(jīng)過重新接種和消化增殖培養(yǎng)，細(xì)胞逐步增殖形成大量的表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞集落，細(xì)胞集落向上突起表現(xiàn)出鳥巢狀形態(tài)(圖I )，細(xì)胞集落中的細(xì)胞核較大，細(xì)胞集落在含1000 U/ml HF的高糖的DMEM培養(yǎng)液中生長迅速，細(xì)胞集落狀態(tài)較好，細(xì)胞集落突出飼養(yǎng)層表面比較明顯，細(xì)胞集落每2天傳代一次，經(jīng)過多次消化傳代細(xì)胞集落仍然表現(xiàn)出穩(wěn)定的生長性能，一致的細(xì)胞集落形態(tài)，凍存和復(fù)蘇對誘變細(xì)胞集落的生長性能沒有明顯影響。2. 2誘變細(xì)胞集落的干細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)
誘變的細(xì)胞集落在含1000 U/ml HF的高糖DMEM培養(yǎng)液中生長性能穩(wěn)定，經(jīng)過4%多聚甲醛固定及免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測分析之后顯示，干細(xì)胞集落表達(dá)小鼠ES細(xì)胞特異性的干細(xì)胞標(biāo)記0ct4、Nanog和SSEA1,其中0ct4和Nanog在細(xì)胞中為核表達(dá),檢測結(jié)果與干細(xì)胞特異性標(biāo)記和核特異性染料DAPI的結(jié)果一致。SSEAl表達(dá)在誘變細(xì)胞的細(xì)胞膜表面，這是在目前所發(fā)現(xiàn)的淋巴細(xì)胞誘變后細(xì)胞集落中比較獨(dú)特的干細(xì)胞特征，淋巴細(xì)胞不表達(dá)這些干細(xì)胞標(biāo)記，結(jié)果顯示出淋巴細(xì)胞經(jīng)過誘變后在細(xì)胞特性方面發(fā)生了特征性變化，基因表達(dá)呈現(xiàn)出獨(dú)特性。2.3誘變細(xì)胞集落體外三個(gè)胚層的分化
淋巴細(xì)胞誘變形成的干細(xì)胞集落在含1000 U/ml HF的高糖DMEM培養(yǎng)液中生長性能穩(wěn)定，制作擬胚體經(jīng)過7天懸浮培養(yǎng)和7天貼壁培養(yǎng)之后，經(jīng)過4%多聚甲醛固定及免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測分析之后顯示，誘變形成的干細(xì)胞集落在體外能夠自發(fā)向機(jī)體內(nèi)三個(gè)胚層細(xì)胞進(jìn)行分化，在干細(xì)胞擬胚體中，部分細(xì)胞分化形成外胚層神經(jīng)細(xì)胞，表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞特異性抗體神經(jīng)纖維表達(dá)檢測為陽性，部分細(xì)胞分化形成中胚層肌肉細(xì)胞，表現(xiàn)為肌肉細(xì)胞特異性抗體a-肌動(dòng)蛋白表達(dá)檢測為陽性，并且肌肉細(xì)胞形成環(huán)形的括約肌形態(tài)。在擬胚體中部分細(xì)胞分化表達(dá)內(nèi)胚層肝臟細(xì)胞特異性標(biāo)記甲胎蛋白，分析檢測證實(shí)誘變形成的干細(xì)胞集落具有向機(jī)體三個(gè)胚層分化的能力，呈現(xiàn)出干細(xì)胞特有的特征。以上所述的本發(fā)明實(shí)施方式，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。任何在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種小鼠淋巴細(xì)胞誘變方法，其特征在于包括以下步驟 (1)淋巴細(xì)胞的分離 取綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠，綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠為商品化轉(zhuǎn)基因小鼠，頸部脫臼處死，酒精腹部消毒，在無菌條件下打開腹腔，取出小鼠脾臟，PBS液洗滌后，在200目尼龍網(wǎng)膜內(nèi)輕輕研磨形成單個(gè)細(xì)胞，并經(jīng)PBS液洗滌后收集，離心去上清液，用無血清DMEM培養(yǎng)液重懸備用； (2)小鼠ES細(xì)胞的培養(yǎng) 取12. 5天小鼠胎兒成纖維細(xì)胞用高糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿后，用含2. 5 mg/ml胰酶_0. 2mg/ml EDTA的細(xì)胞消化液消化傳代培養(yǎng)，取鋪滿培養(yǎng)皿的胎兒成纖維細(xì)胞用10 U g/ml的絲裂霉素作用2. 5小時(shí)，用含2. 5 mg/ml胰酶-0. 2 mg/ml EDTA的細(xì)胞消化液消化后接種至0. 1%明膠處理的培養(yǎng)皿上于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，取接種后第3天均勻鋪滿培養(yǎng)皿的細(xì)胞用作飼養(yǎng)層；小鼠ES細(xì)胞Rl細(xì)胞系為商品化細(xì)胞系，取第26代小鼠ES細(xì)胞Rl細(xì)胞系接種到小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，添加含1000 U/ml HF的高糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，小鼠ES細(xì)胞每兩天傳代一次； (3)淋巴細(xì)胞與ES細(xì)胞的融合 用含2. 5 mg/ml胰酶-0. 2 mg/ml EDTA的細(xì)胞消化液消化小鼠ES細(xì)胞，收集離心去上清液，用無血清DMEM培養(yǎng)液重懸，把小鼠淋巴細(xì)胞與ES細(xì)胞按I :2 10比例進(jìn)行混勻，離心去上清液，用50%PEG溶液進(jìn)行作用90秒，無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋重選，離心去上清液，添加含1000 U/ml LIF的高糖DMEM培養(yǎng)液，接種細(xì)胞于小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng); (4)誘變細(xì)胞的分離培養(yǎng) 培養(yǎng)2天后，熒光顯微鏡下選擇表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞集落，在顯微鏡下分選細(xì)胞克隆集落，接種到新的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，添加含1000 U/ml LIF的高糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞集落在飼養(yǎng)層上生長2天后，用含2. 5 mg/ml胰酶-0.2 mg/ml EDTA的細(xì)胞消化液消化細(xì)胞集落，重新接種細(xì)胞于小鼠胎兒成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小鼠淋巴細(xì)胞誘變方法，包括以下步驟(1)淋巴細(xì)胞的分離；(2)小鼠ES細(xì)胞的培養(yǎng)；(3)淋巴細(xì)胞與ES細(xì)胞的融合；(4)誘變細(xì)胞的分離培養(yǎng)。淋巴細(xì)胞作為動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的一種重要組成細(xì)胞，具有來源廣泛、取材方面等優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明借助細(xì)胞融合技術(shù)誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)變形成干細(xì)胞，形成的干細(xì)胞具有小鼠ES細(xì)胞的形態(tài)、基因表達(dá)、體外分化能力等特征，有效避免了病毒在干細(xì)胞誘導(dǎo)中的潛在危害。因此，該方法將為小鼠體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成干細(xì)胞并得到廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，同時(shí)，也為動(dòng)物或人類的干細(xì)胞研究和利用提供重要借鑒。
文檔編號C12N15/06GK102703423SQ201210195070
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月14日
發(fā)明者劉亞, 張運(yùn)海, 方富貴, 曹鴻國, 李運(yùn)生, 楊盼, 章孝榮, 蒲勇, 陶勇 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)