專(zhuān)利名稱(chēng)：一種小鼠口腔癌及淋巴道轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種口腔癌及淋巴道轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型構(gòu)建方法，具體說(shuō)，是涉及一種小鼠口腔癌及淋巴道轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
口腔癌是發(fā)生于口腔粘膜的常見(jiàn)惡性腫瘤，特點(diǎn)是絕大多數(shù)為鱗狀細(xì)胞癌，包括發(fā)生于舌，頰，口底，唇，牙齦等粘膜的癌瘤；浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移出現(xiàn)較早，以淋巴道轉(zhuǎn)移為主，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，生存率明顯降低，目前臨床尚無(wú)根治方法。因此口腔癌動(dòng)物模型尤其是淋巴道轉(zhuǎn)移模型的研究一直受到重視。目前，小鼠口腔癌模型的建立多采用移植瘤法，例如人類(lèi)口腔癌細(xì)胞株裸鼠原位移植等，或者小鼠癌細(xì)胞原位移植等，但是該方法畢竟屬于異種或者同種移植，操作過(guò)程雖簡(jiǎn)單但是不能模擬人類(lèi)口腔癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程。亦有人采用誘癌劑局部涂擦法建立小鼠口腔癌模型，但是此方法操作極度繁瑣且不自然。誘癌劑飲水法誘導(dǎo)動(dòng)物口腔癌方法自然，且能模擬人類(lèi)口腔癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，但從目前情況看，誘導(dǎo)的癌瘤多為舌癌，偶有1、2例口腔其他粘膜癌，不能很好地體現(xiàn)人類(lèi)口腔癌發(fā)生部位的多樣性。尤其大多數(shù)未發(fā)現(xiàn)區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或者僅僅個(gè)別轉(zhuǎn)移。因此，現(xiàn)有的小鼠口腔癌淋巴道轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建多采用移植瘤的方法，轉(zhuǎn)移率低，誘癌方法極不自然，不能模擬人類(lèi)口腔癌發(fā)生發(fā)展直至轉(zhuǎn)移的進(jìn)化過(guò)程。從目前文獻(xiàn)看，還未能獲得滿意的淋巴道轉(zhuǎn)移模型。如果要探索癌瘤發(fā)生發(fā)展直至轉(zhuǎn)移的時(shí)空連續(xù)性改變，模型難以勝任。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種小鼠口腔癌及淋巴道轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建方法，建立小鼠與人類(lèi)口腔癌發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移極其類(lèi)似的小鼠口腔癌及淋巴道轉(zhuǎn)移模型，方法簡(jiǎn)單，成瘤率高， 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，為人類(lèi)口腔癌的防治提供有力的工具。為達(dá)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為
一種小鼠口腔癌及淋巴道轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟
(1)動(dòng)物選擇及分組取6周齡雄性Balb/c小鼠為實(shí)驗(yàn)小鼠，并隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)昭相
(2)試劑配制采用4-硝基喹啉-I-氧化物(4-nitroquinoline-oxide,4-NQ0),用無(wú)菌蒸餾水配成0. 1%濃度，置于4°C冰箱避光保存，用時(shí)以自來(lái)水配成的試劑A，置于避光瓶?jī)?nèi)讓小鼠自由飲用。自來(lái)水為試劑B ；
(3)動(dòng)物喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組小鼠喂養(yǎng)試劑A，對(duì)照組小鼠僅給試劑B喂養(yǎng)，各喂養(yǎng)20周；20 周后實(shí)驗(yàn)組小鼠停喂養(yǎng)試劑A，續(xù)用試劑B喂養(yǎng)至40周，對(duì)照組小鼠仍用試劑B喂養(yǎng)；
(4)實(shí)驗(yàn)觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠喂養(yǎng)9-40周內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組每2周隨機(jī)處死4只，對(duì)照組每2周隨機(jī)處死2只作為同期對(duì)照；并對(duì)兩實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行一般觀察、蘇木精一伊紅染色法 (hematoxylin-eosin staining,簡(jiǎn)稱(chēng)HE染色)染色觀察,免疫組織化學(xué)廣譜細(xì)胞角蛋白 (pan-cytokeratin, pan-ck)淋巴結(jié)染色觀察轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞；(5)結(jié)論，通過(guò)步驟(4)，得出4-NQ0化學(xué)誘導(dǎo)法成功建立小鼠口腔癌前病變，口腔癌及淋巴道轉(zhuǎn)移模型，并建立檔案構(gòu)成模型。所述的實(shí)驗(yàn)小鼠為6周齡雄性Balb/c小鼠,清潔級(jí),體重為23. 52±1. 15 g,在室溫18 25°C、濕度30% 50%、標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)、24h光暗交替條件下飼養(yǎng)。所述試劑A的4-硝基喹啉-I-氧化物含量為200mg/L。所述的一般觀察為實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每天觀察小鼠精神狀況、活動(dòng)度、進(jìn)食、飲水量、飲藥量及毛色情況，每周記錄小鼠體質(zhì)量，飲水量，飲藥量；每周掰開(kāi)小鼠口腔觀察口腔內(nèi)變化，記錄口腔內(nèi)粘膜色澤，質(zhì)地等是否改變，是否有斑塊、潰瘍或腫物出現(xiàn)。所述的HE染色觀察為處死小鼠后立即取全舌、牙齦、口底、頰、腭、唇、頜下淋巴結(jié)、頜下腺、食管、胃、肝、脾、肺、腎、小腸、大腸等組織，用10%的中性甲醛溶液固定，常規(guī)組織處理，石蠟包埋，4um切片，蘇木精伊紅染色,進(jìn)行組織病理學(xué)觀察；病理變化分單純性上皮增生，異常增生(輕、中、重度)和癌(原位癌，浸潤(rùn)性癌和轉(zhuǎn)移癌)。所述免疫組織化學(xué)廣譜細(xì)胞角蛋白(pan-cytokeratin, pan-ck)淋巴結(jié)染色觀察轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞為采用免疫組織二步法，按照常規(guī)操作。小鼠頜下淋巴結(jié)石蠟標(biāo)本連續(xù)4 切片，pan-ck—抗(兔抗鼠多克隆抗體，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，按1:100稀釋)，二抗(羊抗鼠抗兔通用型，上海長(zhǎng)島公司)，DAB顯色，用pan-ck抗體已知陽(yáng)性組織做陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定鏡下觀察，pan-ck兔抗鼠多克隆抗體在癌細(xì)胞內(nèi)為陽(yáng)性反應(yīng)，呈棕黃色，定位在胞質(zhì)內(nèi)，淋巴結(jié)內(nèi)固有成分不著色。陽(yáng)性染色細(xì)胞為轉(zhuǎn)移細(xì)胞。本發(fā)明小鼠口腔癌及淋巴道轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建方法，使用200mg/L的4-硝基喹啉-I-氧化物飲水法喂養(yǎng)Balb/c小鼠20周，續(xù)用自來(lái)水喂養(yǎng)至40周并觀察至40周，獲得小鼠與人類(lèi)口腔癌發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移極其類(lèi)似，即在部位多樣化，完整的從正常粘膜-異常增生-原位癌-鱗癌-頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程的小鼠口腔癌及淋巴道轉(zhuǎn)移模型。方法簡(jiǎn)便自然， 效果理想，發(fā)病率高(100%)、發(fā)病部位(唇、腭、牙齦、舌、口底)多樣化、極高頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率(100%)，為人類(lèi)口腔癌的防治提供新型有力的工具。
具體實(shí)施例方式(I)動(dòng)物選擇及分組取6周齡雄性Balb/c小鼠102只為實(shí)驗(yàn)小鼠，并隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組；
實(shí)驗(yàn)小鼠的條件為雄性Balb/c 6周齡，清潔級(jí)，體重(23. 52±1. 15 g)，在室溫18 25°C、濕度30% 50%、標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)、24h光暗循環(huán)條件下飼養(yǎng)；
(2)試劑配制采用4-硝基喹啉-I-氧化物(4NQ0)(美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)),用無(wú)菌蒸餾水配成0. 1%濃度的試劑A，置于4°C冰箱避光保存，用時(shí)以自來(lái)水配成200mg/L的試劑A， 置于避光瓶?jī)?nèi)讓小鼠自由飲用；自來(lái)水為試劑B ；
(3)動(dòng)物喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組小鼠喂養(yǎng)試劑A，對(duì)照組小鼠僅給試劑B喂養(yǎng)，各喂養(yǎng)20周；20周后實(shí)驗(yàn)組小鼠停喂養(yǎng)試劑A，續(xù)用自來(lái)水喂養(yǎng)至40周；對(duì)照組小鼠仍用試劑B喂養(yǎng)；
(4)實(shí)驗(yàn)觀察，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠喂養(yǎng)擴(kuò)40周內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組每2周隨機(jī)處死4只，對(duì)照組每2周隨機(jī)處死2只作為同期對(duì)照；并對(duì)兩實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行一般觀察、HE染色觀察和免疫組化廣譜細(xì)胞角蛋白(pan-ck)染色觀察一般觀察
實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每天觀察小鼠精神狀況、活動(dòng)度、進(jìn)食、飲水量、飲藥量及毛色情況，每周記錄小鼠體質(zhì)量，飲水量，飲藥量。每周掰開(kāi)小鼠口腔觀察口腔內(nèi)變化，記錄口腔內(nèi)粘膜色澤， 質(zhì)地等是否改變，是否有斑塊、潰瘍或腫物出現(xiàn)；
HE染色觀察
處死小鼠后立即取全舌、牙齦、口底、頰、腭、唇、頜下淋巴結(jié)、頜下腺、食管、胃、肝、脾、 肺、腎、小腸、大腸等組織，用10%的中性甲醛溶液固定，常規(guī)組織處理，石蠟包埋，4pm切片，蘇木精伊紅染色，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察；病理變化分單純性上皮增生，異常增生(輕、中、 重度)和癌(原位癌，浸潤(rùn)性癌和轉(zhuǎn)移癌);
免疫組化廣譜細(xì)胞角蛋白(pan-ck)淋巴結(jié)染色觀察轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞
采用免疫組織二步法，按照常規(guī)操作。小鼠頜下淋巴結(jié)石蠟標(biāo)本連續(xù)4pm切片，60°C 烤片3小時(shí)，脫蠟至水后，0. Olmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次3min，；抗原采胰蛋白酶修復(fù)，3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，蒸餾水沖洗，滴一抗pan-ck (—抗為兔抗鼠多克隆抗體，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，按1:100稀釋)，于4°C冰箱過(guò)夜。PBS 沖洗3遍，每次3min，滴二抗(二抗為羊抗鼠抗兔通用型，上海長(zhǎng)島公司)室溫下孵育30min， PBS沖洗3次，每次3min，滴加新鮮配制的DAB溶液，鏡下觀察并控制顯色時(shí)間，用pan-ck 抗體已知陽(yáng)性組織做陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定鏡下觀察，pan-ck 兔抗鼠多克隆抗體在癌細(xì)胞內(nèi)為陽(yáng)性反應(yīng)，呈棕黃色，定位在胞質(zhì)內(nèi)，淋巴結(jié)內(nèi)固有成分不著色。淋巴結(jié)內(nèi)陽(yáng)性染色細(xì)胞與HE染色相對(duì)照，判定為轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞。觀察結(jié)果
一般情況實(shí)驗(yàn)第三周起發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)毒副反應(yīng)，表現(xiàn)為較同期對(duì)照組小鼠體重明顯減輕(P〈0. 01),毛色暗啞，活動(dòng)度降低，不愿進(jìn)食等。實(shí)驗(yàn)第8 16周，發(fā)現(xiàn)大部分小鼠舌背根部“人字溝”附近出現(xiàn)白色斑塊，后斑塊逐漸向舌尖部蔓延，并在口底、牙齦、上腭部發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的斑塊染色證實(shí)上述斑塊多為輕到中度異常增生(輕度異常增生發(fā)生率 約44%，中度異常增生發(fā)生率約25%)。實(shí)驗(yàn)第17 24周，上述斑塊面積增大，高出粘膜，外觀變粗糙，或呈顆粒狀，或出現(xiàn)裂痕，染色證實(shí)為中到重度異常增生(發(fā)生率56%)。實(shí)驗(yàn)第25周時(shí)，發(fā)現(xiàn)鼠舌背、舌側(cè)出現(xiàn)腫物或者潰瘍，邊緣凸出，呈“火山口”樣外觀，質(zhì)地硬，后相繼在小鼠牙齦，口底，，腭部，唇部發(fā)現(xiàn)類(lèi)似腫物或潰瘍，HE染色證實(shí)均為鱗癌，并發(fā)現(xiàn)部分腫瘤小鼠頜下淋巴結(jié)腫大，病理證實(shí)為轉(zhuǎn)移癌。25周至32周期間，口腔癌發(fā)生率約81%， 包括舌癌(構(gòu)成比約37%)，口底癌(構(gòu)成比約19%)，牙齦癌(構(gòu)成比:約19%)，腭癌(構(gòu)成比約6%)，唇癌(構(gòu)成比約6%);其中，經(jīng)HE染色和免疫組化廣譜細(xì)胞角蛋白(pan-ck) 淋巴結(jié)染色觀察轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞證實(shí)一部分小鼠出現(xiàn)同側(cè)或雙側(cè)頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(發(fā)生率約 12%)。33周至40周期間，全部發(fā)現(xiàn)有原發(fā)灶腫瘤以及同側(cè)或雙側(cè)下頜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(發(fā)生率 100%),包括舌癌(37%) , 口底癌(37%),牙銀癌(19%),唇癌(6%),未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。(5)通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察步驟(4)，得出4-NQ0化學(xué)誘導(dǎo)法成功建立小鼠口腔癌前病變， 口腔癌及淋巴道轉(zhuǎn)移模型，并建立檔案構(gòu)成模型。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)例而已，并非對(duì)本發(fā)明做任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種小鼠口腔癌及淋巴道轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟(1)動(dòng)物選擇及分組取6周齡雄性Balb/c小鼠為實(shí)驗(yàn)小鼠，并隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)昭相 (2)試劑配制采用4-硝基喹啉-I-氧化物(4-nitroquinoline-oxide,4-NQ0),用無(wú)菌蒸餾水配成0. 1%濃度，置于4°C冰箱避光保存，用時(shí)以自來(lái)水配成的試劑A，置于避光瓶?jī)?nèi)讓小鼠自由飲用；自來(lái)水為試劑B ；(3)動(dòng)物喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組小鼠喂養(yǎng)試劑A，對(duì)照組小鼠僅給試劑B喂養(yǎng)，各喂養(yǎng)20周；20 周后實(shí)驗(yàn)組小鼠停喂養(yǎng)試劑A，續(xù)用試劑B喂養(yǎng)至40周；對(duì)照組小鼠仍用試劑B喂養(yǎng)；(4)實(shí)驗(yàn)觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠喂養(yǎng)9-40周內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組每2周隨機(jī)處死4只，對(duì)照組每2周隨機(jī)處死2只作為同期對(duì)照；并對(duì)兩實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行一般觀察、HE染色觀察，免疫組織化學(xué)廣譜細(xì)胞角蛋白染色觀察；(5)結(jié)論，通過(guò)步驟(4)，得出4-NQ0化學(xué)誘導(dǎo)法成功建立小鼠口腔癌前病變，口腔癌及淋巴道轉(zhuǎn)移模型，并建立檔案構(gòu)成模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小鼠口腔癌及淋巴道轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建方法，其特征在于 所述的實(shí)驗(yàn)小鼠為6周齡雄性Balb/c小鼠，清潔級(jí)，體重為23. 52±1. 15 g，在室溫18 25°C、濕度30% 50%、標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)、24h光暗交替條件下飼養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小鼠口腔癌及淋巴道轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建方法，其特征在于所述試劑A的4-硝基喹啉-I-氧化物含量為200mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小鼠口腔癌及淋巴道轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建方法，其特征在于 所述的一般觀察為實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每天觀察小鼠精神狀況、活動(dòng)度、進(jìn)食、飲水量、飲藥量及毛色情況，每周記錄小鼠體質(zhì)量，飲水量，飲藥量；每周掰開(kāi)小鼠口腔觀察口腔內(nèi)變化，記錄口腔內(nèi)粘膜色澤，質(zhì)地等是否改變，是否有斑塊、潰瘍或腫物出現(xiàn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小鼠口腔癌及淋巴道轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建方法，其特征在于 所述的染色觀察為處死小鼠后立即取全舌、牙齦、口底、頰、腭、唇、頜下淋巴結(jié)、頜下腺、食管、胃、肝、脾、肺、腎、小腸、大腸等組織，用10%的中性甲醛溶液固定，常規(guī)組織處理，石蠟包埋，4 ii m切片，蘇木精伊紅染色，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察；病理變化分單純性上皮增生，異常增生(輕、中、重度)和癌(原位癌，浸潤(rùn)性癌和轉(zhuǎn)移癌)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小鼠口腔癌及淋巴道轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建方法，其特征在于所述免疫組織化學(xué)廣譜細(xì)胞角蛋白淋巴結(jié)染色觀察轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞為采用免疫組織二步法，按照常規(guī)操作；小鼠頜下淋巴結(jié)石臘標(biāo)本連續(xù)m切片，pan-ck—抗(兔抗鼠多克隆抗體，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，按1:100稀釋)，二抗(羊抗鼠抗兔通用型，上海長(zhǎng)島公司)，DAB顯色，用pan-ck抗體已知陽(yáng)性組織做陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照； 結(jié)果判定鏡下觀察，pan-ck兔抗鼠多克隆抗體在癌細(xì)胞內(nèi)為陽(yáng)性反應(yīng)，呈棕黃色，定位在胞質(zhì)內(nèi)，淋巴結(jié)內(nèi)固有成分不著色；11.陽(yáng)性染色細(xì)胞為轉(zhuǎn)移細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種小鼠口腔癌及淋巴道轉(zhuǎn)移模型的構(gòu)建方法，其特征在于包括動(dòng)物選擇及分組、試劑配制、動(dòng)物喂養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)觀察和結(jié)論步驟。該方法使用200mg/L的4-硝基喹啉-1-氧化物飲水法喂養(yǎng)Balb/c小鼠20周，續(xù)用自來(lái)水喂養(yǎng)至40周并觀察至40周，獲得小鼠與人類(lèi)口腔癌發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)移極其類(lèi)似，即發(fā)生部位多樣化，完整的從正常粘膜-異常增生-原位癌-鱗癌-頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程的小鼠口腔癌及淋巴道轉(zhuǎn)移模型。方法簡(jiǎn)便自然，效果理想，發(fā)病率高、發(fā)病部位(唇、腭、牙齦、舌、口底)多樣化、極高頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率，為人類(lèi)口腔癌的防治提供新型有力的工具。
文檔編號(hào)A01K67/027GK102599106SQ20121009914
公開(kāi)日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月6日
發(fā)明者于大海, 李晶, 黎明武 申請(qǐng)人:廣西醫(yī)科大學(xué)