專(zhuān)利名稱：松材線蟲(chóng)lamp特異性檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明適用于松材線蟲(chóng)檢測(cè)，屬于植物檢疫、森林保護(hù)領(lǐng)域，與分子檢測(cè)技術(shù)相關(guān)。
二.
背景技術(shù)：
由松材線蟲(chóng)(Bursaphelenchus xylophilus),危害引起的松樹(shù)萎蔫病(Pine wooddisease)是林業(yè)上特大的毀滅性病害，是國(guó)際公認(rèn)的最重要的植物檢疫性有害生物，也是我國(guó)對(duì)外公布的植物檢疫性線蟲(chóng)，僅我國(guó)就有15個(gè)省、直轄市、自治區(qū)的186個(gè)縣級(jí)行政區(qū)發(fā)生該病害，年均發(fā)病面積達(dá)10萬(wàn)公頃，造成的直接和間接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)百億元人民幣。松材線蟲(chóng)隸 屬滑刃目(Aphelenchida Siddiqi, 1980),傘滑刃亞科(Bursarphelenchinae Parmaonov, 1964),傘滑刃線蟲(chóng)屬(Bursaphelenchus Fuchs, 1937)。目前傘滑刃線蟲(chóng)屬現(xiàn)有95個(gè)種，按形態(tài)學(xué)特征及遺傳親緣關(guān)系可分為14個(gè)組和I個(gè)未分組線蟲(chóng)。線蟲(chóng)的傳統(tǒng)鑒定方法主要其形態(tài)學(xué)特征并結(jié)合雌雄成蟲(chóng)的測(cè)計(jì)值，需要工作人員豐富的工作經(jīng)驗(yàn)及掌握大量的文獻(xiàn)，尤其是近年來(lái)松材線蟲(chóng)近似種數(shù)量不斷增加，給準(zhǔn)確鑒定線蟲(chóng)帶來(lái)不少困難，而目前具有這類(lèi)鑒定能力的專(zhuān)家數(shù)量不能滿足檢疫工作及林業(yè)保護(hù)所需。隨著分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)步，松材線蟲(chóng)的分子檢測(cè)技術(shù)也越來(lái)越多，Guiran等(1985)，胡凱基等(1995)等研究了松材線蟲(chóng)的同工酶的檢測(cè)方法，蔣麗琴(2006)制備了松材線蟲(chóng)的抗體，這些方法在一定程度上，使得松材線蟲(chóng)鑒定更快，更準(zhǔn)確，但需要大量的線蟲(chóng)，不同來(lái)源的松材線蟲(chóng)群體存在著差異，導(dǎo)致結(jié)果常出現(xiàn)部分偏差。隨著PCR(PolymeraseChain Reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)的推廣，PCR-RFLP (Restriction Fragment LengthPolymorphism,限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)，種特異性PCR，多重PCR (multiplex-PCR),實(shí)時(shí)熒光PCR，基因芯片技術(shù)等大量的基于PCR擴(kuò)增的松材線蟲(chóng)檢測(cè)技術(shù)不斷出現(xiàn)，但是這些基于PCR的檢測(cè)技術(shù)都需要PCR儀，實(shí)時(shí)熒光PCR儀等昂貴設(shè)備，難于用于現(xiàn)場(chǎng)檢疫，也難以在一些基層林業(yè)管理部門(mén)推廣。近年 HRCA (Hyper-branched Rolling Cycle Amplification,超分枝滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù))(劉倩，2009)等一些基于恒溫?cái)U(kuò)增原理的分子檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于松材線蟲(chóng)檢測(cè)中，但因?yàn)椴襟E復(fù)雜，也僅在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用中。
三.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種松材線蟲(chóng)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermalamplification)快速檢測(cè)方法。運(yùn)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)松材線蟲(chóng)的方法，能夠提高檢測(cè)效率和檢測(cè)的準(zhǔn)確度，本發(fā)明針對(duì)松材線蟲(chóng)核糖體DNA的ITS2區(qū)8個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)I組引物(含6條特異引物)，具有特異性高、快速、檢測(cè)下限低等優(yōu)點(diǎn)。檢測(cè)時(shí)間只需20-30分鐘。此外，該檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，所需設(shè)備簡(jiǎn)易，因此還可用于野外檢測(cè)及一線口岸現(xiàn)場(chǎng)檢疫。四.技術(shù)方案
(I)松材線蟲(chóng)DNA提取:取線蟲(chóng)，置于PCR管中，液氮放置2分鐘，加入Iml蛋白酶K (lmg/ml), 65°C 15分鐘，95°C以上水處理10分鐘，所得即為線蟲(chóng)DNA提取液；(2)松材線蟲(chóng)LAMP檢測(cè)特異引物:Bx-1F3:5/ -GCAGAAACGCCGACTTGT-3'Bx-1B3:5/ -GCGCCGTTGAAACAACATC-3'Bx-1FIP:5' -CCGCGTAAAACAGATGGTGCCTAGTTTCTGCACGTTGTGACA-3'Bx-1BIP:5' -TCTACGCACTGTTTGTCCGTGCACCAAACGGTTTAGCCGC-3/Bx-1LPF:5/ -TTGCGCGAACAATGCGA-3'Bx-1LPR:5/ -CTTCGTGCTCGATTGTCGT-3;；(3)松材線蟲(chóng)濁度觀察檢測(cè)反應(yīng)體系:PCR管中加入下列試劑，使總反應(yīng)體積為20 μ 1:
DNA提取液I μ
2x反應(yīng)緩沖液10 μ
Bx-1F35 pmol
Bx-1B35 pmol
Bx-1FIP40 pmol
Bx-1BIP40 pmol
Bx-1LPF20 pmol
Bx-1LPR20 pmol
As'/DNA 聚合綠 1.0 μ ;(4)松材線蟲(chóng)熒光觀察檢測(cè)反應(yīng)體系:
PCR管中加入下列試劑，使總反應(yīng)體積為20 μ 1:DNA提取液2 μ
2χ反應(yīng)緩沖液ΙΟμΙ
Bx-1 F35 pmol
Bx-1B35 pmol
Bx-1FIP40 pmol
Bx-1BIP40 pmol
Bx-1 LPF20 pmol
Bx-1LPR20 pmol
Λ7 DNA 聚合酶1.0 μ
4弓黃綠素1.0 μ ;(5 )松材線蟲(chóng)LAMP檢測(cè)反應(yīng)程序65 °C條件下，反應(yīng)30分鐘后，觀察反應(yīng)管中反應(yīng)液濁度或顏色。(6 )松材線蟲(chóng)LAMP檢測(cè)結(jié)果判定松材線蟲(chóng)濁度觀察檢測(cè)反應(yīng)體系反應(yīng)30分鐘后，觀察反應(yīng)管中反應(yīng)液濁度，其中反應(yīng)液出現(xiàn)渾濁，為陽(yáng)性擴(kuò)增，該樣品檢測(cè)松材線蟲(chóng)結(jié)果為陽(yáng)性，對(duì)照陰性為澄清，無(wú)渾濁(見(jiàn)圖1)。松材線蟲(chóng)熒光觀察檢測(cè)反應(yīng)體系反應(yīng)30分鐘后，觀察反應(yīng)管中反應(yīng)液顏色變化，其中反應(yīng)液為綠色，為陽(yáng)性擴(kuò)增，該樣品檢測(cè)松材線蟲(chóng)結(jié)果為陽(yáng)性，對(duì)照陰性為橙紅色(見(jiàn)圖2)。
五.


圖1為松材線蟲(chóng)濁度觀察檢測(cè)反應(yīng):1，2:松材線蟲(chóng)檢測(cè)樣，3:擬松材線蟲(chóng)檢測(cè)結(jié)果，4:空白對(duì)照。圖2為松材線蟲(chóng)熒光觀察檢測(cè)反應(yīng):1，2:松材線蟲(chóng)檢測(cè)樣，3:擬松材線蟲(chóng)檢測(cè)結(jié)
果，4:空白對(duì)照。
六.
具體實(shí)施例方式(I)測(cè)試樣本DNA提取:搜集自國(guó)內(nèi)外不同地區(qū)來(lái)源的由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院植物線蟲(chóng)檢疫實(shí)驗(yàn)室保存的松材線蟲(chóng) 11 個(gè)群體(B101，B102, B104, B105, B108, B109, Bill, B112, B115, B116,B17K)，其他線蟲(chóng)群體 12 個(gè)(B201，Bm2, B302, B401, B501, B601, B701, B801, B901, BxxOl,Ahb, D34, Rsl),以及灰葡萄孢菌株I份，健康黑松樣品I份，松墨天牛I份。線蟲(chóng)DNA提取:線蟲(chóng)置于PCR管中，液氮放置2分鐘，加入Iml蛋白酶K( lmg/ml)，65°C 15分鐘，95°C以上水處理10分鐘，所得即為線蟲(chóng)DNA提取液；灰葡萄孢及黑松使用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的植物基因組DNA提取試劑盒提取樣品的DNA。
松墨天牛DNA提取按Qiagen公司DNEasy Blood and Tissue Kit方法提取。(2)松材線蟲(chóng)LAMP檢測(cè)特異引物:下列引物由Invitrogen生物技術(shù)公司(北京)合成。Bx-1F3:5/ -GCAGAAACGCCGACTTGT-3'Bx-1B3:5/ -GCGCCGTTGAAACAACATC-3' Bx-1FIP:5' -CCGCGTAAAACAGATGGTGCCTAGTTTCTGCACGTTGTGACA-3'Bx-1BIP:5/ -TCTACGCACTGTTTGTCCGTGCACCAAACGGTTTAGCCGC-3'Bx-1LPF:5/ -TTGCGCGAACAATGCGA-3'Bx-1LPR:5/ -CTTCGTGCTCGATTGTCGT-3'上述引物均根據(jù)反應(yīng)體系需要用滅菌去離子水溶解成適宜濃度。(3)松材線蟲(chóng)濁度觀察檢測(cè)反應(yīng)體系:PCR管中加入下列試劑，使總反應(yīng)體積為20 μ 1:
DNA提取液2 μ
2X反應(yīng)緩沖液10 μ
Bx-1F35 pmol
Bx-1B3SpmoI
Bx-1FIP40 pmol
Bx-1BIP40 pmol
Bx-1LPF20 pmol
Bx-1LPR20 pmol
Av/DNA 聚合酶1.0 μ 其中2X反應(yīng)緩沖液的成分為:`
Tris-HCI (pH8.8) 40mM
KCl20 mM
MgSOsJ16mM
(NH4)2SO420mM
Tween-200.2%
Betaine1.6M
dNTPs2.8 mM eack(4)松材線蟲(chóng)熒光觀察檢測(cè)反應(yīng)體系:PCR管中加入下列試劑，使總反應(yīng)體積為20 μ 1:2x反應(yīng)緩沖液IO μ
Bx-1F35 pmol
Bx-1B35 pmol
Be-1FIP40 pmol
Bx-1BIP40 pmol
Bx-1LPF20 pmol
Bx-1LPR20 pmol
ΛΜ DNA 聚合酶1.0 μ
鈣黃綠素LO μ 其中2XReaction buffer 的成分如(3)。(5 )松材線蟲(chóng)LAMP檢測(cè)反應(yīng)程序:按照上述體系混好，于65°C條件下，溫育30分鐘。(6 )松材線蟲(chóng)LAMP檢測(cè)結(jié)果判定:
松材線蟲(chóng)濁度觀察檢測(cè)反應(yīng)體系反應(yīng)30分鐘后，觀察反應(yīng)管中反應(yīng)液濁度，其中反應(yīng)液出現(xiàn)渾濁，為陽(yáng)性擴(kuò)增，該樣品檢測(cè)松材線蟲(chóng)結(jié)果為陽(yáng)性，對(duì)照陰性為澄清，無(wú)渾濁(見(jiàn)圖1)。松材線蟲(chóng)熒光觀察檢測(cè)反應(yīng)體系反應(yīng)30分鐘后,觀察反應(yīng)管中反應(yīng)液顏色變化，其中反應(yīng)液為綠色，為陽(yáng)性擴(kuò)增，該樣品檢測(cè)松材線蟲(chóng)結(jié)果為陽(yáng)性，對(duì)照陰性為橙紅色(見(jiàn)圖2)。
權(quán)利要求
1.一組松材線蟲(chóng)LAMP檢測(cè)用特異引物，其特征在于，其核苷酸序列為:Bx-1F3:5/ -GCAGAAACGCCGACTTGT-3'Bx-1B3:5/ -GCGCCGTTGAAACAACATC-3'Bx-1FIP:5/ -CCGCGTAAAACAGATGGTGCCTAGTTTCTGCACGTTGTGACA-3'Bx-1BIP:5/ -TCTACGCACTGTTTGTCCGTGCACCAAACGGTTTAGCCGC-3/Bx-1LPF:5/ -TTGCGCGAACAATGCGA-3' Bx-1LPR:5/ -CTTCGTGCTCGATTGTCGT-3;。
2.一種檢測(cè)松材線蟲(chóng)的濁度觀察檢測(cè)方法:其特征在于，其以總DNA為模板，利用權(quán)利要求I所述的引物組合進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，反應(yīng)30分鐘后觀察反應(yīng)液顏色變化。
3.—種檢測(cè)松材線蟲(chóng)的熒光觀察檢測(cè)方法:其以總DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物組合進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，反應(yīng)30分鐘后觀察反應(yīng)液顏色變化。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述松材線蟲(chóng)濁度觀察檢測(cè)方法檢測(cè)30分鐘后，陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果為反應(yīng)液為渾濁，而陰性結(jié)果為澄清。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述松材線蟲(chóng)熒光觀察檢測(cè)方法檢測(cè)30分鐘后，陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果為反應(yīng)液為綠色，而陰性結(jié)果為橙紅色。
6.一種試劑盒，其特征在于，其含有權(quán)利要求1所述的引物。
全文摘要
本發(fā)明涉及松材線蟲(chóng)檢測(cè)，屬于植物檢疫、森林保護(hù)領(lǐng)域。本發(fā)明根據(jù)松材線蟲(chóng)及其近似種核酸序列差異，選取了松材線蟲(chóng)與其近似種線蟲(chóng)8個(gè)特異區(qū)域，設(shè)計(jì)了1組特異引物(6條)。同時(shí)，本發(fā)明提供了一組檢測(cè)松材線蟲(chóng)的LAMP引物序列，還進(jìn)一步提供了檢測(cè)松材線蟲(chóng)的檢測(cè)方法。本發(fā)明的引物特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)方法快速簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性高，為進(jìn)境木質(zhì)包裝松材線蟲(chóng)檢疫及松材線蟲(chóng)萎蔫病罹病松木監(jiān)測(cè)提供了有效的技術(shù)保證。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103173530SQ20121019490
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2012年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月13日
發(fā)明者葛建軍, 熊玉芬, 王旭 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院