專利名稱：用于檢測水仙花葉病毒和水仙黃條病毒的試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種用于檢測水仙花葉病毒和水仙黃條病毒的試劑盒及其檢測方法，屬于植物檢疫技術(shù)領(lǐng)域，專用于水仙花葉病毒、水仙黃條病毒的檢測，不僅適用于ロ岸檢驗檢疫部門對水仙花葉病毒、水仙黃條病毒的快速檢測，還可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)部門對水仙花葉病毒、水仙黃條病毒的實時監(jiān)測和預警預報。
背景技術(shù)：
水仙花葉病韋(Narcissusmosaic virus, NMV)、水仙黃條病韋(Narcissusyellow stripe virus, NYSV)是危害水仙的兩種主要病毒。其中水仙花葉病毒(NMV)屬于線性病毒科(Flexiviridae)、馬鈴薯X病毒屬(Potexvirus)成員，病毒粒體為線條狀，大小約550nmX 13nm。NMV基因組為正義單鏈RNA，基因組全長為6955個核苷酸。NMV已報道的自然寄主為水仙，主要通過汁液接觸傳播。該病毒侵染水仙后，在發(fā)病初期植株葉片或花梗有不規(guī)則的褪綠斑，到生長后期，病情加重，花葉癥狀明顯，并擴展為較大的斑塊，發(fā)病嚴重時，甚至出現(xiàn)葉片扭曲、黃化，矮小畸形等癥狀。NMV主要分布在荷蘭、英國和中國等國家。水仙黃條病毒(NYSV)屬于馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)、馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)成員，病毒粒體為彎曲線狀，粒子大小為755nmX 12nm。NYSV基因組為正義單鏈RNA，全序列長為9650個核苷酸，該病毒主要通過蚜蟲介體以非持久性方式傳播。NYSV自然寄主局限于石蒜科的水仙、長壽花等幾種植物。NYSV侵染水仙引起的典型癥狀為沿葉脈產(chǎn)生褪綠黃色條斑、系統(tǒng)花葉。NYSV可導致水仙病葉表面凸起、粗糙，花梗產(chǎn)生褪綠斑，病株花朵著色不均，形成花碎色，使其失去商品價值，最后導致鱗莖變小、植株矮化，直至提前枯萎。NYSV目前分布于歐洲、北美洲、澳洲及亞洲，包括英國、荷蘭、立陶宛、美國、新西蘭及中國。水仙花葉病毒(NMV)、水仙黃條病毒(NYSV)對水仙的產(chǎn)量和品質(zhì)能夠造成不同程度的影響，據(jù)統(tǒng)計，NYSV造成的產(chǎn)量損失平均為15. 2%，如果與其他病毒復合感染損失則可達30%。由于水仙花葉病毒(NMV)、水仙黃條病毒(NYSV)均可通過帶病植株及種球進行遠距離傳播，因此加強NMV、NYSV檢測技術(shù)的研究，建立快速、準確和靈敏的檢測方法對于預防兩種病毒的發(fā)生和擴散，保護水仙生產(chǎn)安全，具有極其重要的意義。利用生物學方法測定水仙花葉病毒(NMV)、水仙黃條病毒(NYSV)，盡管操作簡單，但檢測周期長，需要有固定的溫室或網(wǎng)室，且結(jié)果易受人為及其他因素的影響；與生物學檢測方法相比，血清學方法檢測NMV、NYSV具有快速、靈敏和特異性強的優(yōu)點，但不足的是需要使用特異性強、穩(wěn)定性好的抗血清，導致檢測成本増加。目前已報道的NMV、NYSV血清學檢測方法主要是采用間接酶聯(lián)免疫吸附測定方法(Clark等，Australasian PlantPathology, 2000, 29 :227 229)。電鏡鑒定NMV、NYSV雖然直觀，但該方法使用前提是需要昂貴的電鏡設(shè)備和專門的操作人員，具有較大局限性，不適于普及推廣。近年來，基于核酸水平的分子檢測方法越來越多的應(yīng)用到植物病毒檢測領(lǐng)域，該方法與生物學測定、血清學檢測和電鏡鑒定等傳統(tǒng)植物病毒檢測方法相比，具有檢測速度更快、準確性更好、靈敏度更高和特異性更強的優(yōu)點。但到目前為止，關(guān)于水仙花葉病毒(NMV)、水仙黃條病毒(NYSV)分子檢測方法的報道甚少，至今尚未見專門應(yīng)用于兩種病毒快速檢測的分子檢測試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種用于檢測水仙花葉病毒和水仙黃條病毒的試劑盒及其檢測方法，克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷和不足，能夠?qū)M出境水仙及田間水仙上水仙花葉病毒、水仙黃條病毒進行快速、準確的檢疫鑒定，滿足ロ岸檢驗檢疫和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要。本發(fā)明技術(shù)方案如下(一)ー種用于檢測水仙花葉病毒和水仙黃條病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括
I) PCR Buffer : IOX ;2) Mgcl2 25mmol/L ；3) dNTPs 10mmol/L ；4)反轉(zhuǎn)錄酶5U/μ L ;5)8應(yīng)酶抑制因子4(^/^し；6 ) Taq DNA 聚合酶5U/ μ L ;7)試劑A :10 μ mol/L,內(nèi)含上游引物NMV_f和下游引物NMV_r，其中上游引物NMV-f的序列為5’ -ACTCAGTCGCACCCGCTATG-3’，下游引物NMV_r的序列為5’ -GTGCTTCAATGGCGTACATGG-3’ ；8 )試劑B : 10 μ mol/L,內(nèi)含上游引物NYSV-f和下游引物NYSV-r，其中上游引物NYSV-f的序列為5’ -GAAGCAAAGTGTCGCCAGTG-3，，下游引物NYSV-r的序列為5’ -CACGCCTAGAAGGTTGTGCAT-3’ ；9)水仙花葉病毒、水仙黃條病毒的陽性對照樣品；10) RNase-free ddH20。(ニ)上述水仙花葉病毒和水仙黃條病毒試劑盒的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟I)在PCR管中加入待測樣品總 RNA2 μ LUOXPCR Buffer 2· 5 μ L、濃度為 25mmol/L MgCl25yL、濃度為 10mmol/L dNTPs 2. 5 μ L、濃度為 5U/μ L 反轉(zhuǎn)錄酶0. 5 μ L、濃度為 40U/μ L RNA酶抑制因子0. 5 μ L、濃度為5U/ μ L Taq DNA聚合酶0. 5 μ L、濃度為10 μ mol/L的試劑A或試劑B 2 μ L、RNase-free ddH20 9. 5 μ L，使反應(yīng)總體積為25 μ L ;混合后的反應(yīng)液，先42° C反轉(zhuǎn)錄30min，接著94°C預變性3min，然后94°C變性45s、55°C退火50s、72°C延伸60s，如此共35個循環(huán)，最后一個循環(huán)結(jié)束后72°C繼續(xù)延伸lOmin，反應(yīng)結(jié)束；2)PCR反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物10μ L用濃度為I. 5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，溴化こ錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄實驗結(jié)果；含有水仙花葉病毒樣品的電泳檢測結(jié)果為在483bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶，含有水仙黃條病毒樣品的電泳檢測結(jié)果為在751bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶。本發(fā)明根據(jù)水仙花葉病毒、水仙黃條病毒基因序列設(shè)計特異性引物，經(jīng)過反復實驗篩選，確定了適合于水仙花葉病毒、水仙黃條病毒檢測的上游引物和下游引物，再通過優(yōu)化確定了最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，能夠快速、準確、靈敏的檢測水仙花葉病毒、水仙黃條病毒。較之現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明所提供的用于檢測水仙花葉病毒和水仙黃條病毒的試劑盒及其檢測方法有益效果在于1)檢測時間快本發(fā)明可以對水仙的種球、葉片、花等各個部位直接進行檢測，無需將水仙栽培后取其葉片檢測，整個檢測過程僅需5-6小時；2)特異性強、靈敏度高本發(fā)明不僅可以將水仙花葉病毒、水仙黃條病毒與其他病毒進行特異性區(qū)分，而且可以對水仙樣品中低含量的水仙花葉病毒、水仙黃條病毒進行準確鑒定；3)檢測試劑盒制作方法簡單、易于規(guī)?；a(chǎn)，使用經(jīng)濟，具有很好的實際應(yīng)用價值。


圖I為實施例2的水仙花葉病毒檢測結(jié)果。其中I :陽性對照；2_3 :攜帯有水仙花葉病毒的樣品。圖2為實施例2的水仙黃條病毒檢測結(jié)果。其中I :陽性對照；2_3 :攜帯有水仙黃條病毒的樣品。 圖3為實施例3的水仙花葉病毒特異性驗證結(jié)果。其中I :陽性對照；2 :水仙花葉病毒(NMV)樣品；3 :水仙黃條病毒(NYSV)樣品；4 :水仙遲季黃化病毒(NLSYV)樣品；5 :水仙潛隱病毒(NLV)樣品；6 :南芥菜花葉病毒(ArMV)樣品。圖4為實施例3的水仙黃條病毒異性驗證結(jié)果。其中I :陽性對照；2 :水仙黃條病毒(NYSV)樣品；3 :水仙花葉病毒(NMV)樣品；4 :水仙遲季黃化病毒(NLSYV)樣品；5 :水仙潛隱病毒(NLV)樣品；6 :南芥菜花葉病毒(ArMV)樣品。
具體實施例方式以下通過具體實施例對本發(fā)明作進ー步說明。實施例I :水仙花葉病毒和水仙黃條病毒試劑盒的配置(10次檢測量)1)PCR Buffer :10X，1 管(30yL);2) Mgcl2 :25mmol/L, I 管(60 μ L);3) dNTPs :10mmol/L，I 管(30μ L);4)反轉(zhuǎn)錄酶5υ/μ L, I 管(5μ L);5) RNA 酶抑制因子:40U/yL，l 管(5yL)；6) Taq DNA 聚合酶5U/yL，l 管(5yL);7)試劑A : 10 μ mol/L,內(nèi)含上游引物NMV_f和下游引物NMV_r，其中上游引物NMV-f的序列為5’ -ACTCAGTCGCACCCGCTATG-3’，下游引物NMV_r的序列為5，-GTGCTTCAATGGCGTACATGG-3，，I 管(30 μ L);8 )試劑B : 10 μ mol/L,內(nèi)含上游引物NYSV-f和下游引物NYSV-r，其中上游引物NYSV-f的序列為5’ -GAAGCAAAGTGTCGCCAGTG-3，，下游引物NYSV-r的序列為5，-CACGCCTAGAAGGTTGTGCAT-3，，I 管(30 μ L);9)水仙花葉病毒、水仙黃條病毒的陽性對照樣品，2管(每管20μ L);10) RNase-free ddH20,1 管(lmL)。實施例2 :水仙花葉病毒和水仙黃條病毒試劑盒的檢測方法上述水仙花葉病毒和水仙黃條病毒試劑盒的檢測方法，包括以下步驟I)在PCR管中加入待測樣品總 RNA2 μ LUOXPCR Buffer 2· 5μ L、濃度為 25mmol/L MgCl25yL、濃度為 lOmmol/L dNTPs 2. 5 μ L、濃度為 5U/μ L 反轉(zhuǎn)錄酶0. 5 μ L、濃度為 40U/μ L RNA酶抑制因子O. 5 μ L、濃度為5U/ μ L Taq DNA聚合酶O. 5 μ L、濃度為10 μ mol/L的試劑A或試劑B 2 μ L、RNase-free ddH20 9. 5 μ L，使反應(yīng)總體積為25 μ L ;混合后的反應(yīng)液，先42° C反轉(zhuǎn)錄30min，接著94°C預變性3min，然后94°C變性45s、55°C退火50s、72°C延伸60s，如此共35個循環(huán)，最后一個循環(huán)結(jié)束后72°C繼續(xù)延伸lOmin，反應(yīng)結(jié)束；2) PCR反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物10 μ L用濃度為I. 5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，溴化こ錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄實驗結(jié)果；含有水仙花葉病毒樣品的電泳檢測結(jié)果為在483bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶(圖1)，含有水仙黃條病毒樣品的電泳檢測結(jié)果為在751bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶(圖2)，否則無。

實施例3 :水仙花葉病毒和水仙黃條病毒試劑盒的特異性驗證I)水仙樣品總RNA的提取分別以攜帶有水仙花葉病毒(NMV)、水仙黃條病毒(NYSV)、水仙潛隱病韋(Narcissus latent virus, NLV)、水仙遲李黃化病韋(Narcissuslate season yellows virus,NLSYV)、南芥菜花葉病毒(Arabis mosaic virus, ArMV)的水仙樣品為材料，各取0. Ig置于研缽中，加入ImL PBST緩沖液研磨，4°C，IOOOOg離心5min，取上清并將上清液迅速轉(zhuǎn)移至滅菌的I. 5mL離心管中，加入ImL TrizoL試劑，劇烈振蕩后，室溫靜置5min ;4°C，12000g離心lOmin，取上清；加入氯仿300 μ L，劇烈震蕩15s，室溫靜置5min，4°C，12000g離心15min，取上層水相；加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后室溫下靜置15min，4°C，12000g離心lOmin，棄上清；加入ImL 75%的こ醇洗滌沉淀2次，每次4° C，7500g離心3min,棄上清；RNA沉淀干燥后,用20 μ L RNase-free ddH20溶解；2)在PCR管中加入待測樣品總 RNA2 μ LU0XPCR Buffer 2· 5μ L、濃度為 25mmol/L MgCl25yL、濃度為 10mmol/L dNTPs 2. 5 μ L、濃度為 5U/μ L 反轉(zhuǎn)錄酶0. 5 μ L、濃度為 40U/μ L RNA酶抑制因子0. 5 μ L、濃度為5U/ μ L Taq DNA聚合酶0. 5 μ L、濃度為10 μ mol/L的試劑A或試劑B 2 μ L、RNase-free ddH20 9. 5 μ L，使反應(yīng)總體積為25 μ L ;混合后的反應(yīng)液，先42° C反轉(zhuǎn)錄30min，接著94°C預變性3min，然后94°C變性45s、55°C退火50s、72°C延伸60s，如此共35個循環(huán)，最后一個循環(huán)結(jié)束后72°C繼續(xù)延伸lOmin，反應(yīng)結(jié)束；3) PCR反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物10 μ L用濃度為I. 5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，溴化こ錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄實驗結(jié)果(圖3和圖4)。從圖3和圖4可見，僅水仙花葉病毒、水仙黃條病毒分別在483bp、751bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶，其他病毒樣品均無，說明本發(fā)明試劑盒具有良好的特異性。實施例4 :進境水仙上水仙花葉病毒、水仙黃條病毒的檢測隨機選取我國ロ岸截獲的荷蘭、英國水仙2批，每批樣品15份，采用實施例3方法提取樣品總RNA后進行檢測，同時用IndirectELISA方法進行驗證。從表I可見，從進境水仙樣品中檢出水仙花葉病毒(NMV) 5份，檢出率為16. 7% ;水仙黃條病毒(NYSV) 23份，檢出率為76. 7% ;上述結(jié)果與Indirect ELISA檢測結(jié)果完全相符。表I進境水仙樣品的檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.ー種用于檢測水仙花葉病毒和水仙黃條病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括I) PCR Buffer :10X ；2) Mgcl2 :25mmol/L ；3) dNTPs 10mmol/L ；4)反轉(zhuǎn)錄酶5U/y L ； 5)RNA 酶抑制因子40U/yL ;6)Taq DNA 聚合酶5U/yL;7)試劑 A:10 μ mol/L,內(nèi)含上游引物NMV-f和下游引物NMV_r，其中上游引物NMV_f的序列為5’ -ACTCAGTCGCACCCGCTATG-3’，下游引物 NMV_r 的序列為 5’ -GTGCTTCAATGGCGTACATGG-3 ’ ；8)試劑B :10 μ mol/L,內(nèi)含上游引物NYSV-f和下游引物NYSV_r，其中上游引物NYSV-f的序列為5’ -GAAGCAAAGTGTCGCCAGTG-3，，下游引物NYSV-r的序列為5’ -CACGCCTAGAAGGTTGTGCAT-3’ ；9)水仙花葉病毒、水仙黃條病毒的陽性對照樣品；10)RNase-free ddH20。
2.利用權(quán)利要求I所述的試劑盒的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 1)在PCR管中加入待測樣品總RNA2μ LUOXPCR Buffer 2. 5 μ L、濃度為25mmol/LMgCl25y L、濃度為 lOmmol/L dNTPs 2. 5 μ L、濃度為 5U/μ L 反轉(zhuǎn)錄酶 0. 5 μ L、濃度為 40U/μ L RNA酶抑制因子O. 5 μ L、濃度為5U/μ LTaq DNA聚合酶O. 5 μ L、濃度為10 μ mol/L的試劑A或試劑B 2 μ L、RNase-free ddH20 9. 5 μ L，使反應(yīng)總體積為25 μ L ;混合后的反應(yīng)液，先42° C反轉(zhuǎn)錄30min，接著94°C預變性3min，然后94°C變性45s、55°C退火50s、72°C延伸60s，如此共35個循環(huán)，最后一個循環(huán)結(jié)束后72°C繼續(xù)延伸lOmin，反應(yīng)結(jié)束； 2)PCR反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物10 μ L用濃度為I. 5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，溴化こ錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄實驗結(jié)果；含有水仙花葉病毒樣品的電泳檢測結(jié)果為在483bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶，含有水仙黃條病毒樣品的電泳檢測結(jié)果為在751bp處出現(xiàn)明亮的DNA條帶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測水仙花葉病毒和水仙黃條病毒的試劑盒及其檢測方法。該試劑盒包括PCR Buffer、Mgcl2、dNTPs、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制因子、Taq DNA聚合酶、試劑A、試劑B、陽性對照和RNase-free ddH2O。本發(fā)明根據(jù)水仙花葉病毒、水仙黃條病毒基因序列設(shè)計特異性引物，利用一步法反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)對水仙花葉病毒、水仙黃條病毒進行檢測，不僅試劑盒制作方法簡便，而且具有快速、準確、靈敏度高、特異性強的優(yōu)點，可有效應(yīng)用于口岸進出境水仙上水仙花葉病毒、水仙黃條病毒的快速檢疫，也可用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上水仙花葉病毒、水仙黃條病毒的檢測診斷、疫情監(jiān)控及預警預報，應(yīng)用前景廣泛。
文檔編號C12Q1/68GK102690896SQ20121019510
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月16日
發(fā)明者林雙慶, 沈建國, 蔡偉, 高芳鑾 申請人:福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心