專利名稱：：具有半乳糖基轉(zhuǎn)移活性的β-半乳糖苷酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種具有半乳糖基轉(zhuǎn)移活性、能夠?qū)⑷樘寝D(zhuǎn)化為低聚半乳糖混合物的新P-半乳糖苷酶。特別是涉及分離自新近發(fā)現(xiàn)的一種雙岐雙歧桿菌菌林(Bifidobacteriumbifidum)的p-半乳糖苷酶。本發(fā)明特別涉及編碼該分離所得的新(3-半乳糖苷酶的DNA序列、該DM序列所編碼的酶和包含該DNA序列或者包含整合有該DNA序列重組栽體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及由DNA序列編碼的酶或者含有DNA序列或重組載體的宿主細(xì)胞的用途，其用來生產(chǎn)低聚半乳糖。技術(shù)背景在自然條件下雙歧桿菌定殖于下腸道，該環(huán)境缺乏單糖和二糖，是因?yàn)檫@類糖已被宿主和上腸道的微生物優(yōu)先消耗。為了存活于下腸道，雙歧桿菌在表面和/或細(xì)胞外形態(tài)中產(chǎn)生不同種類的體外和體內(nèi)半乳糖普酶，依賴于此它們能夠利用多種碳水化合物。除水解酶活性以外，一些來自于雙歧桿菌的酶表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移酶活性。糖苷酶的該糖基轉(zhuǎn)移活性廣泛用于多種低聚糖(已證明作用為雙歧桿菌生長促進(jìn)因子)的酶合成。已經(jīng)知道雙歧桿菌成員生成與細(xì)菌乳糖代謝相關(guān)的p-半乳糖苷酶。M0ller，P.L.等人在Appl&Environ.Microbial(2001)，62，(5)，2276-2283中描述了從一種雙岐雙歧桿菌菌林中分離并表征了三個(gè)P-半乳糖苷酶基因。他們發(fā)現(xiàn)所有三個(gè)p-半乳糖苷酶均能催化通過轉(zhuǎn)移半乳糖基化形成p-鍵合的低聚半乳糖。Dumortier等人在CarbohydrateResearch201.(1990)，115-123中描述了用雙岐雙歧桿菌DSM20456水解乳糖的過程中通過轉(zhuǎn)移糖基化反應(yīng)形成P-鍵合的低聚糖。他們對生成的低聚糖混合物結(jié)構(gòu)的分析表明鍵合方式為—3)，P-(1—6)和3-(1—4)-D-半乳糖基鍵合。Dumortier提出雙岐雙歧桿菌生成的化合物參與細(xì)菌在大腸中的粘附。W001/90317描述了一種來源于雙岐雙歧桿菌的新(3-半乳糖苷酶，特別是具有高糖基轉(zhuǎn)移活性的該酶的截短型。已發(fā)現(xiàn)雙岐雙歧桿菌的一種菌林能夠產(chǎn)生半乳糖苷酶活性，此活性將乳糖轉(zhuǎn)化成新型的低聚半乳糖混合物，所述混合物中意外地包含高達(dá)35。/。的含有半乳二糖(半乳糖基(a1-6)-半乳糖[Gal(ocl-6)-Gal])的二糖。已知該二糖為一種抗粘附劑(參見Paton，JCandPaton，AW(1998)，Clin.Microbiol.Revs.，11，450-479;CarlssonKA(1989),Ann.ReviewsBiochem.，58,309-350)，能夠阻止例如志賀毒素的毒素和以大腸桿菌為例的病原體在腸道壁上的粘附。該雙岐雙歧桿菌菌林在工業(yè)和海洋細(xì)菌國家藏室(NationalCollectionofIndustrial&MarineBacteria)阿伯丁，英國以編號NCIMB41171保存，2003年3月31曰。在英國專利號2412380中也有描述。目前已發(fā)現(xiàn)該雙岐雙歧桿菌菌林產(chǎn)生數(shù)種p-半乳糖苷酶，包括一個(gè)全新的p-半乳糖苷酶。該酶生成多種不同P-鍵合的低聚糖。根據(jù)本發(fā)明提供編碼SEQ.IDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白的DNA序列，或與編碼該蛋白的DNA序列在嚴(yán)格條件下雜交的DNA序列。該DM序列由SEQ.IDNO:1所示或可包含其片段或其簡并物(degenerative)。簡并物一詞意指與SEQIDNO:1具有至少50%同源性的DM序列，優(yōu)選從50%至98%的同源性，最優(yōu)選從75%至95%的同源性。這樣的DM序列可包含核苷酸的取代、添加或刪除，其造成使SEQ.IDNO:2中所示氨基酸序列的改變低于60%，優(yōu)選低于45%，更優(yōu)選低于25%。核苷酸取代可造成保守氨基酸取代。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，其提供由上述定義的DNA序列編碼的酶。該酶可以包含由SEQ.IDNO:2所示的氨基酸序列或其片段。根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，其提供重組的載體，優(yōu)選為包含上述定義的DM序列的表達(dá)載體。這樣的載體可導(dǎo)入到例如細(xì)菌、酵母或真菌細(xì)胞的宿主細(xì)胞中。備選地，該DNA序列可以導(dǎo)入到該宿主細(xì)胞中。適合的宿主細(xì)胞可選自雙歧桿菌、乳球菌(Lactococcus)、乳桿菌(Lactobacillus)、以枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilus)或環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)為例的芽胞桿菌(Bacillus)、埃希氏腸桿菌(Escherichia)和以黑曲霉(Aspergillusniger)為例的曲霉(Aspergillus)。使用乳糖作為底物、上述定義的DNA序列編碼的酶生成低聚糖混和物，其包含例如Gal(p1-3)Glc、Gal(P1-3)Gal、Gal(|3l-6)Gal和Gal(ocl-6)Gal的二糖，例如Gal(P1-6)Gal(P1-4)Glc)、Gal(Pl-3)Gal(pi-4)Glc和Gal(P1-6)Gal(P1-6)Gal(P1-4)Glc的三糖和四糖。上述酶或宿主細(xì)胞可用于生產(chǎn)可構(gòu)成產(chǎn)品成分以改善腸道健康的低聚半乳糖混合物。該類產(chǎn)品可以選自乳產(chǎn)品(例如液體奶、以全脂奶粉為例的干奶粉、脫脂奶粉、添脂奶粉、乳清粉、嬰兒奶、嬰兒配方、冰淇淋、酸奶、奶酪、發(fā)酵乳產(chǎn)品)、以果汁為例的飲料、嬰兒食品、谷物、面包、餅干、糖果、蛋糕、食品添加劑、飲食添加劑、動物飼料、家禽飼料或確實(shí)的任何其它食品或飲料。該類產(chǎn)品中存在的低聚半乳糖的優(yōu)勢在于，在產(chǎn)品或在攝入產(chǎn)品后消費(fèi)者的腸道菌群中或者在二者兼有中可增強(qiáng)促健康的雙歧桿菌的生長。備選地由此生產(chǎn)的低聚糖可以用于藥物的制備，例如以片劑或膠嚢形式用于阻止由病菌產(chǎn)生的病原體或毒素在腸道壁上的粘附。該藥物可以施用于病人，例如在經(jīng)常改變或者甚至破壞正常健康腸道菌群的抗生素治療療程之后進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明更深入的又一方面，提供了生產(chǎn)如上定義的酶的方法，包括在適合的培養(yǎng)基中和在允許酶表達(dá)的條件下培養(yǎng)如上宿主細(xì)胞，并且從培養(yǎng)物中回收所得酶或酶產(chǎn)品。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)低聚半乳糖混和物的方法，其包括在可致使生成低聚半乳糖混和物的條件下使如上酶接觸含乳糖原料。適合的含乳糖原料可選自市售乳糖、全脂奶、半脫脂奶、脫脂奶、乳清、添脂奶和透析乳清。該類奶產(chǎn)品可從奶牛、水牛、綿羊或山羊獲得。添脂奶定義為經(jīng)脫脂除去乳脂繼而由添加的植物脂肪或油脂替代的全脂奶。附圖簡述圖1顯示本發(fā)明中雙歧雙歧桿菌(3-半乳糖苷酶的核苷酸序列(SEQ.IDNO:1);并且圖2顯示對應(yīng)于圖l核苷酸序列的氨基酸序列(SEQ.IDNO:2)。圖3為顯示低聚半乳糖合成的時(shí)程反應(yīng)圖，使用(3-半乳糖苷酶和在pH值為6.0的每升0.1摩爾的磷酸緩沖液中40%(重量比)濃度的乳糖作為底物；并且圖4顯示低聚半乳糖混合物(由源自雙歧雙歧桿菌NCIMB41171的p-半乳糖苷酶使用在每升0.l摩爾pH值為6.0的磷酸緩沖液中40%(重量比)濃度的乳糖為底物所合成)的高離子交換性能(Glc為葡萄糖，Gal為半乳糖，Lac為乳糖，a(l-6)為半乳二糖，DP為聚合度)。使用Lawson等人(1989)FemsMicrobiolLetters,65，(1-2)，41-45的方法從雙歧雙歧桿菌菌林(NCIMB41171)中分離得到基因組DM。用限制性內(nèi)切酶將DNA消化，并將最大為15kbp(bp堿基對)的片段與已經(jīng)用相同限制性內(nèi)切酶消化的pSP72載體連接。將載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞中，載體含有由經(jīng)Pstl、EcoRI、BamHI、Kpnl、Smal或Hindlll消化的雙歧雙歧桿菌染色體DM組成的插入片段。在含有p-硝基苯、X-P-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-P-D-半乳糖苷)和異丙基-e-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB(LuriaBertani)瓊脂平板上篩選出具有p-半乳糖苷酶活性的克隆。PstI處理的染色體DM連接混合物產(chǎn)生13個(gè)p-半乳糖苷酶陽性克隆，其中一個(gè)確定為pP2。對插入的DNA片段P2的DNA測序通過運(yùn)用Sanger的雙脫氧鏈終止法(RusselP.，2002iGenetics,PearsonEducation,Inc.,SanFrancisco,187-189)使用BigDyeTerminatorV.3.O循環(huán)測序試劑盒)(AppliedBiosystems，USA)完成。P2的DNA序列由圖1所示(SEQ.IDNO:1)。使用NCBI(NationalCenterofBiotechnologyInformation,生物技術(shù)信息國家中心)的0RF搜尋器(ORFfinder)尋找開放讀碼框(0RF)。將圖1的核普酸序列按所有6個(gè)可能的開放讀碼框進(jìn)行翻譯，并且確定了一個(gè)738氨基酸、編碼可能的p-半乳糖苷酶的開放讀碼框。圖2顯示翻譯結(jié)果(SEQ.IDNO:2)。本發(fā)明將以下列實(shí)施例為參考進(jìn)一步進(jìn)行闡述。實(shí)施例1材料和方法本研究中所用所有化學(xué)藥品和基質(zhì)制劑從Sigma(Dorset,UK),Invitrogen(Paisley,UK),Oxoid(Basingstoke,UK)，Qiagen(WestSussex,UK)和Promega(Southampton,UK)獲得。細(xì)菌菌林雙歧雙歧桿菌菌林(NCIMB41171)從零下70。C微生物庫(Microbank)管中的低溫珠上獲得。為了后續(xù)實(shí)驗(yàn)將菌林在WilkinsonChalgren(WC)瓊脂(Oxoid，UK)和TPY(胰胨植胨酵母提取物培養(yǎng)基)培養(yǎng)基上復(fù)蘇并在37。C無氧(二氧化碳和氮?dú)獾慕M成分別為80%和20%)生長48小時(shí)。通過革蘭氏染色檢驗(yàn)菌落形態(tài)和無污染。大腸桿菌菌抹本研究中所用的大腸桿菌菌林DH5a通常于37'C有氧條件下在UriaBertani(LB)瓊月旨培養(yǎng)基或培養(yǎng)液(SambrookJ.andRussellW,D.(2001).MolecularCloning:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork)中培養(yǎng)，并且必要時(shí)添加抗生素(100jug/ml的氨節(jié)青霉素和/或的15|ng/ml氯霉素/和在90毫米預(yù)制瓊脂平板表面上涂加40微升2%的X-P-Gal和7微升20%的異丙基-(3-D-硫代半乳糖苷。E.coliDH5a菌才朱(Invitrogen，Paisley,UK)(基因型F—cj)801acZAMA(lacZYA-argF)U169recAlendAlhsdR17(rk—，mk_)phoAsupE44thi-1gyrA96relAU—)為a-半乳糖苷酶陽性菌抹并用于表達(dá)實(shí)驗(yàn)和其它基因操作。從雙歧桿菌中提取基因組DNA使用下述方法從雙歧雙歧桿菌菌林(NCIMB41171)中分離基因組DM，其中染色體DNA由從100毫升WC厭氧培養(yǎng)液中收集的細(xì)胞團(tuán)塊制備。細(xì)胞用lO毫升TES緩沖液(lOmMTris-HC1,10mMEDTA,10mMNaCl，pH值為8)重懸并用200微升溶菌酶/變?nèi)芫鼗旌臀?4:1，溶菌酶每毫升10毫克、變?nèi)芫?mutanolysin)每毫升1毫克)在37攝氏度處理30分鐘。然后用200微升蛋白酶K(為20mg/ml)和200微升RM酶(均為10mg/ml)處理，并于65攝氏度溫育1小時(shí)。最后將細(xì)胞用2毫升10%的SDS處理，在65攝氏度溫育15分鐘。加入12毫升酚/氯仿并且重復(fù)提取至水相能從界面輕松分離。用異丙醇沉淀基因組DNA并10mMTris-HCl一1raMEDTA(pH8)溶液重懸。然后用限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA,連接到用相同限制性內(nèi)切酶消化并用堿性磷酸酶處理的PSP72上。使用EcoRI、Pstl、BamHI、Smal和Kpnl對雙歧雙歧桿菌基因組DNA進(jìn)行消化。連接混和物用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5oc，并在含有X-Gal的平板上以藍(lán)色菌落鑒別(3-半乳糖苷酶的陽性菌落。載體應(yīng)的制備本研究中用于克隆和表達(dá)的載體始終為PSP72(Promega，UK)(Krieg，P.A.和Melton，D.A.(1987)。使用SP6RNA聚合酶體外合成RM。MethodsinEnzymology.155:397-415)。選擇該載體是由于其缺少j3-半乳糖苷酶oc-片段(其不由pSP"編碼)的互補(bǔ)活性。該載體不攜帶含有(3-半乳糖苷酶的前146個(gè)氨基酸的調(diào)控序列和編碼信息的大腸桿菌DM短片段，其片段與表達(dá)(3-半乳糖苷酶碳末端部分的大腸桿菌菌林(即DHSoc)相結(jié)合產(chǎn)生有活性的P-半乳糖苷酶(ot-互補(bǔ))。、BamHI、HindIII、Smal、Kpnl和EcoRI消化栽體，根據(jù)廠商說明將十倍過量的酶使用于DNA(酶單位微克DNA等于每一微克質(zhì)粒DNA或每0.5pmol質(zhì)粒DNA用10個(gè)酶單位)。在酶熱失活(于65攝氏度二十分鐘)之后，通過水平凝膠電泳分析對限制性圖鐠進(jìn)行分析。在該凝膠中的單個(gè)片段的存在顯示了完整載體消化和它的單限制性消化。栽體的充分消化也通過轉(zhuǎn)化未連接分子到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行檢測。在添加氨節(jié)青霉素(100ingr/ml)的LB瓊脂平板上形成的克隆數(shù)作為未消化分子和在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中預(yù)期背景的指示。進(jìn)一步根據(jù)廠商說明使用小牛腸內(nèi)堿性磷酸酶CIAP(Promega，Southampton,UK)將栽體去磷酸化。該處理的效率通過連接(根據(jù)廠商說明使用噬菌體T4DNA連接酶)之后轉(zhuǎn)化至DH5ot細(xì)胞中進(jìn)行檢測。形成的菌落數(shù)量顯示了重新環(huán)化的分子(無克隆的載體)的數(shù)量，并且對未經(jīng)CIAP處理的載體所形成的克隆將以上數(shù)量扣除后顯示了未去磷酸化載體的數(shù)量?；蚪MDNA文庫的構(gòu)建將基因組DNA用六種識別常存在于原核生物DNA中的六核苷酸序列的限制酶進(jìn)行部分消化。EcoRI、BamHI、Pstl、Kpnl、Smal和HindIII為二型限制性內(nèi)切酶，分別特異性地識別序列5'G/AATTC'3、5'G/GATC(y3、5'CTGCA/G'3、5'GGTAC/C3'、5'CCC/GGG3'和5'A/AGCTT3'，并且在這些序列中產(chǎn)生雙鏈斷裂，對于EcoRI、BamHI和HindIII分別形成AATT、GATC、AGCT四個(gè)核苷酸的5，突出端，對于Pstl和Kpnl分別形成ACGT、GTAC的3，突出端并且對Smal形成平末端。所有這些酶只有在二價(jià)鎂離子的存在下具有活性并能夠斷開DNA。該離子為唯一必需的輔因子。DNA的限制性消化基因組DNA樣品的所有限制性消化在37攝氏度溫育兩小時(shí)并最終在65攝氏度熱失活20分鐘。將反應(yīng)冷卻到室溫并加入適量的加樣緩沖液，隨后用封口的玻璃毛細(xì)管溫和混合。然后將溶液上樣至到0.8%瓊脂糖凝膠的加樣孔內(nèi)(能源供給4-5伏/厘米，14-16小時(shí))。通過lkbpDNA標(biāo)準(zhǔn)對消化的DNA進(jìn)行估算(Promega，UK)(SambrookJ.MolecularCloning:ALaboratoryManual(2002))。純化限制性消化生成的片段通過使用Qiagen的QIAEX凝膠提取試劑盒完成從反應(yīng)混和物和瓊脂糖凝膠中片段的純化(WestSussex,UK)。流程在廠商手冊中有詳細(xì)說明。DM連接和轉(zhuǎn)化用Qiaex凝膠提取試劑盒純化DNA片段后，將其與CIAP處理后的pSP72載體連接。按表格1所示將適量的DNA轉(zhuǎn)移至滅菌的0.5毫升微離心管用于連接。管DNAA栽體(15飛摩爾[約29.7納克])B栽體(15飛摩爾約29.7納克DNA)加上插入片段(夕卜源物/15飛摩爾約69.3納克)CpUC對照(0.056飛摩爾[約100皮克])連接反應(yīng)中質(zhì)粒DNA對插入DNA片段的摩爾比應(yīng)當(dāng)為大約1:1。DM終濃度應(yīng)當(dāng)為每微升約10納克。格l:連接混和物。管A顯示自連的載體DM數(shù)量，必須將其從轉(zhuǎn)化后的總轉(zhuǎn)化林?jǐn)?shù)量中減去。管B顯示載體與DNA片段的連接，并且管C顯示為了計(jì)算轉(zhuǎn)化效率的對照。在每次連接之前DNA片段在45攝氏度加熱5分鐘以(熔解)任何在片段制備過程中重新退火的粘性末端。對所有連接反應(yīng)選擇栽體插入DNA的摩爾比為1:1并且根據(jù)Promega的說明完成反應(yīng)裝置。對管A和管B加入1.0微升十倍連接酶緩沖液和0.5Weiss單位的T4DNA連接酶(Promega，UK)并且用分子生物學(xué)級別水將連接體積調(diào)整至10微升。對管C加入1.0微升十倍連接酶緩沖液并用分子生物學(xué)級別水將連接體積調(diào)整至IO微升。將DM片段和水加入管中然后加熱至45攝氏度(處理)5分鐘以熔解任何在制備過程中重新退火的粘性末端。在加入剩余連接試劑之前將DNA冷卻至(TC，并且將反應(yīng)混和物在16。C溫育過夜(SambrookandRussell,2001)。在連接片段的乙醇沉淀和純化之后(目的為除去導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率降低的連接混合物)根據(jù)Hanahan說明進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將5微升溶液中約50納克已連接的DM加入IOO微升適當(dāng)?shù)腄H5a細(xì)胞。在熱處理和氨千青霉素抗性基因表達(dá)之后，將細(xì)胞涂布于含有氦千青霉素(100jagr/ml)、X-P-Gal(40微升2%的X-P-Gal)和IPTG(7微升20%的IPTG)的LB平板上。計(jì)算每個(gè)連接反應(yīng)的轉(zhuǎn)化林?jǐn)?shù)量(對每個(gè)連接反應(yīng)的轉(zhuǎn)化林?jǐn)?shù)量進(jìn)行計(jì)算)。從管C獲得的轉(zhuǎn)化林?jǐn)?shù)量通常為2xl05-lxl06cfu/jjg，而來自管A的為500-600cfu/jug。管A的轉(zhuǎn)化林?jǐn)?shù)量是對載體DNA有效處理的指示。管B的轉(zhuǎn)化林?jǐn)?shù)量在2-4xl(Tcfu/Mg菌落/微克的范圍內(nèi)。轉(zhuǎn)化株數(shù)量Pstl處理的染色體DM的連接混和物在約2500個(gè)被篩選轉(zhuǎn)化林中產(chǎn)生13個(gè)P-半乳糖苷酶陽性克隆，而BamHI處理的產(chǎn)生7個(gè)陽性克隆(約1500個(gè)被篩選轉(zhuǎn)化林)，EcoRI的產(chǎn)生3個(gè)陽性克隆(約1300個(gè)被篩選轉(zhuǎn)化林)，Kpnl的產(chǎn)生7個(gè)陽性克隆(約2000個(gè)被篩選轉(zhuǎn)化林)，Smal的產(chǎn)生3個(gè)陽性克隆(約1600個(gè)被篩選轉(zhuǎn)化株)，以及HindIII的產(chǎn)生2個(gè)陽性克隆(約1200個(gè)被篩選轉(zhuǎn)化林)。陽性克隆消化為了鑒定不同的P-半乳糖苷酶基因，根據(jù)下列表格對從陽性克隆分離的質(zhì)粒進(jìn)行消化樣品酶第一種消化pBl，pB2，pB3，pB4,pB5，pB6，pB7BamHI第二種消化pPl,pP2，pP3,pP4,pP5,pP6，pP7,pP8，pP9,pP10,pPllPstl第三種消化pP12'pP13,pP14Pstl第四種消化pEl，pE2，pE3EcoRI第五種消化pPl,pP12，pBl,pP2，pEl，pB2，pE3.......Pstl和EcoRI第六種消化pSl,pS2，pS3Smal第七種消化pPl，pP12,pBl,pP2，pSl,pS2，pS3Pstl和Sinal第八種消化pKl,pK2，pK3，pK4，pK5，pK6，pK7Kpnl第九種消化pPl,pP12,pBl，pP2，pKl,pK2，pK3,pK4，pK5,pK6，pK7Pstl和Kpnl第一個(gè)字母(p)表示質(zhì)粒和插入基因，而第二個(gè)字母(P、B、E、S、K)表示用于從基因組DNA中分離各自克隆的限制酶。消化后對產(chǎn)生的片段進(jìn)行的凝膠電泳分析表明，質(zhì)粒pBl、pPl、pP2和pPll分別含有編碼不同P-半乳糖苷酶的插入片段。將含有P2的克隆用于進(jìn)一步分析。DNA測序通過使用BigDyeTerminatorV.3.0循環(huán)測序試劑盒(AppliedBiosystems，USA)以Sanger的雙脫氧鏈終止法進(jìn)行DNA測序，并且用整合有毛細(xì)管電泳基于熒光的DNA分析系統(tǒng)——ABIPrism3100進(jìn)行分析。使用載體的特異引物對插入DM片段的5，-和3，-末端進(jìn)行測序。使用(基因組引發(fā)系統(tǒng)GenomePrimingSystem)(GPS-1)(NewEnglandBiolabs，Uk)對插入片段進(jìn)一步測序。GPS-1為基于TN7轉(zhuǎn)座子的體外系統(tǒng)，使用TnsABC轉(zhuǎn)座酶在目標(biāo)DNA中隨機(jī)插入轉(zhuǎn)座子。根據(jù)廠商說明使用供體目標(biāo)DNA為1:4的質(zhì)量比。在轉(zhuǎn)座引物(Transprimer)插入至目標(biāo)質(zhì)粒后用于測序的分離所得的質(zhì)粒數(shù)量為25。該數(shù)量根據(jù)廠商說明進(jìn)行計(jì)算并且釆用了5倍深度的覆蓋度。由于編碼P2蛋白質(zhì)的pP2質(zhì)粒具有長核苷酸序列，只選擇了含有P-半乳糖苷酶基因的部分進(jìn)行測序。在被測序片段172bp的相對位置處轉(zhuǎn)座酶插入的插入片段造成的酶失活表明起始密碼子在該位置的上游。類似地，在位置2882bp插入的插入片段使酶活性完全喪失表明終止密碼子在該位置的下游。此外，在相對于測序出的第一位核苷酸的位置為262bp，331bp，375bp，621bp，866bp，1348bp，1358bp，1394bp1513bp,1704bp，2128bp，2519bp處插入的插入片段使酶活性完全喪失。使用SignalIP和PSORT軟件對N末端區(qū)域進(jìn)行分析表明沒有任何信號肽，說明P2不會分泌到細(xì)胞外。測序反應(yīng)混和物包含約400-600ng質(zhì)粒DNA、3.2pmol引物溶液和4ju1BigDye終止溶液。開放讀碼框的鑒定通過使用NCBI網(wǎng)址(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)上ORF搜尋器將P2的開放讀碼框(ORF)定位。使用了細(xì)菌的遺傳編碼并且將讀碼框長度確定為100bp。將核苷序列按所有六種可能的讀碼框進(jìn)行翻譯，并且鑒定了編碼可能的P-半乳糖苷酶的738個(gè)氨基酸的開放讀碼框(圖2顯示翻譯結(jié)果)。實(shí)施例2在大腸桿菌(菌株DH5a)宿主中使用從雙歧雙歧桿菌NCIMB41171分離所得的13-半乳糖苷酶克隆酶進(jìn)行合成以下所述的合成，除非另作聲明，在對大腸桿菌生物質(zhì)(通過10000g的離心收集)用2000ppm濃度的甲苯處理后對完整的大腸桿菌DH5a宿主細(xì)胞進(jìn)行處理，目的為增加細(xì)胞通透性并且也通過破壞其細(xì)胞膜致使細(xì)胞死亡。大腸桿菌生物質(zhì)按實(shí)施例1中"大腸桿菌菌林，，所述進(jìn)行制備。使用克隆的酶進(jìn)行的合成在起始乳糖濃度為40%(重量比)的底物濃度下用^-半乳糖苷酶進(jìn)行合成。合成溶液在含有添加的lg/1吐溫80(polyoxyethylene(20)sorbitonmonooleate聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸脂)的pH值6.0的0.1M磷酸緩沖液中制備。在40攝氏度的振蕩水浴以150rpm進(jìn)行合成。根據(jù)對特定酶制劑在不同pH值時(shí)活性的測量(使用o-硝基苯基-p-D-半乳吡喃糖普作為底物)選擇對特定酶最佳的pH值。對于低聚半乳糖的合成，對8克50%(重量比)的乳糖使用2毫升細(xì)胞裂解上清(使用法式壓釜破碎大腸桿菌細(xì)胞之后)以產(chǎn)生濃度為40%(重量比)的最終底物。該酶制劑的活性為735U/ml。合成中混和物中存在的不同糖濃度由圖3顯示。對低聚半乳糖混合物(用克隆自雙歧雙歧桿菌NCIMB41171的半乳糖苷酶所合成)的高性能離子交換層析偶聯(lián)脈沖電流檢測(HPAEC-PAD)的層析傳由圖4顯示。在最佳合成時(shí)間點(diǎn)低聚半乳糖混和物的糖含量由表1顯示。表1.起始乳糖濃度為40%(重量比)在觀察到最高低聚糖濃度的時(shí)間點(diǎn)時(shí)低聚半乳糖合成的碳水化合物組成<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>權(quán)利要求1.DNA序列，該序列a)編碼由SEQ.ID.NO2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或b)在嚴(yán)格雜交條件下與a)的序列的雜交，或c)a)或b)序列的簡并物。2.根據(jù)權(quán)利要求1的DM序列，其中序列由SEQ.IDNO:1或是其片段。3.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的DM序列，其中所述序列包含核苷酸取代、添加或刪除，所述核苷酸取代、添加或刪除導(dǎo)致根據(jù)SEQ.IDNO:2或其片段的氨基酸序列的變化少于60%，優(yōu)選少于45。/。，更優(yōu)選少于25D/o。4.根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的DM序列，其中所述序列包含導(dǎo)致保守氨基酸取代的核苷酸取代。5.由權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的DNA序列所編碼的酶。6.包含根據(jù)SEQ.IDNO:2或其片段的氨基酸序列的酶。7.具有由SEQ.IDNO:2定義的序列的P-半乳糖苷酶。8.包括權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的DNA序列的重組載體。9.根據(jù)權(quán)利要求8的載體，其中所述載體是表達(dá)載體。10.包含權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的DNA序列的宿主細(xì)胞。11.包含權(quán)利要求8或權(quán)利要求9的栽體的宿主細(xì)胞。12.根據(jù)權(quán)利要求IO或權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或者真菌細(xì)胞。13.根據(jù)權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞選自雙歧桿菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬、大腸桿菌屬、芽胞桿菌屬和曲霉菌屬。14.根據(jù)權(quán)利要求13的宿主細(xì)胞，其中細(xì)胞選自雙歧雙歧桿菌、枯草芽胞桿菌、環(huán)狀芽胞桿菌和黑曲霉。15.權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)的酶，或權(quán)利要求10至14任一項(xiàng)細(xì)胞的用途，其用于生產(chǎn)低聚糖的混合物。16.權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)的酶，或權(quán)利要求10至14中任一項(xiàng)的細(xì)胞的用途，其用于生產(chǎn)用作下述產(chǎn)品的一部分的低聚糖的混合物，所述產(chǎn)品選自以液體奶、干奶粉、嬰兒奶、嬰兒配方、冰洪淋、酸奶、奶酪、發(fā)酵乳產(chǎn)品為例的乳產(chǎn)品；以果汁為例的飲料、嬰兒食品、谷物、面包、餅干、糖果、蛋糕、食品添加劑、飲食添加劑、益生菌食用產(chǎn)品、益生素食用產(chǎn)品、動物祠料、家禽飼料和藥物。17.權(quán)利要求10至14任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞的用途，其用于生產(chǎn)所述產(chǎn)品，所述產(chǎn)品選自以液體奶、干奶粉、嬰兒奶、嬰兒配方、冰洪淋、酸奶、奶酪、發(fā)酵乳產(chǎn)品為例的乳產(chǎn)品；以果汁為例的飲料、嬰兒食品、谷物、面包、餅干、糖果、蛋糕、食品添加劑、飲食添加劑、益生菌食用產(chǎn)品、益生素食用產(chǎn)品、動物飼料、家禽飼料和藥物。18.生產(chǎn)權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)的酶的方法，包括在合適的培養(yǎng)基中在允許該酶表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求10至14任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，并且從培養(yǎng)物中回收所產(chǎn)生的酶。全文摘要本發(fā)明涉及一種分離自雙岐雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)具有半乳糖基轉(zhuǎn)移活性的新β-半乳糖苷酶。該β-半乳糖苷酶能夠?qū)⑷樘寝D(zhuǎn)化為β-鍵合的低聚半乳糖混合物，并且意外地生成α-鍵合的半乳二糖。該混合物可以添加到多種食品產(chǎn)品或者動物飼料中，通過促進(jìn)腸道雙歧桿菌生長并抑制病原微生物生長以改善腸道健康。文檔編號C12N5/10GK101410512SQ200780010727公開日2009年4月15日申請日期2007年3月27日優(yōu)先權(quán)日2006年3月28日發(fā)明者A·K·古拉斯,G·恰佐爾提斯,T·古拉斯申請人:科拉薩多公司