專利名稱：新型肌醇六磷酸酶及編碼該新型肌醇六磷酸酶的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種價(jià)格低廉，對(duì)于植酸有低的米氏常數(shù)(下文縮寫為Km)的肌醇六磷酸酶，它可降解飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子-植酸，由此提高飼料的營價(jià)值并可有效利用降解釋放出的磷酸；本發(fā)明也涉及了編碼此肌醇六磷酸酶的基因。
背景技術(shù)：
對(duì)于所有生物來說，磷是一種基本元素。用于喂養(yǎng)家畜的、植物來源的飼料中含有50-70％以植酸形式存在的磷。植酸是主要的貯存磷酸的物質(zhì)，它大量存在于植物的種子之中。然而，在單胃動(dòng)物如豬、雞等，植酸不經(jīng)過消化器官的消化和吸收就被排泄出來。也就是說，植酸是磷酸的貯存物質(zhì)，然而其中的磷酸根本得不到利用。相應(yīng)地，必需將磷酸加于單胃動(dòng)物的飼料中以促進(jìn)其生長。
飼料中添加的磷導(dǎo)致了排泄物中磷含量的增加。最近幾年中，隨著家畜飼養(yǎng)量的增加，動(dòng)物的排泄物有很大的增加，由此導(dǎo)致了世界范圍內(nèi)的環(huán)境問題。特別是，排泄物中磷被認(rèn)為是導(dǎo)致湖泊和沼澤中營養(yǎng)富集現(xiàn)象一個(gè)因素，因此排泄物中磷的量應(yīng)受到調(diào)節(jié)，提出針對(duì)這一問題的措施迫在眉睫。
除了排泄物中磷這一問題，植酸能夠螯合作為營養(yǎng)源的二價(jià)金屬離子，如鎂，鈣，鋅和鐵，使得它難以被動(dòng)物吸收而降低了飼料的營養(yǎng)價(jià)值。因此，植酸被認(rèn)為是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子。
以前曾有人嘗試通過用一種肌醇六磷酸酶處理飼料以降低排泄物中磷的含量，這種肌醇六磷酸酶能將一種植酸鹽水解成肌醇和無機(jī)磷酸以利用植酸中釋放出的磷酸而取代常規(guī)添加于飼料中的磷酸，也有人嘗試通過降解抗?fàn)I養(yǎng)因子植酸以提高飼料的營養(yǎng)價(jià)值[美國專利No.3297548(1967)；營養(yǎng)雜志101,1289-1294(1971)]。
已知的產(chǎn)生肌醇六磷酸酶的微生物包括細(xì)菌如枯草芽孢桿菌和假單孢菌屬，酵母如啤酒糖酵母，絲狀真菌如土曲霉(Aspergillusterreus),Aspergillus Ficcum和泡盛曲霉(Aspergillusawamori)。
對(duì)于來源于Aspergillus Ficcum的肌醇六磷酸酶，其純化及生化特征在[制備生物化學(xué)；18,443-458(1988)]中有所描述，其基因和氨基酸序列發(fā)表于[基因，127,87-94(1993)]。對(duì)于源自泡盛曲霉的肌醇六磷酸酶，其核苷酸序列和氨基酸序列在基因，133,55-62(1993)中有所描述。
迄今所知的肌醇六磷酸酶中，源于麩皮的肌醇六磷酸酶的米氏常數(shù)為0.57mM[農(nóng)業(yè)生物化學(xué)26,794-803(1962)]，源于稻皮的肌醇六磷酸酶的Km值為0.17mM[農(nóng)業(yè)生物化學(xué)53,1475-1483(1988)]，對(duì)于源于玉米(Zea mays)的肌醇六磷酸酶，其Km值為117mM，源于Aspergillus Ficcum的肌醇六磷酸酶Km值為250μM(WO91/05053)，米曲霉來源的肌醇六磷酸酶Km值為330μM，枯草芽孢桿菌來源的肌醇六磷酸酶Km值為150μM，源于納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)的肌醇六磷酸酶Km值為500μM，源于大腸桿菌的肌醇六磷酸酶Km值為130μM。
為了發(fā)揮某一種酶的作用，底物的濃度必須大于Km值，如果低Km值的與高Km值的酶具有相同的最大反應(yīng)速率(Vmax)，與高Km值的酶相比，當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，低Km值的酶反應(yīng)速度不會(huì)降低。
也就是說，與高Km值的酶相比，低Km值的酶具有優(yōu)勢，因?yàn)榧词沟孜餄舛容^低，也能達(dá)到最大反應(yīng)速率，由此降低了剩余底物的量。
相應(yīng)地，需要一種對(duì)于植酸有低的Km值，價(jià)格低廉的肌醇六磷酸酶，它可用于降解飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子-植酸，由此提高飼料的營價(jià)值并可有效利用降解釋放出的磷酸。
發(fā)明描述本文涉及一種肌醇六磷酸酶(下文稱之為新型肌醇六磷酸酶)，當(dāng)用植酸作底物時(shí)，其米氏常數(shù)為10-30μM，本發(fā)明也涉及了編碼此肌醇六磷酸酶的DNA。包含有該DNA整合其中的重組DNA，攜帶該重組DNA的轉(zhuǎn)化子，利用該轉(zhuǎn)化子制備肌醇六磷酸酶的方法，一種利用該肌醇六磷酸酶制備的飼料。
以下將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
本發(fā)明新型肌醇六磷酸酶的特點(diǎn)包括一種具有下述下物理化學(xué)特性的肌醇六磷酸酶
<1>Km值10-30μM；<2>分子量(通過SDS-PAGE)用內(nèi)切糖苷酶H處理后為60KDa；<3>最適pH值pH5.0-6.5；<4>最適溫度45-65℃時(shí)，具最大活性<5>底物特異性可-作用的底物有，植酸，對(duì)硝基苯磷酸，D-葡萄糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸，D-myo-肌醇-1,4,5-三磷酸，甘油磷酸和ATP；及<6>等電聚焦pI4.7-5.4。
具有SEQ ID No.1或2所示氨基酸序列的一種肌醇六磷酸酶。
更進(jìn)一步地，本發(fā)明包括一種新型肌醇六磷酸酶(如SEQ IDNO:3)所示，它的氨基酸序列在上述新型肌醇六磷酸酶上連接有分泌信號(hào)序列。
本發(fā)明進(jìn)一步包括在SEQ ID No.1,2或3基礎(chǔ)上替換、刪除或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸所形成的氨基酸序列的一種肌醇六磷酸酶；它與SEQ ID NO:1,2或3的序列具有40％或更大的氨基酸序列同源性；當(dāng)用植酸作為底物時(shí)，其米氏常數(shù)為10-30μM。優(yōu)選地，該肌醇六磷酸酶具有60％或更大的同源性，更優(yōu)選地，其同源性可達(dá)80％或更大。
氨基酸替換、刪除或添加可根據(jù)下面雜志所述進(jìn)行。核酸研究，10,6487(1982)，美國國家科學(xué)院院報(bào)79,6409(1982)美國國家科學(xué)院院報(bào)81,5662(1984)科學(xué)，224,1431(1984),PCTWO85/00817(1985)；自然，316,601(1985)，基因34,315(1985)，核酸研究，13,4431(1985)《現(xiàn)代分子生物學(xué)方法》，第八章，“克隆DNA的突變”John Wiley & Sons,Inc(1989)，等。
可以從任何產(chǎn)生此新型肌醇六磷酸酶的微生物中得到此酶。其中，優(yōu)選的例子是屬于曲霉屬且具有產(chǎn)生該新型肌醇六磷酸酶能力的微生物，更優(yōu)選的例子包括黑曲霉SK57(FERN BP-5473)或其突變株或由其衍生出的株系。黑曲霉SK92(FERN BP-5481)為源于黑曲霉SK57的突變株。
編碼本發(fā)明的新型肌醇六磷酸酶的基因(后稱之為新型肌醇六磷酸酶基因)可以是編碼該新型肌醇六磷酸酶的任何基因例如，編碼肌醇六磷酸酶的基因可具有SEQ ID NO:1,2或3的氨基酸序列的一個(gè)基因；或編碼肌醇六磷酸酶的基因可具有SEQ ID NO:1,2或3的一個(gè)氨基酸序列，其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、刪除或添加，當(dāng)用植酸作底物時(shí)，其米氏常數(shù)為10-30μM。此基因內(nèi)可包含內(nèi)含子。特別地，本發(fā)明的基因包含如SEQ ID NO:4所示的DNA，或SEQ ID NO:5所示的序列中包含內(nèi)含子的DNA。
進(jìn)一步地，本發(fā)明的新型肌醇六磷酸酶基因包括能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與上述定義的DNA進(jìn)行雜交，而且能夠產(chǎn)生相應(yīng)的肌醇六磷酸酶活性的DNA。
在此描述的術(shù)語“能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的DNA”指的是可用菌落雜交，噬斑雜交或Southern印跡雜交得到的DNA，其中包含于SEQID No.4或5的任何DNA序列可作為探針。其中的一個(gè)具體例子是通過將DNA與源于菌落或噬斑并固定于濾膜上的DNA在0.7-1.0M NaCl中于65℃雜交然后用65℃的0.1-2×SSC溶液洗膜(1×SSC溶液包含150mM氯化鈉及15mM檸檬酸鈉)。
雜交可受《分子克隆》實(shí)驗(yàn)手冊(cè)中所描述的方法影響。《分子克隆》實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，Sambrook,Fritsch,Maniatis,Cold SpringHarbor laboratory Press(1989)(下文簡寫為“分子克隆，第二版”)。具體地，能夠雜交的DNA包括與SEQ ID NO:4或5的序列有60％或更大，優(yōu)選地，80％或更大，更優(yōu)選地，95％或更大的同源性。
包含有新型肌醇六磷酸酶基因的DNA片段可以從具有產(chǎn)生此新型肌醇六磷酸酶能力的任何微生物中得到。盡管任何具有產(chǎn)生此新型肌醇六磷酸酶能力的微生物都可應(yīng)用，優(yōu)選的例子是屬于曲霉屬且具有產(chǎn)生該新型肌醇六磷酸酶能力的微生物，更優(yōu)選的例子包括黑曲霉SK57或其突變株或由其衍生出的株系。黑曲霉SK92為源于黑曲霉SK57的突變株。
黑曲霉SK57和黑曲霉SK92分別在1996年3月22日和1996年3月12日以FERM BP-5473和FERM BP-5481保藏于國立生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所，工業(yè)技術(shù)院，日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號(hào)，郵區(qū)305。
進(jìn)一步地，本發(fā)明包括一種含有此新型肌醇六磷酸酶的動(dòng)物飼料。
下文將描述從具有產(chǎn)生此新型肌醇六磷酸酶能力的微生物中獲取編碼該肌醇六磷酸酶基因的方法。
利用一種常規(guī)的DNA分離方法從具有產(chǎn)生該新型肌醇六磷酸酶能力的微生物中制備染色體DNA。例如，酚法[生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)72,619(1963)]，以合適的限制性內(nèi)切酶切割得到的染色體DNA，將限制性內(nèi)切酶切割得到的片段連入載體DNA從而構(gòu)建來自這一微生物的基因組DNA文庫。這個(gè)基因組DNA文庫用以轉(zhuǎn)化微生物宿主。用雜交的方法從上述轉(zhuǎn)化子中篩選包含有新型肌醇六磷酸酶基因的轉(zhuǎn)化子。從選擇出的轉(zhuǎn)化子中可得到包含目的基因的DNA。
上述一系列程序可依本領(lǐng)域已知的體外重組技術(shù)進(jìn)行。(分子克隆，第二版)用以構(gòu)建具有產(chǎn)生新型肌醇六磷酸酶能力的微生物基因組DNA文庫的載體DNA可以是噬菌體載體，質(zhì)粒載體等中的任何一種，它們可在大腸桿菌K12中自主復(fù)制。其中的例子包括，ZAP Express[策略5,58(1992)；Stratagene]；pBluescriptIISK(+)[核酸研究，17,9494(1989),Stratagene],λZapII(Stratagene),λgt10,λgt11[DNA克隆，實(shí)用方法1,49(1985)]LambdaBlueMid(Clonetech),λExCell(Pharmacia),pT7T318U(Pharmacia),pcD2[分子細(xì)胞生物學(xué)，3,280(1983)]和pUC18[基因，33,103(1985)]。
微生物宿主可以是埃希氏桿菌屬的任一微生物，其中的例子包括大腸桿菌XL1-Blue MRF’[策略5,81(1992)；Stratagene]，大腸桿菌C600[遺傳學(xué)，39,440(1954)]，大腸桿菌Y1088[科學(xué)，222,778(1985)]，大腸桿菌Y1090[科學(xué)，222,778(1985)]，大腸桿菌NM522[分子生物學(xué)雜志，166,1(1983)]，大腸桿菌K802[分子生物學(xué)雜志，16,118(1996)]，大腸桿菌JM105[基因，38,275(1985)]，大腸桿菌JM109，大腸桿菌XL1-Blue，大腸桿菌XL2-Blue，大腸桿菌DH1，大腸桿菌MC1000，等。
可通過雜交篩選攜帶有此新型肌醇六磷酸酶基因的轉(zhuǎn)化子。
用于雜交的探針包括依新型肌醇六磷酸酶的一段氨基酸序列合成的寡核苷酸。如果已從與具有產(chǎn)生新型肌醇六磷酸酶能力的微生物密切相關(guān)的一群微生物中得到了另外一個(gè)肌醇六磷酸酶基因，則此基因在某些情況下可用作篩選此新型肌醇六磷酸酶的探針?？梢栽谶@種情況下用作探針的基因包括來自Aspergillus Ficcum的肌醇六磷酸酶基因。
源于Aspergillus Ficcum的肌醇六磷酸酶可用下列方法得到，首先用上述方法制備它的染色體DNA，然后用依據(jù)來自AspergillusFiccum的肌醇六磷酸酶基因DNA序列合成的DNA引物以PCR擴(kuò)增它的肌醇六磷酸酶基因。
DNA引物可用硫代亞磷酸方法在常規(guī)DNA合成儀上合成，如一種DNA合成儀(Shimadzu Seisakusho,Japan)，也可用磷酰亞胺方法在DNA合成儀Model 392(Perkin Elmer)或380A型DNA合成儀(Applied Systems)上合成。用這種方法合成的引物包括SEQ ID NOS:6和7所示的DNA。
用雜交方法篩選到的轉(zhuǎn)化子中包含新型肌醇六磷酸酶基因的DNA可以Sanger等發(fā)明的雙脫氧法進(jìn)行分析[美國國家科學(xué)院院報(bào)，74,5463(1977)]，借此此基因的序列得以測定。如果用自動(dòng)測序儀如SQ-5500DNA測序儀(Hitachi)或373DNA測序儀[Perkin Elmer]測序時(shí)，基因序列分析將會(huì)受到影響。
用這種方法測定的新型肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列包括例如SEQ ID NO4或5的核苷酸序列。
至于其在宿主細(xì)胞中的表達(dá)，這樣得到的新型肌醇六磷酸酶基因可以分子克隆，第二版或現(xiàn)代分子生物學(xué)方法增補(bǔ)1-34中描述的方法進(jìn)行。
首先，以合適限制性內(nèi)切酶或DNase切割包含有新型肌醇六磷酸酶基因的DNA片段以形成包含此新型肌醇六磷酸酶基因、大小合適的DNA片段，然后此DNA片段被插入到表達(dá)載體啟動(dòng)子下游的一段區(qū)域，隨后將插有此DNA片段表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到與之相容的宿主細(xì)胞中。
只要能表達(dá)目的基因的宿主都可應(yīng)用。其中包括埃希氏桿菌屬，沙雷菌屬，棒狀桿菌屬，短桿菌屬，假單孢菌屬，芽孢桿菌屬，小微桿菌屬等的原核細(xì)胞，曲霉屬，根霉菌屬，木霉屬，鏈孢霉屬，毛霉菌屬，青霉屬等的絲狀真菌，克魯維酵母菌屬，糖酵母屬，裂殖糖酵母屬，絲孢酵母屬及許旺氏酵母屬的酵母菌；動(dòng)物細(xì)胞及昆蟲細(xì)胞。
使用的表達(dá)載體能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制或能整合到宿主染色體內(nèi)并且在一個(gè)位點(diǎn)具有啟動(dòng)子以轉(zhuǎn)錄該新型肌醇六磷酸酶基因。
若使用細(xì)菌這樣的原核細(xì)胞作宿主，此新型肌醇六磷酸酶的表達(dá)載體應(yīng)該在微生物中自主復(fù)制并且包含一個(gè)啟動(dòng)子，核糖體結(jié)合序列，此新型肌醇六磷酸酶基因及一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止序列，此載體也可包括一個(gè)調(diào)節(jié)此啟動(dòng)子的基因。
表達(dá)載體包括pKK233-2(Pharmacia)；pSE280(Invitrogen)；pGEMEX-1(Promega)；pQE-8(Qiagen)；pKY10(JP-A-110600/1983)；pKYP200[農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，48,669(1984)],pLSA1[農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，53,277(1989)],pGEL1[美國國家科學(xué)院院報(bào)，82,4306(1985)],pBluescript(Stratagene),pTrs30[從大腸桿菌JM109/pTrs30(FERM BP-5407)制備而來]，pTrs32[從大腸桿菌JM109/pTrs32(FERMBP-5408)制備而來]，pGHA2[包含pGHA2的大腸桿菌以大腸桿菌IGHA2FERM BP-400保藏于國家生物技術(shù)和人類技術(shù)研究所，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)院，日本；見JP-A-221091/1985],pGKA2[包含pGKA2的大腸桿菌以大腸桿菌IGKA2 FERM BP-6798保藏于國家生物技術(shù)和人類技術(shù)研究所，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)院，日本；見JP-A-221091/1985],pTerm2(JP-A-22979/1991),USP 4686191,USP 4939094,USP5160735,pGEX(Pharmacia),pET系統(tǒng)(Novagen)和pSupex。
任何能夠在象大腸桿菌這樣宿主細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子都可應(yīng)用。其中的例子包括來自大腸桿菌，噬菌體等的啟動(dòng)子如trp啟動(dòng)子(Ptrp).lac啟動(dòng)子(Plac),PL啟動(dòng)子和PR啟動(dòng)子。進(jìn)一步地，人工修飾的啟動(dòng)子也可應(yīng)用，這樣的例子包括Ptrpx2啟動(dòng)子(具有兩個(gè)緊密相連的Ptrp啟動(dòng)子)，tac啟動(dòng)子，T7啟動(dòng)子，Plet啟動(dòng)子等。
如果一個(gè)質(zhì)粒中SD序列和起始密碼子之間的距離恰到好處地受到調(diào)節(jié)(如距離6-18個(gè)堿基)，則這個(gè)核糖體結(jié)合序列優(yōu)先地被選用。
盡管任何編碼新型肌醇六磷酸酶的基因可被用作新型肌醇六磷酸酶，其核苷酸可被優(yōu)選地替換以使這個(gè)基因的DNA序列是微生物宿主表達(dá)的最適密碼子。
盡管轉(zhuǎn)錄終止序列不是本發(fā)明的基因表達(dá)必須的，優(yōu)選地，此轉(zhuǎn)錄終止序列應(yīng)位于結(jié)構(gòu)基因的下游緊接的一個(gè)密碼子。
宿主包括埃希氏桿菌屬，沙雷菌屬，棒狀桿菌屬，短桿菌屬，假單孢菌屬，芽孢桿菌屬等的微生物，例如大腸桿菌XL1-Blue大腸桿菌XL2-Blue，大腸桿菌DH1，大腸桿菌MC1000，大腸桿菌KY3276，大腸桿菌W1485，大腸桿菌JM109，大腸桿菌HB101，大腸桿菌NO49，大腸桿菌W3100，大腸桿菌NY49，枯草芽孢桿菌，淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefacines),Brevibacterium immariophilumATCC14068，解糖短桿菌(Brevibacterinm saccharolyticum),ATCC14066，黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC14067，乳發(fā)醇短桿菌(Brevibacterium lactofermentum),ATCC13869，谷晏酯棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032，乙酰乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC 13870和產(chǎn)氨棒桿菌(Microbacterium ammoniphilum)ATCC15354。
若用絲狀真菌作為宿主，表達(dá)載體包括以下幾種，p3SR2[基因，26,295-221(1983)],p KBY2[美國國家科學(xué)院院報(bào)，82,834-838(1985)],pSa123[農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，51,2549-2555(1987)],pSTA4[Mol,Gen.Geneti.218,99-104(1989)],pDJB2[基因，36,321-331(1989)]和pleu4[生物科學(xué)，生物技術(shù)，生物化學(xué)，56,1503-1504(1992)]。
只要在絲狀真菌作為宿主時(shí)能夠誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子都科應(yīng)用。例如，可被淀粉或纖維素強(qiáng)烈誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，如來自曲霉屬的葡糖淀粉酶或α-淀粉酶的或來自木霉屬的纖維素酶(纖維二糖水解酶)的啟動(dòng)子，糖酵解途徑中的酶如磷酸甘油激酶(pgk)和3-磷酸甘油醛脫氫酶(gpd)的啟動(dòng)子等。
盡管任何編碼新型肌醇六磷酸酶的基因可被用作新型肌醇六磷酸酶基因，優(yōu)選的例子是在該新型肌醇六磷酸酶末端連接了分泌信號(hào)序列肽的氨基酸序列編碼的基因，這樣的新型肌醇六磷酸酶可被分泌至微生物細(xì)胞外。具分泌信號(hào)序列肽包括來自曲霉屬的葡糖淀粉酶或α-淀粉酶的分泌信號(hào)序列，或一段具有如SEQ ID NO:2的1-24位氨基酸序列。
宿主包括黑曲霉SK57，米曲霉M-2-3[農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，51,2549-2555(1987)],Aspergillus Ficcum NRRL3135,AspergillusNRRL3112，構(gòu)巢霉IF04340,Trichoderma reesei Rut-C-30[應(yīng)用微生物學(xué)和生物技術(shù)，20,46-53(1984)]，雪白根霉(Rhizopus niveus)M-37[生物科學(xué)，生物技術(shù)，生物化學(xué)，56,1503-1504(1992)]等。
絲狀真菌的轉(zhuǎn)化可以Gomi等的方法[農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，51,2549(1987)]進(jìn)行。
如果酵母被用作宿主，則可用表達(dá)載體如YEp13(ATCC37115),YEp24(ATCC37051)和YCp50(ATCC37419)。
任何能夠在象酵母這樣宿主細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子都可應(yīng)用。其中的例子包括糖酵解途徑中己糖激酶等基因的啟動(dòng)子，gal1啟動(dòng)子，gal10啟動(dòng)子，熱休克蛋白啟動(dòng)子，MFα1啟動(dòng)子和CUP1啟動(dòng)子。
可包括宿主啤酒糖酵母，粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)，乳克魯維氏酵母(Kluyveromyces lactis)，茁芽絲孢酵母(Trichosporon Pullulans)，河岸許旺氏酵母(Schwanniomycesalluvius)等。
重組載體的導(dǎo)入可以將DNA導(dǎo)入酵母的任何方法進(jìn)行，如電穿孔法[酶學(xué)方法194,182(1990)]，原生質(zhì)球法[美國國家科學(xué)院院報(bào)，84,1929(1978)]，乙酸鋰法[細(xì)菌學(xué)雜志153,163(1983)]等。
如果動(dòng)物細(xì)胞用作宿主，可用作表達(dá)載體的有pAGE107[JP-A-22979/1991，細(xì)胞技術(shù)學(xué)，3,133(1990)],pAS3-3(JP-A-227075/1990),pCDM8[自然，329,840(1987)],pcDNAI/Amp(Invitrogen),pREP4(Invitrogen),pAGE103[生物化學(xué)雜志，101,1307(1987)]和pAGE210。
任何能夠在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子都可應(yīng)用。其中的例子包括巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(HCMY)的IE(立即早期)基因的啟動(dòng)子，SV40早期啟動(dòng)子，金屬硫蛋白的啟動(dòng)子。另外，源于人類巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子的增強(qiáng)子可與此啟動(dòng)子一起使用。
宿主細(xì)胞包括人類Namalwa細(xì)胞，猴COS細(xì)胞，中國倉鼠卵巢CHO細(xì)胞，HBT5673(JP-A-299/1988)等。
任何將DNA導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的方法都可應(yīng)用，如電穿孔法[細(xì)胞技術(shù)學(xué)，3,133(1990)]，磷酸鈣法(JP-A-227075/1990)，脂質(zhì)體法[美國國家科學(xué)院院報(bào)，84,7413(1987)]等。
轉(zhuǎn)化子的制備和培養(yǎng)可依JP-A-227075/1990或JP-A-257891/1990中描述的方法進(jìn)行。
如果昆蟲細(xì)胞用作宿主，目的蛋白的基因可以如《桿狀病毒表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》，《現(xiàn)代分子生物學(xué)方法增補(bǔ)1-34》和生物/技術(shù)6,47(1988)中描述的方法進(jìn)行表達(dá)。
即，將含有重組基因的載體與桿狀病毒同時(shí)轉(zhuǎn)入昆蟲細(xì)胞；這樣就可在培養(yǎng)上清中得到重組病毒，然后用重組病毒感染昆蟲細(xì)胞，由此蛋白可得以表達(dá)。
在這種方法中使用的導(dǎo)入基因的載體包括如pLV1392,pVL1393和pBlueBacⅢ(它們都是Invitrogen公司的產(chǎn)品)。
可用感染某些蛾的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒作為桿狀病毒。
可用秋粘蟲的卵巢細(xì)胞sf9和sf21《桿狀病毒表達(dá)載體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，W.H. Freeman and Company,New York(1992)》，粉紋夜蛾的卵巢細(xì)胞High5(Invitrogen)等作為昆蟲細(xì)胞。
為了將含有重組基因的載體與桿狀病毒同時(shí)轉(zhuǎn)入昆蟲細(xì)胞而制備重組病毒，可用磷酸鈣法(JP-A-227075/1990)或脂質(zhì)體法[美國國家科學(xué)院院報(bào)，84,7413(1987)]。
基因表達(dá)除了用直接表達(dá)的方法外，還可以根據(jù)《分子克隆，第二版》的描述，將基因以分泌方式或融合蛋白的方式進(jìn)行表達(dá)。
用絲狀真菌、酵母、動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞表達(dá)這個(gè)基因時(shí)，可以得到具有糖或碳?xì)滏湹亩嚯摹?br> 除上述轉(zhuǎn)化子以外，具有產(chǎn)生新型肌醇六磷酸酶能力的微生物或具有更強(qiáng)的產(chǎn)生新型肌醇六磷酸酶能力的微生物的突變體皆可用于生產(chǎn)該新型肌醇六磷酸酶。
用常規(guī)的突變方法可獲得具有更強(qiáng)的產(chǎn)生新型肌醇六磷酸酶能力的突變體。
為了制備該新型肌醇六磷酸酶，可以常規(guī)方法培養(yǎng)具有產(chǎn)生該新型肌醇六磷酸酶能力的微生物及其突變體以及攜帶有整合了新型肌醇六磷酸酶基因重組DNA的轉(zhuǎn)化子以生產(chǎn)和積累該新型肌醇六磷酸酶，然后從培養(yǎng)基中收獲該酶。這些微生物突變體及用于生產(chǎn)該新型肌醇六磷酸酶的轉(zhuǎn)化子在下文稱之為產(chǎn)生肌醇六磷酸酶的微生物。
如果產(chǎn)生新型肌醇六磷酸酶的微生物為原核生物如大腸桿菌或如絲狀噬菌體或酵母，培養(yǎng)這些微生物的培養(yǎng)基為天然培養(yǎng)基或包含有可被微生物吸收的碳源、氮源、無機(jī)鹽等的合成培養(yǎng)基，在這些培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)化子可被有效地培養(yǎng)。
只要能夠被微生物吸收，任何碳源都可被使用，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、糖漿一類的碳?xì)浠衔铮坏矸酆偷矸鬯馕?，乙酸和丙酸一類的有機(jī)酸，以及甲醇、乙醇、丙醇一類的醇類物質(zhì)。
用作氮源的有氨、無機(jī)或有機(jī)氨鹽如氯化氨、硫酸氨、乙酸銨和磷酸銨、以及其它的氮化合物；胨、肉汁(肉湯)；酵母提取物；谷物浸出液；珞蛋白水解液；豆餅及其水解液；多種發(fā)酵微生物及其消化產(chǎn)物。
培養(yǎng)基中所用的無機(jī)物質(zhì)包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。
培養(yǎng)絲狀真菌的培養(yǎng)基以麩皮，稻皮做碳源，以適當(dāng)形式的鹽補(bǔ)充氮源和無機(jī)物。
在通氣狀況下用搖動(dòng)培養(yǎng)或通氣狀況下浸沒搖動(dòng)培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度以15-40℃為佳，培養(yǎng)時(shí)間通常為16-96小時(shí)。培養(yǎng)過程中，pH值保持在3.0-9.0，培養(yǎng)真菌時(shí)，pH值保持在3.0-6.5為佳，用無機(jī)或有機(jī)酸、堿性溶液、尿素、碳酸鈣、氨等調(diào)節(jié)pH值。
培養(yǎng)過程中，可任選地向培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素或四環(huán)素一類的抗生素。
如果轉(zhuǎn)化了一種微生物的表達(dá)載體具有可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，微生物在培養(yǎng)過程中，可任選地向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)物。例如，轉(zhuǎn)化了具有l(wèi)ac啟動(dòng)子的表達(dá)載體的微生物，其培養(yǎng)基中應(yīng)加入IPTG等，轉(zhuǎn)化了具有trp啟動(dòng)子的表達(dá)載體的微生物，其培養(yǎng)基中應(yīng)加入IAA等。
如果絲狀真菌在含有麩皮一類的固體成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，先接種真菌，然后將真菌與固體成分混合均勻，隨后將混合物以一薄層鋪于鋁盤或不繡鋼盤上，將之置于培養(yǎng)箱中在可控溫度、濕度和通氣狀況下在培養(yǎng)室中25-35℃靜置培養(yǎng)3-10天。
如果產(chǎn)生新型肌醇六磷酸酶的為動(dòng)物細(xì)胞，培養(yǎng)基通常為RPMI1640,Eagle’s MEM培養(yǎng)基或在該培養(yǎng)基中補(bǔ)充胎牛血清。
5％CO2存在的情況下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度以35-37℃為佳，培養(yǎng)時(shí)間通常為3-7天。
培養(yǎng)過程中，可任選地向培養(yǎng)基中加入卡那霉素或青霉素一類的抗生素。
培養(yǎng)以昆蟲細(xì)胞為宿主的轉(zhuǎn)化子使用的培養(yǎng)基為正常培養(yǎng)基如TNM-FH培養(yǎng)基(Pharmigen)sf-900II SFM培養(yǎng)基(GibcoBRL)Excell400Excel1405培養(yǎng)基[皆來自JRH Biosciences]。
培養(yǎng)溫度以25-35℃為佳，培養(yǎng)時(shí)間通常為1-4天。
培養(yǎng)過程中，可任選地向培養(yǎng)基中加入慶大霉素一類的抗生素。
可以用常規(guī)的分離/純化酶的方法從產(chǎn)生新型肌醇六磷酸酶的微生物的培養(yǎng)基中分離和純化新型肌醇六磷酸酶。
例如，如果新型肌醇六磷酸酶以可溶形式在產(chǎn)生該酶的微生物細(xì)胞中積累，則通過離心從培養(yǎng)物中收集細(xì)胞，然后以緩沖液洗滌細(xì)胞，用弗氏壓碎器、manntongaurin勻漿器、dynomill等超聲破碎細(xì)胞，由此產(chǎn)生無細(xì)胞抽提液。將無細(xì)胞抽提液離心留取上清，按常規(guī)的分離/純化酶的方法進(jìn)行操作溶劑萃取、硫酸銨鹽析、有機(jī)溶劑沉淀脫鹽，以如DEAE-Sepharose瓊脂糖凝膠或DIAION HPA-75(Mitsubishi公司)樹脂為基質(zhì)進(jìn)行離子交換層析，以S-SepharoseFF(pharmacia)樹脂為基質(zhì)進(jìn)行離子交換層析，在丁基瓊脂糖凝膠或苯基瓊脂糖凝膠上進(jìn)行疏水層析，用分子篩進(jìn)行凝膠過濾，親合層析，層析聚焦及等電聚焦一類的電泳，上述方法可以單獨(dú)使用也可聯(lián)合使用，由此可得到純品。
如果此新型肌醇六磷酸酶在細(xì)胞中以不溶形式表達(dá)，則用相似的方法收集、粉碎，離心以得到含有該酶的沉淀部分，用多肽去污劑溶解不溶于水的新型肌醇六磷酸酶。然后稀釋或透析得到的液體直至除掉去污劑或其量不致于使多肽變性，由此新型肌醇六磷酸酶恢復(fù)到天然構(gòu)象。通過上述的分離/純化方法可得到純品。如果該新型肌醇六磷酸酶被分泌到細(xì)胞外，則離心培養(yǎng)物并保留上清可溶部分。若培養(yǎng)基中有麩皮一類的固體成分，則先用溫水等提取新型肌醇六磷酸酶，然后離心并保留上清可溶部分。用上述從無細(xì)胞提取液中分離和純化方法，可得到該新型肌醇六磷酸酶純品。
用下述標(biāo)準(zhǔn)分析方法可確定該新型肌醇六磷酸酶的活性。
將0.5ml含2.5mM植酸鈉(Sigma)的pH5.5(乙酸鈉)的0.2M乙酸緩沖液在37℃放置5分鐘，然后將0.5ml的酶液加入其中以起始反應(yīng)。37℃放置10分鐘，將2ml酶反應(yīng)終止液(如10mM∶5N硫酸∶丙酮為1∶1∶2的混合物)加入其中以終止反應(yīng)，然后再加入0.1ml 1M的檸檬酸鈉并混勻。在分光光度計(jì)(Hitachi U-2000)上380nm讀取該溶液的吸值。肌醇六磷酸酶活性單位定義為pH5.5,37℃時(shí)1分鐘內(nèi)釋放1μM的無機(jī)磷酸所需要的酶量。
該新型肌醇六磷酸酶的Km值可通過Lineweaver-Burk圖來確定，Lineweaver-Burk圖是通過標(biāo)準(zhǔn)分析方法測得的新型肌醇六磷酸酶的活性對(duì)不同的底物濃度繪制的。
本發(fā)明的肌醇六磷酸酶可用于需要將植酸鹽轉(zhuǎn)化為肌醇集合無機(jī)磷酸的多種過程。
例如，本酶可用于動(dòng)物飼料，大豆加工，豬和家禽的液體飼料及從植酸鹽制備肌醇或肌醇(單)磷酸。
下面是這類動(dòng)物飼料的一例。
本發(fā)明的新型肌醇六磷酸酶與麥殼一類的攜帶物混合后在噴灑塔或流化床上干燥。干燥后，將滲透壓穩(wěn)定劑如山梨醇和防腐劑如苯甲酸加入其中形成一種動(dòng)物飼料。在此動(dòng)物飼料中新型肌醇六磷酸酶的量為10-5000單位。每Kg動(dòng)物飼料中含100-1000單位該酶為佳。
附圖簡述

圖1展示了源自黑曲霉SK52的肌醇六磷酸酶基因的限制性酶切圖譜，其中箭頭指示肌醇六磷酸酶編碼區(qū)域。
圖2展示了質(zhì)粒pANPHY1的限制性酶切圖譜，其中“肌醇六磷酸酶”代表一個(gè)新型肌醇六磷酸酶基因，“Amp”指代來自pUC118的氨芐青霉素抗性基因，箭頭指示了該基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯方向。
圖3展示了用SDS-PAGE測定新型肌醇六磷酸酶的分子量。
圖4展示了通過測定新型肌醇六磷酸酶的分子量得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖5展示了新型肌醇六磷酸酶的最適pH值，每一個(gè)值處的活性為相對(duì)活性(％)，將最大酶活性處的值定為100％。
圖6展示了新型肌醇六磷酸酶的酸堿穩(wěn)定性。
圖7展示了新型肌醇六磷酸酶的最適溫度。每一個(gè)溫度處的活性為相對(duì)活性(％)，將最大酶活性處的溫度定為100％。
圖8展示了新型肌醇六磷酸酶的熱穩(wěn)定性。每一個(gè)溫度處的活性為相對(duì)活性(％)，4℃時(shí)活性定為100％。
圖9展示了新型肌醇六磷酸酶在等電聚焦時(shí)的等電點(diǎn)。
在pH7.0或更大時(shí)，此酶無活性。執(zhí)行本發(fā)明的最佳模式實(shí)施例1制備編碼新型肌醇六磷酸酶的染色體DNA1、制備黑曲霉SK57將100ml麥芽汁培養(yǎng)基(2％麥芽汁提取液，2％葡萄糖，0.1％蛋白胨)放入具有阻板的500ml三角瓶中，用硅海綿瓶塞封口，120℃滅菌20分鐘。
將SK57接種于此培養(yǎng)基中，28℃搖動(dòng)培養(yǎng)7天。
用滅菌的玻璃濾器過濾培養(yǎng)物得到0.5g SK57。2、從微生物中分離和純化總DNA將從實(shí)施例1-1中得到的SK57置于紙間并壓擠之以除去水分，然后將微生物置于冷卻至-80℃的研缽中，向其中加入液氮使之冷凍，用冷卻至-80℃的研杵將之磨細(xì)。
將上述磨細(xì)的微生物置入一離心管中并入0.2ml TE緩沖液[10mMTris-HCl(pH8.0),1mM EDTA]并懸浮之。往上述懸浮液中加入0.2ml裂解緩沖液[2％SDS,0.1M NaCl,10mM EDTA,50mM Tris-HCl(pH7.0)]以裂解微生物。裂解液在4℃以15000rpm(18500×g)離心10分鐘后，將上清移入一個(gè)新的離心管中。
將0.4ml酚溶液(即，酚氯仿異戊醇25∶24∶1的混合液)加入上述上清中，輕輕搖動(dòng)試管并在4℃以15000rpm(18500×g)離心10分鐘后，將上清移入一個(gè)新的離心管中。將此過程重復(fù)3次，上清移入一個(gè)新的離心管中。
向上述上清中加入1ml冷的乙醇，-80℃放置10分鐘，4℃以15000rpm(18500×g)離心10分鐘，由此可得到沉淀物(DNA)。
真空干燥沉淀并將之溶于0.5ml TE緩沖液中。
向上述溶液中加入5μl RNase(10mg/ml)，37℃放置30分鐘。
向上述處理溶液中加入0.5ml酚溶液，緩慢搖動(dòng)混合物，15000rpm(18500×g)離心10分鐘，將上清移入一個(gè)新的離心管中，將此過程重復(fù)2次，上清移入一個(gè)新的離心管中。
將0.5ml氯仿溶液(即，氯仿∶異戊醇24∶1的混合液)加入上述上清中，4℃以15000rpm(18500×g)離心10分鐘后，將上清移入一個(gè)新的離心管中以回收沉淀物(DNA)。
向上述上清中加入50μl NaCl及1ml冷的乙醇，-80℃放置10分鐘，4℃以15000rpm(18500×g)離心10分鐘，由此可得到沉淀物(DNA)。用0.5ml 70％的乙醇進(jìn)一步洗滌沉淀并在4℃以15000rpm(18500×g)離心10分鐘以收集沉淀物(DNA)。真空干燥沉淀后會(huì)得到大約5ug純基因組DNA。3、探針制備可用來自Aspergillus ficcum NRRL3135[來自北部地區(qū)研究中心，農(nóng)業(yè)Peoria聯(lián)邦部，Illinois美國NRRL]的基因作為探針檢測來自黑曲霉SK57的肌醇六磷酸酶克隆。
以實(shí)施例1-1和1-2描述的方法制備NRRL3135的總DNA。
為了從NRRL3135中擴(kuò)增肌醇六磷酸酶的結(jié)構(gòu)基因，正義和反義引物分別為SEQ ID NO:6和NO:7，它們是在380ADNA合成儀(AppliedBiosystems)上合成的。用100μl包含正義引物、反義引物及反義引物基因DNA的混合物以PCR方法擴(kuò)增肌醇六磷酸酶的結(jié)構(gòu)基因。按下列反應(yīng)步驟進(jìn)行PCR，每循環(huán)中，92℃1分鐘，45℃2分鐘，72℃3分鐘，總共25個(gè)循環(huán)。
先用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ切割pUC118，將一段EcoRⅠ處理過的用PCR擴(kuò)增到的肌醇六磷酸酶的結(jié)構(gòu)基因通過連接試劑盒(Taraka Shuzo,Japan)連入pUC118 EcoRⅠ位點(diǎn)。
有肌醇六磷酸酶的結(jié)構(gòu)基因片段插入的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(Taraka Shuzo)。
將大腸桿菌轉(zhuǎn)化子在含有50mg/ml氨芐青霉素鈉的LB培養(yǎng)基中(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl)37℃培養(yǎng)一天。
從培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒，然后用EcoRⅠ消化質(zhì)粒以回收1.7Kb的DNA片段。
此1.7Kb的DNA片段用作探針。4、Southern雜交將12U的限制性內(nèi)切酶XbaⅠ(Takara Shuzo)加入到20ug SK57基因組DNA中，37℃作用12小時(shí)以切割DNA。瓊脂糖凝膠電泳分離此DNA。按照ECL試劑盒(Amersham)說明書以實(shí)施例1-3得到的探針進(jìn)行Southern雜交。
瓊脂糖凝膠電泳后，DNA在0.4N的氫氧化鈉溶液中通過毛細(xì)作用轉(zhuǎn)印到Hybond-N+膜上(Amersham)，空氣干燥此膜。將膜于42℃在10雜交緩沖液中
浸泡1小時(shí)，此雜交緩沖也包含在直接ECL核酸標(biāo)記和檢測系統(tǒng)中(Amersham)，然后向浸泡有轉(zhuǎn)印了DNA的膜的雜交液中加入30μl探針溶液[制備方法，將7μl無菌水加入到3μl實(shí)施1-3中得到的探針中，95℃作用5分鐘，然后冰上放置5分鐘，再向上述溶液中加入10μl標(biāo)記溶液和10μl戊二醛溶液，將混合物在37℃放置10分鐘]，42℃搖動(dòng)過夜。
用100ml初級(jí)洗液[6M尿素，0.4％S DS,0.5×SSC(1×SSC,150mM氯化鈉及15mM檸檬酸鈉)]在42℃洗膜20分鐘。然后，用100ml次級(jí)洗液
在55℃洗膜2此，每次10分鐘，隨后，用100ml 2×SSC在室溫下洗膜2次，每此5分鐘。
洗滌后的膜空氣干燥1分鐘，然后將之浸入7ml的顯色劑中1分鐘，迅速將之包于Saran紙中。然后將膜置于一個(gè)X-光片夾中X-光片(Fuju,Japan)室溫下曝光5分鐘。
與探針雜交信號(hào)強(qiáng)的DNA片段約4.6Kb。5、黑曲霉SK57染色體DNA制備將12U的限制性內(nèi)切酶XbaⅠ加入到10ug黑曲霉SK57基因組DNA中，37℃作用12小時(shí)以切割DNA，隨后將之進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳。電泳后，從膠上切下約的DNA片段，用Geneclean(BI0101)可得到約100ng的DNA片段。
在另一反應(yīng)中，將12 U XbaⅠ加入到約200ng大腸桿菌載體pUC118中(Takara Shuzo)并在37℃作用1小時(shí)以切割pUC118。
將1U堿性磷酸酶加入到上述處理過的溶液中，37℃作用30分鐘，加入20μl酚處理液至反應(yīng)混合物中，輕輕搖動(dòng)，4℃以15000rpm(18500×g)離心10分鐘后，將上清移入一個(gè)新的離心管中。重復(fù)此過程兩遍，將上清移入一個(gè)新的離心管中。
向上清中加入2μl 3M乙酸鈉及50μl冷乙醇，-80℃放置10分鐘，4℃以15000rpm(18500×g)離心10分鐘以回收沉淀物。
真空干燥沉淀并將之溶于10l TE緩沖液中以獲得切割后的片段。
上述方法制備的約4.6Kb的DNA片斷通過T4DNA連接酶(TakaraShuzo)連入到切割后片段的切點(diǎn)處，由此產(chǎn)生了具有黑曲霉SK57染色體DNA片段的質(zhì)粒。
用常規(guī)方法將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(Taraka Shuzo)。
轉(zhuǎn)化大腸桿菌在含有50mg/ml氨芐青霉素鈉的LB培養(yǎng)基中在37℃培養(yǎng)一天。為了制備一個(gè)復(fù)制物，轉(zhuǎn)化子進(jìn)一步在含有50ug/ml氨芐青霉素鈉的LB培養(yǎng)基(通過在LB培養(yǎng)基中加入2％的瓊脂制備)中在37℃培養(yǎng)一天。在培養(yǎng)基上生長的克隆用作SK57染色體DNA文庫。6、從染色體DNA文庫中分離含目的DNA的克隆為了從實(shí)施例1-5制備的文庫中篩選具有新型肌醇六磷酸酶基因的克隆，文庫中的克隆被轉(zhuǎn)移至濾膜上并且利用ECL試劑盒(Amersham)，以實(shí)施例1-3制備的探針通過克隆雜交方法進(jìn)行篩選。幾千個(gè)克隆用于雜交以分離陽性克隆。7、限制性酶切圖譜的制備及測序用常規(guī)方法提取實(shí)施例1-6中得到的陽性克隆的質(zhì)粒。此質(zhì)粒被命名為pANPHY1。用多種限制性酶切割質(zhì)pANPHY1并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，依據(jù)片段大小，得到了一個(gè)由XbaⅠ處理來自SK57染色體DNA插入片段的限制性酶切圖譜(圖1)，此插入片段大小為4.6Kb。
用多種限制性酶切割質(zhì)粒pANPHY1，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將其轉(zhuǎn)移至尼龍膜上。用ECL試劑盒以實(shí)施例1-3中得到的探針進(jìn)行Sourhern雜交。插入片段的中間部位與探針雜交。pANPHY1的限制性酶切圖譜及新型肌醇六磷酸酶的編碼區(qū)示于圖2。
插入到pANPHY1的新型肌醇六磷酸酶基因全核苷酸序列通過雙脫氧鏈終止法測定。此核苷酸序列示于SEQ ID NO:4。實(shí)施例2編碼新型肌醇六磷酸酶DNA的內(nèi)含子分析從實(shí)施例中獲得的編碼新型肌醇六磷酸酶的染色體DNA內(nèi)的內(nèi)含子的分析是通過下述方法從黑曲霉SK57中獲得肌醇六磷酸酶cDNA中來進(jìn)行的。1、黑曲霉SK57的培養(yǎng)此培養(yǎng)基以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在50mM MES緩沖液含有0.05％硫酸鎂，0.01％硫酸亞鐵，0.05％氯化鉀，0.2％硝酸鈉，1％葡萄糖及谷物浸出液(Sanei Toka,Japan)。將此培養(yǎng)基以100ml/瓶等分到具有阻板的500ml三角瓶中，高壓蒸汽滅菌(120℃,20分鐘)。滅菌后，將斜面上的一鉑環(huán)SK-5接種于培養(yǎng)基中，28℃,200rpm振蕩培養(yǎng)5天。用吸力使培養(yǎng)物通過玻璃濾器以收獲微生物并快速將之凍存于液氮中以抑制RNase的活性。在使用前此生物一直保存于-80℃。2、RNA的提取邊快速研磨1g實(shí)施例1-1中得到的冰凍微生物邊向其中加入液氮。將獲得的粉末加入到50℃的10ml ISOGEN提取液(Nippon Gene)中并激烈振蕩30秒。
上述溶液在50℃放置10分鐘并以1ml/管分到Eppendorf管中。
向每一份液體中加入200μl氯仿，然后搖動(dòng)之，并在4℃以15000rpm(18500×g)離心10分鐘后，收集上層水相。
將500μl 4M氯化鋰加入水相，混勻，-80℃放置1小時(shí)。并在4℃以15000rpm(18500×g)離心15分鐘，獲得的沉淀物溶于0.4ml無RNase的滅菌水中(此后簡稱為無PNase水)。
向上述溶液加入0.4ml異丙醇，4℃放置30℃,4℃以15000rpm(18500×g)離心15分鐘，回收沉淀物。
以75％乙醇洗滌沉淀，然后在真空離心機(jī)中干燥之，并將其溶于0.4ml RNase水中。
將1ml乙醇加入上述乙醇，然后離心并再次回收沉淀物。
將75％乙醇洗滌沉淀并將之溶于無RNase水中，總體積為0.4ml，此溶液可用作RNA樣品。3、用RT-PCR括增肌醇六磷酸酶cDNA用RT-PCR試劑盒(Toyobo)擴(kuò)增肌醇六磷酸酶cDNA。
<1>反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將1ug實(shí)施例2-2中得到的RNA樣品置于一個(gè)Eppendorf管中，以無RNAse水將溶液補(bǔ)至10ul。
將RT-PCR試劑盒(Toyobo)中的4μl 5×RTase緩沖液，1μl隨機(jī)引物，1μl RNase抑制劑及2μl RTase加到上述溶液中，然后在PJ2000熱循環(huán)儀上(Perkin Elmer)30℃反應(yīng)10分鐘，42℃反應(yīng)20分鐘，99℃反應(yīng)5分鐘，4℃反應(yīng)5分鐘。
<2>PCR將RT-PCR試劑盒(Toyobo)中的10μl Plus緩沖液，68μl滅菌水，0.5μl正義引物、0.5μl反義引物及1μl rTaq DNA多聚酶加入到實(shí)施例2-1的20μl反應(yīng)液中，最后的總體積為100μl。肌醇六磷酸酶cDNA的擴(kuò)增在下列條件下進(jìn)行；每個(gè)循環(huán)中，94℃30秒，60℃30秒，72℃90秒，總共35個(gè)循環(huán)。
反應(yīng)結(jié)束后，將10μl氯仿∶異戊醇(24∶1)混合物加入反應(yīng)體系，振蕩，然后15000RPM離心5分鐘以回收上清作為cDNA樣品。
此cDNA樣品用于cDNA分析，結(jié)果，在SEQ ID NO:4的堿基序列(44-155位置)發(fā)現(xiàn)一個(gè)內(nèi)含子。此序列編碼SEQ ID NO 2的氨基酸序列。從下面描述的純化的新型肌醇六磷酸酶的氨基酸(SEQ ID NO 1)中可以發(fā)現(xiàn)，從N末端至第24位的氨基酸相當(dāng)于分泌信號(hào)肽。實(shí)施例3表達(dá)新型肌醇六磷酸酶DNA的轉(zhuǎn)化子的制備表達(dá)新型肌醇六磷酸酶的轉(zhuǎn)化子以黑曲霉SK57，構(gòu)巢曲霉MD-4和米曲霉M-23作為宿主的。
宿主(黑曲霉SK57，構(gòu)巢曲霉MD-4和米曲霉M-23)在DPY培養(yǎng)基中(2％糊精，1％蛋白胨，5％酵母提取物，0.5％KH2PO4,0.05％MgSO4.7H2OpH5.5)30℃振蕩培養(yǎng)2-3天。用3G1玻璃濾器收集生長的微生物并用滅菌水洗滌之。
將洗滌后的微生物加入到10ml原生質(zhì)體制備液中[5mg/mlNovozyme234,5mg/ml纖維素酶R-10,0.8M NaCl,10mM磷酸緩沖液(pH6.0)]并在30℃輕輕震蕩3小時(shí)。未被裂解的菌絲通過3G3玻璃濾器除掉，獲得的濾液則以700×g(2000rpm)離心以獲得原生質(zhì)體。
0.8M NaCl洗滌兩次原生質(zhì)體，以溶液Ⅰ
洗滌一次，然后將其溶于4/5體積的溶液Ⅰ中，最終濃度為2.5×108/ml。向懸浮液中加入1/5體積的溶液Ⅱ[40％(w/v)PEG4000,50mM Tris-HCl(pH7.5)]，由此制備了用于轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體懸液。
在使用黑曲霉SK57和構(gòu)巢曲霉MD-4的原生質(zhì)體懸液時(shí)，向0.2ml原生質(zhì)體懸液中加入20μl質(zhì)粒pANPHY1，或質(zhì)粒pANPHY1和p3SR2各10μl，混合液在冰上放置30分鐘，隨后加入1ml溶液Ⅱ并在室溫下放置20分鐘。然后，加入10ml溶液Ⅰ并在700×g離心5分鐘以得到沉淀部分。將沉淀部分懸浮于0.2ml溶液Ⅰ。將懸液涂到含0.8MNaCl的CD板培養(yǎng)基上(1％蔗糖，10mM乙酰胺，0.1％KH2PO4,0.05％MgSO4.7H2O,0.05％KCl,)，隨后將含0.5％瓊脂的培養(yǎng)基覆于其上，30℃培養(yǎng)5-10天。
在使用米曲霉M-23的原生質(zhì)體懸液時(shí)，向0.2ml原生質(zhì)體懸液中加入質(zhì)粒pANPHY1和pSa123各10μl，混合液在冰上放置30分鐘，隨后加入1ml溶液Ⅱ并在室溫下放置20分鐘。然后，加入10ml溶液Ⅰ并在700×g離心5分鐘以得到沉淀部分。將沉淀部分懸浮于0.2ml溶液Ⅰ。將懸液涂到基本培養(yǎng)基上板上(1％蔗糖，0.3％NaNO3,0.1％KH2PO4,0.05％MgSO4.7H2O,0.05％KCl,pH5.5)，隨后將含0.5％瓊脂的培養(yǎng)基覆于其上，30℃培養(yǎng)5-10天。
培養(yǎng)過程中，將生長良好的株系選作轉(zhuǎn)化子，測定每一轉(zhuǎn)化子的肌醇六磷酸酶的活性，得到了具有高活性的黑曲霉MH-PA1，構(gòu)巢曲霉M-pA1及米曲霉MO-PG3。黑曲霉MH-PA1，構(gòu)巢曲霉M-PA1分別在1996年1月25日以FERM BP-5372和FERM BP-5373貯存于國家生物科學(xué)和人類技術(shù)研究所，工業(yè)科學(xué)和技術(shù)院，日本國茨城縣筑波市東1丁目1番3號(hào)，郵區(qū)305。實(shí)施例4由轉(zhuǎn)化子生產(chǎn)肌醇六磷酸酶<1>由黑曲霉MH-PA1生產(chǎn)肌醇六磷酸酶將10g麩皮加入到一個(gè)500ml的三角瓶中并用棉塞封瓶口，在120℃滅菌20分鐘，然后向其中加入8ml滅菌水。在此培養(yǎng)基中接種MH-PA1菌株，搖動(dòng)三角瓶使MH-PA1菌株與麩皮完全混合，30℃靜置培養(yǎng)4-5天。
向上述三角瓶中加入100ml 37℃的滅菌水，并將之在37℃放置1-2小時(shí)，然后，用2號(hào)濾紙將液相與固相分開，由此可得到560U的新型肌醇六磷酸酶。由MH-PA1產(chǎn)生的新型肌醇六磷酸酶比實(shí)施例6-1中SK57產(chǎn)生的新型肌醇六磷酸酶高2.4倍。<2>由構(gòu)巢曲霉M-PA1生產(chǎn)肌醇六磷酸酶將10ml肌醇六磷酸酶生產(chǎn)培養(yǎng)基(1％蔗糖，0.2％NaNO3,0.05％MgSO4.7H2O,0.05％KCl,0.001％FeSO4.7H2O,0.1％C.S.L pH 5.5)加入到100ml的三角瓶中，用硅塞封瓶口在120℃滅菌30分鐘，將M-PA1接種到此培養(yǎng)基中，30℃搖動(dòng)培養(yǎng)4-5天。
轉(zhuǎn)化子M-PA1產(chǎn)生90mU肌醇六磷酸酶，它是在同樣條件下構(gòu)巢曲霉MD-4產(chǎn)生的肌醇六磷酸酶的18倍，后者為5mU。<3>由米曲霉MO-PG3生產(chǎn)肌醇六磷酸酶將500ml肌醇六磷酸酶產(chǎn)生培養(yǎng)基置于一個(gè)2L的三角瓶中，用硅塞封瓶口在120℃滅菌20分鐘。將MO-PG3接種到此培養(yǎng)基中，30℃搖動(dòng)培養(yǎng)4-5天。
轉(zhuǎn)化子MO-PG3產(chǎn)生370mU/ml肌醇六磷酸酶，它是在同樣條件下米曲霉M-23產(chǎn)生的肌醇六磷酸酶的29倍，后者為13MU/ML。實(shí)施例5由黑曲霉SK57制備高產(chǎn)新型肌醇六磷酸酶的黑曲霉SK92在基礎(chǔ)培養(yǎng)基[2％蔗糖，0.3％亞硝酸鈉，0.05％氯化鉀，0.05％硫酸鎂，2％瓊脂，pH5.5]上培養(yǎng)黑曲霉SK57使其產(chǎn)生孢子。將這些孢子懸浮在滅菌水中。懸浮液的終濃度為107孢子/ml滅菌水，10ml這樣的懸浮液用于突變。以99％致死量的UV-射線或γ-射線照射孢子懸液。用這種突變方法得到了一肌醇六磷酸酶高表達(dá)株。此菌株又通過了7次突變，得到了高表達(dá)新型肌醇六磷酸酶的黑曲霉SK92。實(shí)施例6由黑曲霉SK57和黑曲霉SK92生產(chǎn)新型肌醇六磷酸酶<1>由SK57和SK92生產(chǎn)新型肌醇六磷酸酶將10g麩皮加入到一個(gè)500ml的三角瓶中，用棉塞封瓶口并在120℃高壓20分鐘，然后向瓶中加入8ml滅菌水。將SK57或SK92接種于此培養(yǎng)基中，搖動(dòng)三角瓶以使菌絲與麩皮完全混勻。
將100ml 37℃的水置于上述三角瓶中，并將之在37℃放置1-2小時(shí)，隨后，用2號(hào)濾紙將液相與固相分開。
通過此過程，SK57生產(chǎn)230U新型肌醇六磷酸酶而SK92產(chǎn)生1000U新型肌醇六磷酸酶。
SK92產(chǎn)生新型肌醇酶的量比SK57高4.5倍。<2>由SK57和SK92生產(chǎn)新型肌醇六磷酸酶原來在純培養(yǎng)基上生長的SK57被接種到120℃高壓30分鐘的750g麩皮中，在混合器中將菌絲與麩皮混勻。
將混合物到在鋁盤上(600×1000mm)，每盤為5Kg，將SK57在100％濕度，30℃培養(yǎng)5天。
培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至抽提液中并噴灑18噸溫水。將肌醇六磷酸酶抽提液回收至一個(gè)25噸的罐。將抽提液轉(zhuǎn)移至真空濃縮罐(Nippon ShinkuK.K.)在真空作用下將抽提液濃縮2-3倍，并向其中加入3.5噸95％冷乙醇。用壓力濾器將由此產(chǎn)生的不純固體成分除掉。
用無菌濾器(0.45μM,Nippon Rosuiki K.K.)過濾上述得到的濾液，并將3.5噸95％冷乙醇加入到濾液中以分離新型肌醇六磷酸酶。沉淀分離肌醇六磷酸酶，得到3噸包含新型肌醇六磷酸酶的沉淀。
在沉淀中加入8噸95％的冷乙醇，脫水后，分離到的肌醇六磷酸酶被沉淀，由此得到3噸包含新型肌醇六磷酸酶的沉淀。將脫水和沉淀過程重復(fù)2-3次，沉淀經(jīng)真空干燥后，得到1.5×108肌醇六磷酸酶粗制品。實(shí)施例7新型肌醇六磷酸酶的純化<1>純化由黑曲霉SK57產(chǎn)生的新型肌醇六磷酸酶將實(shí)施例6-2中得到的10g肌醇六磷酸酶粗制品溶于50ml乙酸緩沖液A[50mM乙酸/50mM乙酸鈉(pH5.5)]并用一種超濾膜脫鹽(除掉分子量10000以下的物質(zhì)Sartrius)。得到的酶液上樣于用乙酸緩沖液A平衡過的DIAIONPA-75[Mitsubishi]柱上(5.6×30cm)，用乙酸緩沖液A洗柱后，以含0.3MNaCl乙酸緩沖液B[50mM乙酸/50mM乙酸鈉(pH4.8)]洗脫新型肌醇六磷酸酶。用超濾膜脫鹽(除掉分子量10000以下的物質(zhì)Advantec)將洗脫部分濃縮20倍，然后上樣于用乙酸緩沖液C[50mM乙酸/50mM乙酸鈉(pH4.9)]平衡過的S-Sepharose FF(2.5×30cm Pharmacia)柱上。用乙酸緩沖液C洗滌后，以乙酸緩沖液D[50mM乙酸/50mM乙酸鈉(pH5.2)]洗脫蛋白以得到新型肌醇六磷酸酶。用超濾膜(除掉分子量10000以下的物質(zhì)Advantec)將洗脫部分濃縮20倍，然后上樣于用乙酸緩沖液E[50mM乙酸/50mM乙酸鈉(pH4.5)]平衡過的Toyopearl HW-55F(Toso)柱上。新型肌醇六磷酸酶以乙酸緩沖液E洗脫。將洗脫部分上樣于用25mM組氨酸-鹽酸緩沖液pH5.8(Pharmacia)平衡過的mono-PHR5/20柱(Pharmacia)，然后以10％Polybuffer74-HCl,pH4.2(Pharmacia)洗脫新型肌醇六磷酸酶。
經(jīng)過上述步驟，新型肌醇六磷酸酶被純化到特異性為158U/mg。<2>純化由黑曲霉NH-PA1及構(gòu)巢曲霉M-PA1產(chǎn)生的新型肌醇六磷酸酶根據(jù)實(shí)施例6-1描述的方法培養(yǎng)MH-PA1和M-PA1，分別用2號(hào)濾紙從其培養(yǎng)物中分離液體部分(新型肌醇六磷酸酶粗提液)。
向每一新型肌醇六磷酸酶粗提液加入50ml乙酸緩沖液A(pH5.5)并用一種超濾膜脫鹽(除掉分子量10000以下的物質(zhì)Advantec)。
將脫鹽酶液上樣于用乙酸緩沖液A平衡過的DIAIONPA-75柱上(5.6×30cm)，用乙酸緩沖液A洗柱后，以含0.3 M NaCl乙酸緩沖液B[50mM乙酸/50mM乙酸鈉(pH4.8)]洗脫新型肌醇六磷酸酶。
洗脫部分超濾膜脫鹽(除掉分子量10000以下的物質(zhì)Advantec)濃縮然后透析。得到的酶液上樣于用50mM乙酸緩沖液E[50mM乙酸/50mN乙酸鈉(pH4.5)]平衡過的Toyopearl HW-55F(Toso)柱上。新型肌醇六磷酸酶以乙酸緩沖液E洗脫。
經(jīng)過上述步驟，由黑曲霉MH-PA1及構(gòu)巢曲霉M-PA1產(chǎn)生新型肌醇六磷酸酶得以純化。<3>純化由米曲霉MO-PG3產(chǎn)生的新型肌醇六磷酸酶通過離心除掉實(shí)施例4-3培養(yǎng)物中的微生物，得到的上清用作酶粗提液。
向酶粗提液加入50mM乙酸緩沖液A(pH5.5)并用一種超濾膜脫鹽(除掉分子量10000以下的物質(zhì)Advantec)。
將脫鹽酶液上樣于用乙酸緩沖液A平衡過的DIAIONPA-75柱上(5.6×30cm)，用乙酸緩沖液A洗柱后，以含0.3MNaCl乙酸緩沖液B[50mM乙酸/50mM乙酸鈉(pH4.8)]洗脫新型肌醇六磷酸酶。
洗脫部分超濾膜脫鹽(除掉分子量10000以下的物質(zhì)Advantec)濃縮然后透析。得到的酶液上樣于用50mM乙酸緩沖液E[50mM乙酸/50mM乙酸鈉(pH4.5)]平衡過的Toyopearl HW-55F(Toso)柱上。然后以乙酸緩沖液E洗脫新型肌醇六磷酸酶。
經(jīng)過上述步驟，由米曲霉MO-PG3產(chǎn)生的新型肌醇六磷酸酶得以純化。實(shí)施例8新型肌醇六磷酸酶的物理化學(xué)特性在實(shí)施例7-1-7-3中得到的新型肌醇六磷酸酶的物理化學(xué)特性如下。<1>Km值活性測定按標(biāo)準(zhǔn)分析方法進(jìn)行，其中底物濃度變化范圍為0.00625-1.25mM。結(jié)果做成Lineweave-Burk圖以確定Km值。
來自黑曲霉SK57，黑曲霉MH-PA1，構(gòu)巢曲霉M-PA1和米曲霉MO-PG3新型肌醇六磷酸酶的Km值分別為13,30,20和28μM。
在同樣條件確定來自Aspergillus ficcum NRRL3135的肌醇六磷酸酶Km值為197μM，因此本發(fā)明的新型肌醇六磷酸酶的Km值比已知肌醇六磷酸酶的Km值低一個(gè)數(shù)量級(jí)。<2>分子量(通過SDS-PAGE)向?qū)嵤├?-1-7-3中得到的每一新型肌醇六磷酸酶40ml樣品中加入10ml加樣緩沖液(4％2-巰基乙醇，80％甘油，4％SDS，40mM Tris-HCl緩沖液，pH6.8)，將混合物煮沸分鐘，在12.5％聚丙烯酰胺凝膠上用AE-6200(Atoh)型電泳儀進(jìn)行電泳。以考馬斯亮蘭G250染蛋白。進(jìn)一步，用內(nèi)切糖苷酶H處理每一樣品而去掉碳?xì)滏満?，也以同樣的方式進(jìn)行電泳。
圖3展示了來自黑曲霉SK57的新型肌醇六磷酸酶的SDS-PAGE電泳結(jié)果。根據(jù)SDS-PAGE，來自黑曲霉SK57或MH-PA1的新型肌醇六磷酸酶的分子量為60KDa。用內(nèi)切糖苷酶H處理每一樣品而去掉碳?xì)滏満?，這些新型肌醇六磷酸酶的分子量幾乎沒有改變。由SEQ ID No.1或2所示的氨基酸序列推斷的分子量為50KDa，與SDS-PAGE測定的分子量是一致的。
由SDS-PAGE測定的來自構(gòu)巢曲霉M-PA1和米曲霉MO-PG3新型肌醇六磷酸酶的分子量展示于圖4。經(jīng)測定，來自兩菌株的新型肌醇六磷酸酶的分子量為90-100KDa。因?yàn)檫@些新型肌醇六磷酸酶經(jīng)內(nèi)切糖苷酶H處理后，其分子量(60KDa)與來自黑曲霉SK57或MH-PA1的新型肌醇六磷酸酶的分子量相同，所以認(rèn)為自構(gòu)巢曲霉M-PA1和米曲霉MO-PG3新型肌醇六磷酸酶具有碳?xì)滏湣?amp;lt;3>最適pH值按標(biāo)準(zhǔn)分析方法測定活性，其中用下列0.2M緩沖液改變pH值。pH 2-4甘氨酸/鹽酸緩沖液pH 4-5.5乙氨酸/乙酸鈉緩沖液pH 5.5-7:MES緩沖液(Good緩沖液)pH 7-8:MOPS緩沖液(Good緩沖液)pH 8-9:Tris-HCl緩沖液結(jié)果展示于圖5。本發(fā)明的新型肌醇六磷酸酶在pH5.0-6.5表現(xiàn)出最大活性。在pH7.0或更大時(shí)，此酶無活性。<4>pH穩(wěn)定性將2.1mg/ml新型肌醇六磷酸酶在下列100M緩沖液于37℃放置60分鐘，按標(biāo)準(zhǔn)分析方法測定其活性。pH 2-4甘氨酸/鹽酸緩沖液pH 4-5.5乙氨酸/乙酸鈉緩沖液pH 5.5-7:MES緩沖液(Good緩沖液)pH 7-8:MOPS緩沖液(Good緩沖液)pH 8-9:Tris-HCl緩沖液結(jié)果展示于圖6。
來自黑曲霉SK57和MH-PA1的新型肌醇六磷酸酶在pH4.5-7.5中具有60％或更高的活性。
來自構(gòu)巢曲霉M-PA1和米曲霉MO-PG3新型肌醇六磷酸酶在pH8或低于pH8，具有70％或更高活性。<5>最適溫度其活性通過標(biāo)準(zhǔn)分析方法在0-70℃的反應(yīng)溫度范圍內(nèi)測定。結(jié)果展示于圖7。本發(fā)明的新型肌醇六磷酸酶在45-65℃具有最大其活性。<6>溫度穩(wěn)定性酶液以2.1mg/ml的蛋白濃度在100M乙氨酸/乙酸鈉緩沖液(pH5.5)中于0-60℃放置60分鐘，按標(biāo)準(zhǔn)分析方法測定其活性。
結(jié)果展示于圖8。
來自黑曲霉SK57和MH-PA1的新型肌醇六磷酸酶在30℃或30℃以下中具有70％或更高的相對(duì)活性。
來自構(gòu)巢曲霉M-PA1和米曲霉MO-PG3新型肌醇六磷酸酶在高至50℃時(shí)仍穩(wěn)定，在高于50℃時(shí)，其漸漸失活。因?yàn)閬碜詷?gòu)巢曲霉M-PA1和米曲霉MO-PG3新型肌醇六磷酸酶具有如實(shí)施例8-1所示的碳?xì)滏溔藗冋J(rèn)為它們比來自黑曲霉SK57和MH-PA1的新型肌醇六磷酸酶具有更高的熱穩(wěn)定性。<7>底物特異性其活性通過標(biāo)準(zhǔn)分析方法進(jìn)行，其中底物濃度為1mM和10mM。
來自黑曲霉SK57的新型肌醇六磷酸酶的測定結(jié)果列于表1。此新型肌醇六磷酸酶對(duì)于表1的底物具有低的特異性，它對(duì)植酸以外的底物活性也較低。來自其他株系的新型肌醇六磷酸酶具有相同的結(jié)果。
表1

<8>等電聚焦等電聚焦以AE-3230型電泳儀(Atoh)在3％聚丙烯酰胺凝膠(Ampholine pH3.5-10.0)上進(jìn)行。
來自黑曲霉SK57的新型肌醇六磷酸酶的結(jié)果示于圖9。新型肌醇六磷酸酶的等電點(diǎn)(PI)在pH4.7-5.4。
工業(yè)應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明，它可提供一種對(duì)于植酸有低的，價(jià)格低廉的肌醇六磷酸酶，編碼此肌醇六磷酸酶的DNA，具有該DNA的重組DNA，攜帶該重組DNA的轉(zhuǎn)化子，利用該轉(zhuǎn)化子制備肌醇六磷酸酶的方法。該肌醇六磷酸酶可用于飼料以降解飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子-植酸，由此提高飼料的營價(jià)值并可有效利用降解釋放出的磷酸。
序列表序列號(hào)1長度443類型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型蛋白質(zhì)假擬的是序列描述序列號(hào)1Ser Arg Asn Gln Ser Thr Cys Asp Thr Val Asp Gln Gly Tyr Gln Cys1 5 10 15Phe Ser Glu Thr Ser His Leu Trp Gly Gln Tyr Ala Pro Phe Phe Ser20 25 30Leu Ala Asn Lys Ser Ala Ile Ser Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys His35 40 45Val Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro Thr50 55 60Asp Ser Lys Gly Lys Lys Tyr Ser Ala Leu Ile Glu Glu Ile Gln Gln65 70 75 80Asn Ala Thr Thr Phe Glu Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn85 90 95Tyr Ser Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gln Glu Leu100 105 110Val Asn Ser Gly Val Lys Phe Tyr Gln Arg Tyr Glu Ser Leu Thr Arg115 120 125Asn Ile Val Pro Phe Ile Arg Ser Ser Gly Ser Ser Arg Val Ile Ala130 135 140Ser Gly Ash Lys Phe Ile Glu Gly Phe Gln Ser Thr Lys Leu Lys Asp145 150 155 160Pro Arg Ala Gln Pro Gly Gln Ser Ser Pro Lys Ile Asp Val Val Ile165 170 175Ser Glu Ala Ser Thr Ser Asn Ash Thr Leu Asp Pro Gly Thr Cys Thr180 185 190Val Phe Glu Asp Ser Glu Leu Ala Asp Asp Ile Glu Ala Asn Phe Thr195 200 205Ala Thr Phe Val Pro Ser Ile Arg Gln Arg Leu Glu Asn Asp Leu Ser210 215 220GlY Val Ser Leu Thr Asp Thr Glu Val Thr Tyr Leu Met Asp Met Cys225 230 235 240Ser Phe Asp Thr Ile Ser Thr Ser Thr Val Asp Thr Lys Leu Ser Pro245 250 255Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Glu Glu Trp Ile Asn Tyr Asp Tyr Leu260 265 270Gln Ser Leu Asn Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly Asn Pro Leu Gly275 280 285Pro Thr Gln Gly Val Gly Tyr Ala Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu Thr290 295 300His Ser Pro Val His Asp Asp Thr Ser Ser Asn His Thr Leu Asp Ser305 310 315 320Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ser325 330 335His Asp Asn Gly Ile Ile Ser Ile Leu Phe Ala Leu Gly Leu Tyr Asn
340 345 350Gly Thr Lys Pro Leu Ser Ser Thr Thr Ala Glu Asn Ile Thr Gln Thr355 360 365Asp Gly Phe Ser Ser Ala Trp Thr Val Pre Phe Ala Ser Arg Met Tyr370 375 380Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ser Glu Gln Glu Pro Leu Val Arg Val385 390 395 400Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Pro Val Asp Ala405 410 415Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Ser Phe Val Lys Gly Leu Ser Phe Ala420 425 430Arg Ser Gly Gly Asp Trp Gly Glu Cys Phe Ala435 440序列號(hào)2長度443類型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型蛋白質(zhì)假擬的是序列描述序列號(hào)2Ser Xaa Xaa Gln Ser Thr Cys Asp Thr Val Asp Gln Gly Tyr Gln Cys1 5 10 15Phe Ser Glu Thr Ser His Leu Trp Gly Gln Tyr Ala Pro Phe Phe Ser20 25 30Leu Ala Asn Lys Ser Ala Ile Ser Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys His35 40 45Val Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro Thr50 55 60Asp Ser Lys Gly Lys Lys Tyr Ser Ala Leu Ile Glu Glu Ile Gln Gln65 70 75 80Asn Ala Thr Thr Phe Glu Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn85 90 95Tyr Ser Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gln Glu Leu100 105 110Val Asn Ser Gly Val Lys Phe Tyr Gln Arg Tyr Glu Ser Leu Thr Arg115 120 125Asn Ile Val Pro Phe Ile Arg Ser Ser Gly Ser Ser Arg Val Ile Ala130 135 140Ser Gly Asn Lys Phe Ile Glu Gly Phe Gln Ser Thr Lys Leu Lys Asp145 150 155 160Pro Arg Ala Gln Pro Gly Gln Ser Ser Pro Lys Ile Asp Val Val Ile165 170 175Ser Glu Ala Ser Thr Ser Asn Asn Thr Leu Asp Pro Gly Thr Cys Thr180 185 190Val Phe Glu Asp Ser Glu Leu Ala Asp Asp Ile Glu Ala Asn Phe Thr195 200 205Ala Thr Phe Val Pro Ser Ile Arg Gln Arg Leu Glu Asn Asp Leu Ser210 215 220Gly Val Ser Leu Thr Asp Thr Glu Val Thr Tyr Leu Met Asp Met Cys225 230 235 240Ser Phe Asp Thr Ile Ser Thr Ser Thr Val Asp Thr Lys Leu Ser Pro245 250 255Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Glu Glu Trp Ile Asn Tyr Asp Tyr Leu260 265 270Gln Ser Leu Asn Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly Asn Pro Leu Gly275 280 285Pro Thr Gln Gly Val Gly Tyr Ala Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu Thr290 295 300His Ser Pro Val His Asp Asp Thr Ser Ser Asn His Thr Leu Asp Ser305 310 315 320Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ser325 330 335His Asp Asn Gly Ile Ile Ser Ile Leu Phe Ala Leu Gly Leu Tyr Asn340 345 350Gly Thr Lys Pro Leu Ser Ser Thr Thr Ala Glu Asn Ile Thr Gln Thr355 360 365Asp Gly Phe Ser Ser Ala Trp Thr Val Pro Phe Ala Ser Arg Met Tyr370 375 380Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ser Glu Gln Glu Pro Leu Val Arg Val385 390 395 400Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Pro Val Asp Ala405 410 415Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Ser Phe Val Lys Gly Leu Ser Phe Ala420 425 430Arg Ser Gly Gly Asp Trp Gly Glu Cys Phe Ala435 440序列號(hào)3長度467類型氨基酸拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型蛋白質(zhì)假擬的是序列描述序列號(hào): 3Met Gly Val Ser Ala Val Leu Leu Pro Leu Tyr Leu Leu Ser Gly Val1 5 10 15Thr Ser Gly Leu Ala Val Pro Ala Ser Arg Asn Gln Ser Thr Cys Asp20 25 30Thr Val Asp Gln Gly Tyr Gln Cys Phe Ser Glu Thr Ser His Leu Trp35 40 45Gly Gln Tyr Ala Pro Phe Phe Ser Leu Ala Asn Lys Ser Ala Ile Ser50 55 60Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys His Val Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser65 70 75 80Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro Thr Asp Ser Lys Gly Lys Lys Tyr Ser85 90 95Ala Leu Ile Glu Glu Ile Gln Gln Asn Ala Thr Thr Phe Glu Gly Lys100 105 110Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn Tyr Ser Leu Gly Ala Asp Asp Leu115 120 125Thr Pro Phe Gly Glu Gln Glu Leu Val Asn Ser Gly Val Lys Phe Tyr130 135 140Gln Arg Tyr Glu Ser Leu Thr Arg Asn Ile Val Pro Phe Ile Arg Ser145 150 155 160Ser Gly Ser Ser Arg Val Ile Ala Ser Gly Asn Lys Phe Ile Glu Gly165 170 175Phe Gln Ser Thr Lys Leu Lys Asp Pro Arg Ala Gln Pro Gly Gln Ser180 185 190Ser Pro Lys Ile Asp Val Val Ile Ser Glu Ala Ser Thr Ser Asn Asn
195 200 205Thr Leu Asp Pro Gly Thr Cys Thr Val Phe Glu Asp Ser Glu Leu Ala210 215 220Asp Asp Ile Glu Ala Asn Phe Thr Ala Thr Phe Val Pro Ser Ile Arg225 230 235 240Gln Arg Leu Glu Asn Asp Leu Ser Gly Val Ser Leu Thr Asp Thr Glu245 250 255Val Thr Tyr Leu Met Asp Met Cys Ser Phe Asp Thr Ile Ser Thr Ser260 265 270Thr Val Asp Thr Lys Leu Ser Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Glu275 280 285Glu Trp Ile Asn Tyr Asp Tyr Leu Gln Ser Leu Asn Lys Tyr Tyr Gly290 295 300His Gly Ala Gly Asn Pro Leu Gly Pro Thr Gln Gly Val Gly Tyr Ala305 310 315 320Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu Thr His Ser Pro Val His Asp Asp Thr325 330 335Ser Ser Asn His Thr Leu Asp Ser Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn340 345 350Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn Gly Ile Ile Ser Ile355 360 365Leu Phe Ala Leu Gly Leu Tyr Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Ser Thr370 375 380Thr Ala Glu Asn Ile Thr Gln Thr Asp Gly Phe Ser Ser Ala Trp Thr385 390 395 400Val Pro Phe Ala Ser Arg Met Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ser405 410 415Glu Gln Glu Pro Leu Val Arg Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro420 425 430Leu His Gly Cys Pro Val Asp Ala Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Ser435 440 445Phe Val Lys Gly Leu Ser Phe Ala Arg Ser Gly Gly Asp Trp Gly Glu450 455 460Cys Phe Ala465序列號(hào)4長度1332類型核苷酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型分子類型基因組DNA序列描述序列號(hào)4TCG AGA AAT CAA TCC ACT TGC GAT ACG GTC GAT CAG GGG TAT CAA TGC48Ser Arg Asn Gln Ser Thr Cys Asp Thr Val Asp Gln Gly Tyr Gln Cys1 5 10 15TTC TCG GAG ACT TCG CAT CTT TGG GGC CAA TAC GCG CCG TTC TTT TCT96Phe Ser Glu Thr Ser His Leu Trp Gly Gln Tyr Ala Pro Phe Phe Ser20 25 30CTG GCAAAC AAA TCG GCC ATC TCC CCT GAT GTT CCT GCC GGA TGC CAT144Leu Ala Asn Lys Ser Ala Ile Ser Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys His35 40 45GTC ACT TTC GCC CAG GTT CTC TCC CGC CAT GGA GCA CGG TAT CCG ACC 192Val Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro Thr50 55 60GAC TCC AAG GGC AAG AAA TAC TCC GCT CTC ATC GAG GAG ATC CAG CAG 240Asp Ser Lys Gly Lys Lys Tyr Ser Ala Leu Ile Glu Glu Ile Gln Gln65 70 75 80AAC GCG ACA ACC TTC GAG GGG AAA TAT GCC TTC CTG AAG ACA TAC AAC 288Asn Ala Thr Thr Phe Glu Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn85 90 95AC AGC CTG GGC GCG GAT GAT CTG ACT CCC TTC GGA GAG CAG GAG CTG 336Tyr Ser Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gln Glu Leu100 105 110GTC AAC TCC GGC GTC AAG TTC TAC CAG CGA TAC GAA TCG CTC ACA AGA 384Val Asn Ser Gly Val Lys Phe Tyr Gln Arg Tyr Glu Ser Leu Thr Arg115 120 125AAC ATT GTC CCG TTC ATC CGA TCC TCA GGC TCC AGC CGC GTG ATT GCC 432Asn Ile Val Pro Phe Ile Arg Ser Ser Gly Ser Ser Arg Val Ile Ala130 135 140TCT GGC AAT AAA TTC ATC GAG GGC TTC CAG AGC ACT AAG CTG AAG GAT 480Ser Gly Asn Lys Phe Ile Glu Gly Phe Gln Ser Thr Lys Leu Lys Asp145 150 155 160CCT CGT GCC CAG CCC GGC CAA TCG TCG CCC AAG ATC GAC GTG GTC ATT 528Pro Arg Ala Gln Pro Gly Gln Ser Ser Pro Lys Ile Asp Val Val Ile165 170 175TCA GAG GCC AGC ACA TCC AAC AAC ACT CTC GAT CCG GGC ACC TGC ACC 576Ser Glu Ala Ser Thr Ser Asn Asn Thr Leu Asp Pro Gly Thr Cys Thr180 185 190GTT TTC GAA GAT AGC GAA TTG GCC GAT GAC ATC GAA GCC AAT TTC ACC 624Val Phe Glu Asp Ser Glu Leu Ala Asp Asp Ile Glu Ala Asn Phe Thr195 200 205GCC ACG TTC GTC CCC TCC ATT CGT CAA CGT CTG GAG AAC GAC TTG TCT 672Ala Thr Phe Val Pro Ser Ile Arg Gln Arg Leu Glu Asn Asp Leu Ser210 215 220GGC GTG TCT CTC ACG GAC ACA GAA GTG ACC TAC CTC ATG GAC ATG TGC 720Gly Val Ser Leu Thr Asp Thr Glu Val Thr Tyr Leu Met Asp Met Cys225 230 235 240TCC TTC GAC ACC ATC TCC ACC AGC ACC GTC GAC ACC AAG CTG TCC CCC 768Ser Phe Asp Thr Ile Ser Thr Ser Thr Val Asp Thr Lys Leu Ser Pro245 250 255TTC TGT GAC CTG TTC ACC CAT GAA GAA TGG ATC AAC TAC GAC TAC CTC 816Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Glu Glu Trp Ile Asn Tyr Asp Tyr Leu260 265 270CAG TCC CTG AAC AAA TAC TAC GGC CAT GGC GCA GGT AAC CCG CTC GGC 864Gln Ser Leu Asn Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly Asn Pro Leu Gly275 280 285CCG ACC CAG GGC GTC GGC TAC GCT AAC GAG CTC ATC GCC CGT CTC ACC 912Pro Thr Gln Gly Val Gly Tyr Ala Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu Thr290 295 300CAC TCG CCT GTC CAC GAT GAC ACC AGC TCC AAC CAC ACA TTG GAC TCC 960His Ser Pro Val His Asp Asp Thr Ser Ser Asn His Thr Leu Asp Ser305 310315 320AAC CCG GCT ACT TTC CCG CTC AAC TCC ACT CTC TAT GCG GAC TTT TCG 1008Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ser325 330 335CAT GAT AAC GGC ATC ATC TCT ATC CTC TTT GCT TTG GGT CTG TAC AAC 1056His Asp Asn Gly Ile Ile Ser Ile Leu Phe Ala Leu Gly Leu Tyr Asn340 345 350GGC ACC AAG CCG CTG TCT TCC ACG ACC GCG GAG AAT ATC ACC CAG ACC 1104Gly Thr Lys Pro Leu Ser Ser Thr Thr Ala Glu Asn Ile Thr Gln Thr355 360 365GAT GGG TTC TCA TCT GCC TGG ACG GTT CCT TTC GCG TCG CGC ATG TAC 1152Asp Gly Phe Ser Ser Ala Trp Thr Val Pro Phe Ala Ser Arg Met Tyr370 375 380GTC GAG ATG ATG CAA TGC CAG TCC GAG CAG GAG CCT TTG GTC CGT GTC 1200Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ser Glu Gln Glu Pro Leu Val Arg Val385 390 395 400TTG GTT AAT GAT CGT GTT GTT CCG CTG CAT GGC TGT CCG GTT GAT GCT 1248Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Pro Val Asp Ala
405 410 415TTG GGA AGA TGT ACG CGG GAT AGC TTC GTG AAG GGG TTG AGC TTT GCC1296Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Ser Phe Val Lys Gly Leu Ser Phe Ala420 425 430AGA TCT GGC GGT GAT TGG GGG GAG TGT TTC GCT TAG1332Arg Ser Gly Gly Asp Trp Gly Glu Cys Phe Ala Ala435 440序列號(hào)5長度1515類型核苷酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型基因組DNA假擬的是反義是在基因組的位置單位基因組％序列描述序列號(hào)5ATG GGT GTC TCT GCC GTT CTA CTT CCT TTG TAC CTC CTG TCC GG 44Met Gly Val Ser Ala Val Leu Leu Pro Leu Tyr Leu Leu Ser Gly-20 -15 -10GTATGCTAAT CATCCCTATC GGAGCCTGAT ATGGACCCTC CCCTTCCGAA GGCCCCCTGA 104AGCTTGGACT GTGTGGGACT ATTGATCTGA TCGCTGACAA TCTGTGCACA GA GTC 159ValACC TCC GGA CTG GCA GTC CCC GCC TCG AGA AAT CAA TCC ACT TGC GAT 207Thr Ser Gly Leu Ala Val Pro Ala Ser Arg Asn Gln Ser Thr Cys Asp-5 1 5ACG GTC GAT CAG GGG TAT CAA TGC TTC TCG GAG ACT TCG CAT CTT TGG 255Thr Val Asp Gln Gly Tyr Gln Cys Phe Ser Glu Thr Ser His Leu Trp10 15 20GGC CAA TAC GCG CCG TTC TTT TCT CTG GCA AAC AAA TCG GCC ATC TCC 303Gly Gln Tyr Ala Pro Phe Phe Ser Leu Ala Asn Lys Ser Ala Ile Ser25 30 35 40CCT GAT GTT CCT GCC GGA TGC CAT GTC ACT TTC GCC CAG GTT CTC TCC 351Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys His Val Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser45 50 55CGC CAT GGA GCA CGG TAT CCG ACC GAC TCC AAG GGC AAG AAA TAC TCC 399Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro Thr Asp Ser Lys Gly Lys Lys Tyr Ser60 65 70GCT CTC ATC GAG GAG ATC CAG CAG AAC GCG ACA ACC TTC GAG GGG AAA 447Ala Leu Ile Glu Glu Ile Gln Gln Asn Ala Thr Thr Phe Glu Gly Lys75 80 85TAT GCC TTC CTG AAG ACA TAC AAC TAC AGC CTG GGC GCG GAT GAT CTG 495Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn Tyr Ser Leu Gly Ala Asp Asp Leu90 95 100ACT CCC TTC GGA GAG CAG GAG CTG GTC AAC TCC GGC GTC AAG TTC TAC 543Thr Pro Phe Gly Glu Gln Glu Leu Val Asn Ser Gly Val Lys Phe Tyr105 110 115 120CAG CGA TAC GAA TCG CTC ACA AGA AAC ATT GTC CCG TTC ATC CGA TCC 591Gln Arg Tyr Glu Ser Leu Thr Arg Asn Ile Val Pro Phe Ile Arg Ser
125 130 135TCA GGC TCC AGC CGC GTG ATT GCC TCT GGC AAT AAA TTC ATC GAG GGC 639Ser Gly Ser Ser Arg Val Ile Ala Ser Gly Asn Lys Phe Ile Glu Gly140 145 150TTC CAG AGC ACT AAG CTG AAG GAT CCT CGT GCC CAG CCC GGC CAA TCG 687Phe Gln Ser Thr Lys Leu Lys Asp Pro Arg Ala Gln Pro Gly Gln Ser155 160 165TCG CCC AAG ATC GAC GTG GTC ATT TCA GAG GCC AGC ACA TCC AAC AAC 735Ser Pro Lys Ile Asp Val Val Ile Ser Glu Ala Ser Thr Ser Asn Asn170 175 180ACT CTC GAT CCG GGC ACC TGC ACC GTT TTC GAA GAT AGC GAA TTG GCC 783Thr Leu Asp Pro Gly Thr Cys Thr Val Phe Glu Asp Ser Glu Leu Ala185 190 195 200GAT GAC ATC GAA GCC AAT TTC ACC GCC ACG TTC GTC CCC TCC ATT CGT 831Asp Asp Ile Glu Ala Asn Phe Thr Ala Thr Phe Val Pro Ser Ile Arg205 210 215CAA CGT CTG GAG AAC GAC TTG TCT GGC GTG TCT CTC ACG GAC ACA GAA 879Gln Arg Leu Glu Asn Asp Leu Ser Gly Val Ser Leu Thr Asp Thr Glu220 225 230GTG ACC TAC CTC ATG GAC ATG TGC TCC TTC GAC ACC ATC TCC ACC AGC 927Val Thr Tyr Leu Met Asp Met Cys Ser Phe Asp Thr Ile Ser Thr Ser235 240 245ACC GTC GAC ACC AAG CTG TCC CCC TTC TGT GAC CTG TTC ACC CAT GAA 975Thr Val Asp Thr Lys Leu Ser Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Glu250 255 260GAA TGG ATC AAC TAC GAC TAC CTC CAG TCC CTG AAC AAA TAC TAC GGC 1023Glu Trp Ile Asn Tyr Asp Tyr Leu Gln Ser Leu Asn Lys Tyr Tyr Gly265 270 275 280CAT GGC GCA GGT AAC CCG CTC GGC CCG ACC CAG GGC GTC GGC TAC GCT 1071His Gly Ala Gly Asn Pro Leu Gly Pro Thr Gln Gly Val Gly Tyr Ala285 290 295AAC GAG CTC ATC GCC CGT CTC ACC CAC TCG CCT GTC CAC GAT GAC ACC 1119Asn Glu Leu Ile Ala Arg Leu Thr His Ser Pro Val His Asp Asp Thr300 305 310AGC TCC AAC CAC ACA TTG GAC TCC AAC CCG GCT ACT TTC CCG CTC AAC 1167Ser Ser Asn His Thr Leu Asp Ser Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn315 320 325TCC ACT CTC TAT GCG GAC TTT TCG CAT GAT AAC GGC ATC ATC TCT ATC 1215Ser Thr Leu Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn Gly Ile Ile Ser Ile330 335 340CTC TTT GCT TTG GGT CTG TAC AAC GGC ACC AAG CCG CTG TCT TCC ACG 1263Leu Phe Ala Leu Gly Leu Tyr Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Ser Thr345 350 355 360ACC GCG GAG AAT ATC ACC CAG ACC GAT GGG TTC TCA TCT GCC TGG ACG 1311Thr Ala Glu Asn Ile Thr Gln Thr Asp Gly Phe Ser Ser Ala Trp Thr365 370 375GTT CCT TTC GCG TCG CGC ATG TAC GTC GAG ATG ATG CAA TGC CAG TCC 1359Val Pro Phe Ala Ser Arg Met Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ser380 385 390GAG CAG GAG CCT TTG GTC CGT GTC TTG GTT AAT GAT CGT GTT GTT CCG 1407Glu Gln Glu Pro Leu Val Arg Val Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro395 400 405CTG CAT GGC TGT CCG GTT GAT GCT TTG GGA AGA TGT ACG CGG GAT AGC 1455Leu His Gly Cys Pro Val Asp Ala Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Ser410 415 420TTC GTG AAG GGG TTG AGC TTT GCC AGA TCT GGC GGT GAT TGG GGG GAG 1503Phe Val Lys Gly Leu Ser Phe Ala Arg Ser Gly Gly Asp Trp Gly Glu425 430 435 440TGT TTC GCT TAG 1515Cys Phe Ala443序列號(hào)6長度32類型核苷酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型其他核苷酸，合成DNA序列描述序列號(hào)6GGGAATTCAT GGGCGTCTCT GCTGTTCTAC TT 32序列號(hào)7長度32類型核苷酸鏈型單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型其他核苷酸，合成DNA序列描述序列號(hào)7GGGAATTCCT AAGCAAAACA CTCCGCCCAA TC 3權(quán)利要求
1.一種當(dāng)用植酸作底物時(shí)，米氏常數(shù)為10-30μM的肌醇六磷酸酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的肌醇六磷酸酶，具有以下物理化學(xué)特征<1>分子量(通過SDS-PAGE)用內(nèi)切糖苷酶H處理后為60KDa；<2>最適pH值pH5.0-6.5；<3>最適溫度45-65℃時(shí)，具最大活性；<4>底物特異性可作用的底物有，植酸，對(duì)硝基苯基磷酸，D-葡萄糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸，D-myo-肌醇-1,4,5-三磷酸，甘油磷酸和腺苷三磷酸；及<5>等電聚焦pI4.7-5.4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的肌醇六磷酸酶，其中的肌醇六磷酸酶是選自如下的蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO:1,2和3所示氨基酸序列的蛋白；或具有SEQ ID N0:1,2和3所示氨基酸序列，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被替換、刪除或添加并且當(dāng)將植酸用作底物時(shí)，其Km值為10-30μM的具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的肌醇六磷酸酶，其中的肌醇六磷酸酶源于黑曲霉屬的微生物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的肌醇六磷酸酶，其中屬于黑曲霉屬的微生物選自黑曲霉SK57(FERM BP-5473)或黑曲霉SK92(FERM BP-5481)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)的肌醇六磷酸酶，其中的肌醇六磷酸酶具有糖鏈。
7.一種基因，當(dāng)用植酸作底物時(shí)，其所編碼的肌醇六磷酸酶的米氏常數(shù)為10-30μM。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的基因，其中的肌醇六磷酸酶具有以下物理化學(xué)特征<1>分子量(通過SDS-PAGE)用內(nèi)切糖苷酶H處理后為60KDa；<2>最適pH值pH5.0-6.5；<3>最適溫度45-65℃時(shí)，具最大活性；<4>底物特異性可作用的底物有植酸，對(duì)硝基苯基磷酸，D-葡萄糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸，D-myo-肌醇-1,4,5-三磷酸，甘油磷酸和腺苷三磷酸；及<5>等電聚焦pI4.7-5.4。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的基因，其中的基因編碼的蛋白是選自如下的蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO:1,2和3所示氨基酸序列的蛋白；具有SEQ ID NO:1,2和3所示氨基酸序列，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被替換、刪除或添加并且當(dāng)將植酸用作底物時(shí)，其Km值為10-30μM的具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8的基因，其中的基因選自SEQ ID NO:4和5所示的DNA。
11.根據(jù)權(quán)利要求7或8的基因，其中的基因源于黑曲霉屬的微生物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的基因，其中屬于黑曲霉屬的微生物選自黑曲霉SK57(FERM BP-5473)或黑曲霉SK92(FERM BP-5481)。
13.通過將一個(gè)DNA片段引入一個(gè)載體而得到重組DNA，其中的DNA片段編碼一種當(dāng)用植酸作底物時(shí)，米氏常數(shù)為10-30μM的肌醇六磷酸酶的基因。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的重組DNA，其中的肌醇六磷酸酶具有以下物理化學(xué)特征<1>分子量(通過SDS-PAGE)用內(nèi)切糖苷酶H處理后為60KDa；<2>最適pH值pH5.0-6.5；<3>最適溫度45-65℃時(shí)，具最大活性；<4>底物特異性可作用的底物有，植酸，對(duì)硝基苯基磷酸，D-葡萄糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸，D-myo-肌醇-1,4,5-三磷酸，甘油磷酸和ATP；及<5>等電聚焦pI4.7-5.4。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的重組DNA，其中的基因編碼的蛋白是選自如下的蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO:1,2和3所示氨基酸序列的蛋白；或具有SEQ ID NO:1,2和3所示氨基酸序列，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被替換、刪除或添加并且當(dāng)將植酸用作底物時(shí)，其Km值為10-30μM的具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白。
16.根據(jù)權(quán)利要求13或14的重組DNA，其中的基因選自SEQ IDNO:4和5所示的DNA。
17.根據(jù)權(quán)利要求13或14的重組DNA，其中的基因源于黑曲霉屬的微生物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的重組DNA，其中屬于黑曲霉屬的微生物選自黑曲霉SK57(FERM BP-5473)或黑曲霉SK92(FERM BP-5481)。
19.根據(jù)權(quán)利要求13或14的重組DNA，其中的重組DNA是pANPHY1。
20.攜帶重組DNA的轉(zhuǎn)化子，該重組DNA是通過將含有編碼一種骨醇六磷酸酶的基因的DNA片段導(dǎo)入載體中而得到，當(dāng)用植酸作底物時(shí)，該酶的米氏常數(shù)為10-30μM。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的轉(zhuǎn)化子，其中的肌醇六磷酸酶具有以下物理化學(xué)特征<1>分子量(通過SDS-PAGE)用內(nèi)切糖苷酶H處理后為60KDa；<2>最適pH值pH5.0-6.5；<3>最適溫度45-65℃時(shí)，具最大活性；<4>底物特異性可作用的底物有，植酸，對(duì)硝基苯磷酸，D-葡萄糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸，D-myo-肌醇-1,4,5-三磷酸，甘油磷酸和ATP；及<5>等電聚焦pI4.7-5.4。
22.根據(jù)權(quán)利要求20或21的轉(zhuǎn)化子，其中的基因編碼的蛋白是選自如下的蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO:1,2和3所示氨基酸序列的蛋白；或具有SEQ ID NO:1,2和3所示氨基酸序列，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被替換、刪除或添加并且當(dāng)將植酸用作底物時(shí)，其Km值為10-30μM的具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白。
23.根據(jù)權(quán)利要求20或21的轉(zhuǎn)化子，其中的基因選自SEQ ID NO:4和5所示的DNA。
24.根據(jù)權(quán)利要求20或21的基因，其中的基因源于黑曲霉屬的微生物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的基因，其中屬于黑曲霉屬的微生物選自黑曲霉SK57(FERM BP-5473)或黑曲霉SK92(FERM BP-5481)。
26.根據(jù)權(quán)利要求20或21的轉(zhuǎn)化子，其中的重組DNA是pANPHY1。
27.根據(jù)權(quán)利要求20或21的轉(zhuǎn)化子，其中的轉(zhuǎn)化子選自下述微生物大腸桿菌屬，沙雷菌屬，棒狀桿菌屬，短桿菌屬，假單孢菌屬，芽孢桿菌屬，曲霉屬，根霉菌屬，木霉屬，鏈孢霉屬，毛霉菌屬，青霉屬，克魯維氏酵母屬，糖酵母屬，裂殖糖酵母屬。
28.根據(jù)權(quán)利要求20或21的轉(zhuǎn)化子，其中的轉(zhuǎn)化子選自黑曲霉MH-PA1(FERM BP-5372)，構(gòu)巢曲霉M-PA1(FERM BP-5373)和米曲霉MO-PG3。
29.一種制備肌醇六磷酸酶的方法，當(dāng)用植酸作底物時(shí)，該酶的米氏常數(shù)為10-30μM，包括，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有生產(chǎn)和積累肌醇六磷酸酶的微生物，生產(chǎn)和積累肌醇六磷酸酶，從培養(yǎng)物中回收肌醇六磷酸酶。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中的肌醇六磷酸酶具有以下物理化學(xué)特征<1>分子量(通過SDS-PAGE)用內(nèi)切糖苷酶H處理后為60KDa；<2>最適pH值pH5.0-6.5；<3>最適溫度45-65℃時(shí)，具最大活性；<4>底物特異性可作用的底物有，植酸，對(duì)硝基苯磷酸，D-葡萄糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸，D-myo-肌醇-1,4,5-三磷酸，甘油磷酸和腺苷三磷酸；及<5>等電聚焦pI4.7-5.4。
31.根據(jù)權(quán)利要求29或30的方法，其中屬于黑曲霉屬的微生物選自黑曲霉SK57(FERM BP-5473)或黑曲霉SK92(FERM BP-5481)。
32.根據(jù)權(quán)利要求29或30的方法，其中的微生物是一個(gè)攜帶有重組DNA的轉(zhuǎn)化子，其中的重組DNA是通過將包含有一個(gè)基因的DNA片段引入載體而得到的，其中的基因編碼一種肌醇六磷酸酶，當(dāng)用植酸作底物時(shí)，其米氏常數(shù)為10-30μM。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中的基因編碼的蛋白是選自如下的蛋白具有SEQ ID NO:1,2和3所示氨基酸序列的蛋白；或具有SEQID NO:1,2和3所示氨基酸序列，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被替換、刪除或添加并且當(dāng)將植酸用作底物時(shí)，其Km值為10-30μM的具有肌醇六磷酸酶活性的蛋白。
34.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中的基因選自SEQ ID NO:4和5所示的DNA。
35.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中的基因源于黑曲霉屬的微生物。
36.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中屬于黑曲霉屬的微生物選自黑曲霉SK57(FERM BP-5473)或黑曲霉SK92(FERM BP-5481)。
37.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中的重組DNA是pANPHY1。
38.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中的轉(zhuǎn)化子選自下述微生物大腸桿菌屬，沙雷菌屬，棒狀桿菌屬，短桿菌屬，假單孢菌屬，芽孢桿菌屬，曲霉屬，根霉菌屬，木霉屬，鏈孢霉屬，毛霉菌屬，青霉屬，克魯維氏酵母屬，糖酵母屬，裂殖糖酵母屬。
39.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中的轉(zhuǎn)化子選自黑曲霉MH-PA1(FERM BP-5372)，構(gòu)巢曲霉M-PA1(FERM BP-5373)和米曲霉MO-PG3。
40.一種動(dòng)物飼料，包含有一種當(dāng)用植酸作底物時(shí)，米氏常數(shù)為10-30μM的肌醇六磷酸酶。
全文摘要
一種對(duì)于植酸有低的米氏常數(shù),價(jià)格低廉的肌醇六磷酸酶;編碼此肌醇六磷酸酶的DNA;包含有該DNA整合其中的重組DNA;攜帶該重組DNA的轉(zhuǎn)化子;利用該轉(zhuǎn)化子制備肌醇六磷酸酶的方法,一種利用該肌醇六磷酸酶制備的飼料。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1220697SQ9719516
公開日1999年6月23日 申請(qǐng)日期1997年4月4日 優(yōu)先權(quán)日1996年4月5日
發(fā)明者近藤英正, 穴澤秀治, 兼子俊一, 長島直, 丹下達(dá)也 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社, 新日本化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社