新型糖基轉移酶基因及其使用的制作方法

文檔序號：1291337閱讀：985來源：國知局

新型糖基轉移酶基因及其使用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供編碼具有在黃酮4’位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的多核苷酸。一種多核苷酸，其選自(a)多核苷酸，其由序列號1的堿基序列組成；(b)多核苷酸，其為與由序列號1的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸在高嚴謹條件下雜交的多核苷酸，且編碼具有在黃酮4’位羥基上轉移糖的活性的蛋白質；(c)多核苷酸，其編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質；(d)多核苷酸，其編碼由序列號2的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有在黃酮4’位羥基上轉移糖的活性的蛋白質等。
【專利說明】新型糖基轉移酶基因及其使用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及編碼具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的多核苷酸及其使用。

【背景技術】
[0002] 花卉產業(yè)中，具有新性狀的花總是備受珍重。特別是改變了作為花中最重要的性狀即"花色"的植物的開發(fā)在產業(yè)很受重視，至今為止，利用古老方法通過雜交進行品種改良已開發(fā)出各種各樣顏色的花。雜交雖然是有效的品種改良方法，但因植物中的固有的遺傳限制，所以存在只能利用可雜交的近緣種所具有的基因資源的缺點。例如，盡管進行了長年的雜交育種，但至今為止在月季、康乃馨、菊花、百合中還未育出紫色?藍色，龍膽、鳶尾中還未育出鮮艷的紅色，老鸛草、牽牛花中還未育出黃色的品種。
[0003] 花的顏色由類黃酮、類胡蘿卜素、葉綠素、甜菜素的4種色素生成。其中，類黃酮呈現黃、紅、紫、藍等多種顏色。呈現紅、紫、藍色的1組總稱為花色素苷，花色素苷結構的豐富多彩是花色豐富多彩的原因之一?？紤]到花色素苷的生物合成途徑時，其依賴于苷元的結構，大致可分為3個組。如康乃馨、老鸛草的鮮艷的紅色花中富含花葵素型花色素苷，藍色、紫色花中富含花翠素型花色素苷。月季、康乃馨、菊花、百合中不存在藍、紫色的品種，是因為這些植物不具有合成花翠素型花色素苷的能力。
[0004] 為了使花色變藍，不僅要積累花翠素，認為還需要（i)花色素苷被1個或多個芳香族?；揎棧╥i)花色素苷與黃酮、黃酮醇等的輔色素共存，（iii)鐵離子、鋁離子與花色素苷共存，（iv)花色素苷所定位的液胞的pH從中性上升到弱堿性，或（v)花色素苷、輔色素、金屬離子形成復合物（這樣的花色素苷稱為金屬花色素苷（metalloanthocyanin))中的任一條件（以下的非專利文獻1)。
[0005] 類黃酮、花色素苷的生物合成已被充分研究，并鑒定了相關的生物合成酶、編碼該酶的基因（參照以下非專利文獻2、圖1)。例如，已從大量植物中獲得了花翠素生物合成所必需的羥化類黃酮B環(huán)的類黃酮3'，5' -羥化酶（F3' 5'H)的基因。此外，通過將這些 F3' 5' Η基因轉入康乃馨（參照以下專利文獻1)、月季（參照以下非專利文獻3、專利文獻 2、3)、菊花（參照以下專利文獻4)，可育出在花瓣內積累花翠素，使花色變藍的基因重組植物（參照以下非專利文獻4)。此種康乃馨和月季已有市售。
[0006] 黃酮（flavone)為有機化合物的一種，黃烷衍生物的環(huán)狀酮，狹義上指化學式 C15H1Q〇2、分子量 222. 24 的化合物、2, 3-二脫氫黃烷-4-酮（2, 3-didehydroflavan-4_one)。廣義上將屬于黃酮類的衍生物稱為"黃酮"。廣義的黃酮（黃酮類）是類黃酮的生物類別之一，類黃酮中以黃酮結構為基本骨架，而且3位上不具有羥基的類黃酮分類為"黃酮"。作為代表性的"黃酮"，可列舉為芹菜素（3?丨861^11 ;4'，5,7-三羥基黃酮 (4'，5, 7-trihydroxyflavon e))、木渾草素（luteolin ;3'，4'，5, 7_ 四輕基黃麗（3'，4'，5， 7-tetrahydroxyflavone))。本申請說明書中，用語"黃酮"是指廣義的黃酮、即屬于黃酮類的衍生物。
[0007] 還可從大量的植物中獲得黃酮生物合成中所必需的黃酮合成酶（FNS)基因。已知黃酮與花色素苷共存時，具有使花色素苷的顏色變藍變深的效果，這些FNS基因在花色改變中引人注目。通過將FNS基因與F3' 5'Η-起轉入不具有合成黃酮能力的月季中，可在花瓣中積累花翠素的同時也積累黃酮，從而使花色變得更藍（參照以下專利文獻5)。而且，因黃酮除了使花色變藍以外，還吸收紫外線，所以，可保護植物不受紫外線傷害，或在蟲媒花中作為發(fā)送給昆蟲視覺的信號而發(fā)揮功能。此外，黃酮還與植物和土壤微生物之間的相互作用有關。而且，黃酮作為對健康有益的成分還用作食品、化妝品的材料。例如，黃酮被認為具有抗癌作用，已證實通過攝取大量含有黃酮的食物材料，可治療和預防癌癥。
[0008] 此外，還從大量植物中得到修飾花色素苷、黃酮的基因。雖具有糖基轉移酶、?；?轉移酶、甲基轉移酶等，但在此記載的是有關催化糖苷化反應的糖基轉移酶（GT)。例如，編碼具有在花色素苷3位羥基上轉移葡萄糖的活性的蛋白質的基因已從龍膽、紫蘇、矮牽牛、月季、金魚草等中分離（參照以下非專利文獻4?6、專利文獻6)。編碼具有在花色素苷 5位羥基上轉移葡萄糖的活性的蛋白質的基因已從紫蘇、矮牽牛、龍膽、馬鞭草、藍豬耳等中分離（參照以下非專利文獻5?7、專利文獻7)。編碼具有在黃酮7位羥基上轉移葡萄糖的活性的蛋白質的基因已從擬南芥中分離（參照以下非專利文獻8)。還報道了編碼具有在黃芩苷7位羥基上轉移葡萄糖的活性的蛋白質的基因已從黃芩中分離，該基因在大腸桿菌中表達的蛋白質催化顯示在類黃酮7位羥基上轉移葡萄糖的活性的反應（參照以下非專利文獻9)。編碼具有在花色素苷3'位羥基上轉移葡萄糖的活性的蛋白質的基因已從龍膽、蝶豆、瓜葉菊中分離（參照以下專利文獻8)。而且，編碼具有在花色素苷Α環(huán)和C環(huán)2處不同羥基上依次轉移葡萄糖的活性的蛋白質的基因已從月季中分離（參照以下專利文獻9)。編碼具有在花色素苷B環(huán)不同的2處羥基上依次轉移葡萄糖的活性的蛋白質的基因已從蝶豆中分離（參照以下專利文獻10)。
[0009] 所述糖基轉移酶以UDP-葡萄糖為糖供體，但最近，以?；咸烟菫樘枪w的糖基轉移酶也已被鑒定。編碼具有在花色素苷-3葡萄糖苷5位羥基上轉移葡萄糖的活性的蛋白質的基因已從康乃馨中分離，編碼具有在7位羥基上轉移葡萄糖的活性的蛋白質的基因已從飛燕草中分離（參照以下非專利文獻10)。
[0010] 如此，作為糖基轉移酶，存在大量各種各樣的具有在羥基上轉移葡萄糖的活性的蛋白質。
[0011] 但是，認為還留有很多其功能還未得到鑒定的糖基轉移酶。例如，還未鑒定出編碼具有在類黃酮4'位上轉移糖的活性的蛋白質的基因、編碼具有在類黃酮A環(huán)和B環(huán)2處羥基上依次轉移糖的活性的蛋白質的基因。雖已報道了使來自彩虹菊的糖基轉移酶基因在大腸桿菌中表達的蛋白質在體外試驗（in vitro)中，顯示出在類黃酮4'位或7位的任一個輕基上轉移葡萄糖的活性，但該糖基轉移酶在植物體中原本的活性為在芐胍5位羥基上轉移葡萄糖（參照以下非專利文獻11)。
[0012] 可是，以鴨跖草、矢車菊、串紅、喜林草的色素為代表的金屬花色素苷 (metalloanthocyanin)由6分子花色素苷、6分子黃酮及2原子金屬離子組成，各成分集合在一起而形成穩(wěn)定的藍色色素（參照圖2、非專利文獻1)。例如，喜林草的金屬花色素苷 (metalloanthocyanin)由Nemophilin (參照圖3)、丙二酰療菜素4'，7-二葡萄糖苷（參照圖 4)、Mg2+及Fe3+形成。串紅的金屬花色素苷（metalloanthocyanin)由 cyanosalvianin (參照圖5)、芹菜素4'，7_二葡萄糖苷（參照圖6)及Mg2+形成。根據至今為止的研究，可知形成金屬花色素苷（metalloanthocyanin)的藍色花均生物合成了在4'位和7位這兩個輕基上附加糖的黃酮，其黃酮上附加的糖在金屬花色素苷（metalloanthocyanin)形成中，在分子識別上擔負著重要的作用。表明在黃酮的4'位上配位的糖在形成時的分子識別中很重要，7位的糖有助于其穩(wěn)定性（參照以下非專利文獻1)。上述的2個糖附加在黃酮上才形成金屬花色素苷（metalloanthocyanin),而顯現美麗的藍色。此外，藍色的荷蘭鸞尾花瓣中含有4'位上附加糖的黃酮。而且，由于黃酮上附加2個糖而使溶解度升高、物性改變，所以，期待能擴大作為健康食品、醫(yī)藥品、化妝品材料的用途。
[0013] 現有技術文獻
[0014] 專利文獻
[0015] 專利文獻1國際公開第W02006/105598號公報
[0016] 專利文獻2國際公開第W02010/122849號公報
[0017] 專利文獻3國際公開第W02005/017147號公報
[0018] 專利文獻4國際公開第W02009/062253號公報
[0019] 專利文獻5國際公開第W02008/156211號公報
[0020] 專利文獻6國際公開第W02007/094521號公報
[0021] 專利文獻7國際公開第W099/05287號公報
[0022] 專利文獻8國際公開第W001/092509號公報
[0023] 專利文獻9日本特開2006-149293號公報
[0024] 專利文獻10日本特開2005-95005號公報
[0025] 非專利文獻
[0026] 非專利文獻 INatural Product Reports (2009)，26, 884-915
[0027] 非專利文獻 2Biosci. Biotechnol. Biochem(2010)，74(9)，1760-1769
[0028] 非專利文獻 3Plant Cell Physiol (2007) ,48 (11)，1589-1600
[0029] 非專利文獻 4Plant Cell Physiol (1996)，37(5)，711-716
[0030] 非專利文獻 5J. Biol. Chem (1999)，274 (11)，7405-7411
[0031] 非專利文獻 6Plant Molecular Biology (2002)，48, 401-411
[0032] 非專利文獻 7Journal of Experimental Botany (2〇〇8)，59 (6)，1241_1252
[0033] 非專利文獻 8Biosci. Biotechnol. Biochem (2006)，70 (6)，1471-1477
[0034] 非專利文獻 9Planta (2000)，210, 1006-1013
[0035] 非專利文獻 lOPlant Cell (2010)，22 (10)，3374-89
[0036] 非專利文獻 llThe Plant Journal (1999)，19(5)，509-519

【發(fā)明內容】

[0037] 改變黃酮的物性對改變花色、對食品、醫(yī)藥品、化妝品材料的開發(fā)非常需要。例如，雖然積累了花翠素的康乃馨、月季、菊花的顏色為藍紫色，但還在進行使該顏色變得更藍的研究。
[0038] 在這種狀況下，本發(fā)明要解決的課題在于，提供編碼具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的多核苷酸及其使用。
[0039] 為解決上述課題，本發(fā)明申請人:深入研究，不斷實驗的結果，確認出可分離編碼具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的多核苷酸，并使用該多核苷酸，從而完成了本發(fā)明。
[0040] 即本發(fā)明如下。
[0041] [1] 一種多核苷酸，其特征在于，選自以下（a)?（e):
[0042] (a)多核苷酸，其由序列號1的堿基序列組成；
[0043] (b)多核苷酸，其為與由序列號1的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交的多核苷酸，且編碼具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質；
[0044] (c)多核苷酸，其編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0045] ⑷多核苷酸，其編碼由序列號2的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質；及
[0046] (e)多核苷酸，其編碼具有與序列號2的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列，且具有在黃酮4 '位羥基上轉移糖的活性的蛋白質。
[0047] [2]根據所述[1]中所述的多核苷酸，其特征在于，為（a)由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸。
[0048] [3]根據所述[1]中所述的多核苷酸，其特征在于，為（c)編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸。
[0049] [4]根據所述[1]中所述的多核苷酸，其特征在于，為（f)編碼具有與序列號2的氨基酸序列有95%以上同一性的氨基酸序列，且具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的多核苷酸。
[0050] [5]根據所述[4]中所述的多核苷酸，其特征在于，為（g)編碼具有與序列號2的氨基酸序列有97%以上同一性的氨基酸序列，且具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的多核苷酸。
[0051] [6]根據所述[5]中所述的多核苷酸，其特征在于，為（h)編碼具有與序列號2的氨基酸序列有98%以上同一性的氨基酸序列，且具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的多核苷酸。
[0052] [7]根據所述[1]?[6]中任一項所述的多核苷酸，其特征在于，為DNA。
[0053] [8] -種蛋白質，其特征在于，由所述[1]?[7]中任一項所述的多核苷酸編碼。
[0054] [9] -種載體，其特征在于，含有所述[1]?[7]中任一項所述的多核苷酸。
[0055] [10] -種非人宿主，其特征在于，轉入所述[9]中所述的載體。
[0056] [11] -種方法，其特征在于，使用所述[1]?[7]中任一項所述的多核苷酸在黃酮 4'位羥基上附加糖。
[0057] [12] -種植物或者其后代或它們的部分或者組織，其特征在于，轉入所述[1]?
[7]中任一項所述的多核苷酸且含有該多核苷酸。
[0058] [13]根據所述[12]中所述的植物的部分，其特征在于，為切花。
[0059] [14] -種切花加工品，其特征在于，使用所述[13]中所述的切花。
[0060] [15] -種具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的制造方法，其特征在于，包含以下工序：
[0061] 培養(yǎng)所述[10]中所述的非人宿主或使其生長發(fā)育，且
[0062] 從該非人宿主中提取具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質。
[0063] [16] -種在4'位羥基上附加糖的黃酮的制造方法，其特征在于，包含以下工序：
[0064] 培養(yǎng)所述[10]中所述的非人宿主或使其生長發(fā)育，且
[0065] 從該非人宿主中提取在4'位羥基上附加糖的黃酮。
[0066] [17] -種食品，其特征在于，含有通過所述[16]中所述的制造方法制造的在4'位羥基上附加糖的黃酮。
[0067] [18] -種醫(yī)藥品，其特征在于，含有通過所述[16]中所述的制造方法制造的在4' 位羥基上附加糖的黃酮。
[0068] [19] 一種化妝品，其特征在于，含有通過所述[16]中所述的制造方法制造的在4' 位羥基上附加糖的黃酮。
[0069] 通過使本發(fā)明的多核苷酸在適當的宿主細胞內表達，可制造具有在黃酮4'位羥基上特異性轉移糖的活性的蛋白質。根據本發(fā)明，通過使具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質在植物內組成型或組織特異性表達，從而可用于改變花色。
[0070] 通過將具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質例如轉入如月季的原本即具有在黃酮7位羥基上轉移糖的活性的植物中，生成在4'位和7位這兩個羥基上附加糖的黃酮?；蛲ㄟ^使具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質與具有在黃酮7位羥基上轉移糖的活性的蛋白質一起在植物體內表達，而生成在4'位和7位這兩個羥基上附加糖的黃酮。
[0071] 此外，通過本發(fā)明，還可提供在4'位羥基上附加糖的黃酮的制法及根據該制法得到的食品、醫(yī)藥品、化妝品等。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0072] 圖1為說明花色素苷的生物合成途徑的圖。
[0073] 圖2為金屬花色素苷（metalloanthocyanin)結構的概要圖。
[0074] 圖3為來自喜林草的花色素苷（Nemophilin)的結構式。
[0075] 圖4為來自喜林草的黃酮（丙二酰芹菜素4'，7-二葡萄糖苷）的結構式。
[0076] 圖5為來自串紅的花色素苷（cyanosalvianin)的結構式。
[0077] 圖6為來自串紅的黃酮（芹菜素4'，7-二葡萄糖苷）的結構式。
[0078] 圖7為使花瓣提取液與芹菜素進行酶反應的液體的高效液相色譜。
[0079] 圖8為說明芹菜素4'，7-二葡萄糖苷的生物合成途徑的圖。
[0080] 圖9為使NmGT8蛋白質溶液與芹菜素進行酶反應的液體的高效液相色譜。
[0081] 圖10為使NmGT8蛋白質溶液與芹菜素7-葡萄糖苷進行酶反應的液體的高效液相色譜。
[0082] 圖11為歸納NmGT8蛋白質與在黃芩素5位上附加糖的酶對各種類黃酮底物的反應性的圖。
[0083] 圖12-1為將NmGT8和NmGT3的氨基酸序列進行比對的比對圖。
[0084] 圖12-2為將NmGT8和NmGT4的氨基酸序列進行比對的比對圖。
[0085] 圖12-3為將NmGT8和NmGT3及NmGT4的氨基酸序列進行比對的比對圖。
[0086] 圖13為將NmGT8與在金魚草的查耳酮4'位上附加糖的酶的氨基酸序列進行比對的比對圖。
[0087] 圖14為將NmGT8與在月季的花色素3位和5位上附加糖的酶的氨基酸序列進行比對的比對圖。
[0088] 圖15為以本發(fā)明的NmGT8與所述諸酶的關系為指標的系統(tǒng)樹。
[0089] 圖16為含有轉入藍豬耳的NmGT8的構建物（pSPB4583)。
[0090] 圖17為含有轉入矮牽牛的NmGT8的構建物（pSPB5424、5428)。
[0091] 圖18為轉入NmGT8的重組矮牽牛的花瓣提取液的高效液相色譜。
[0092] 圖19為轉入了 NmGT8的重組矮牽牛的花瓣提取液（250-1250m/z)的提取正離子色譜圖。
[0093] 圖20為含有轉入康乃馨的NmGT8的構建物（pSPB5433)。
[0094] 圖21為含有轉入月季的NmGT8的構建物（pSPB4577、4578、5437、5440)。
[0095] 圖22為轉入NmGT8的重組月季的花瓣提取液的高效液相色譜。
[0096] 圖23為轉入NmGT8的重組月季的花瓣提取液（250-1250m/z)的提取正離子色譜圖。

【具體實施方式】
[0097] 本發(fā)明涉及一種多核苷酸，其選自以下（a)?（e):
[0098] (a)多核苷酸，其由序列號1的堿基序列組成；
[0099] (b)多核苷酸，其為與由序列號1的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交的多核苷酸，且編碼具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質； [0100] (c)多核苷酸，其編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0101] (d)多核苷酸，其編碼由序列號2的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質；及
[0102] (e)多核苷酸，其編碼具有與序列號2的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列，且具有在黃酮4 '位羥基上轉移糖的活性的蛋白質。
[0103] 本說明書中，用語"多核苷酸"是指DNA或RNA。
[0104] 本說明書中，用語"嚴謹條件"是指使多核苷酸或寡核苷酸與基因組DNA的選擇性且可檢測的特異性結合可進行的條件。嚴謹條件由鹽濃度、有機溶劑（例如，甲酰胺）、溫度及其他公知條件的適當組合來定義。即通過減少鹽濃度、增加有機溶劑濃度或使雜交溫度上升來增加嚴謹性（stringency)。而且，雜交后的洗漆條件也影響嚴謹性。該洗漆條件還由鹽濃度和溫度定義，根據鹽濃度的減少和溫度的上升來增加洗滌的嚴謹性。因此，用語 "嚴謹條件"是指僅在各堿基序列間的"同一性"或"同源性"的程度例如整體平均為約80% 以上，優(yōu)選為約90%以上，更優(yōu)選為約95%以上，進一步優(yōu)選為97%以上，最優(yōu)選為98%以上的具有高同源性的堿基序列間之間進行特異性雜交的條件。作為"嚴謹條件"，例如可列舉溫度為60°C?68°C中，鈉濃度為150?900mM，優(yōu)選為600?900mM，pH6?8的條件，作為具體例，可列舉在5xSSC(750mMNaCl、75mM檸檬酸三鈉）、1% SDS、5xDenhardt溶液50% 甲醛及421：的條件下進行雜交，在0.11350(151111恥(：1、1.51111檸檬酸三鈉）、0.1%305及 55°C的條件下進行洗滌。
[0105] 雜交例如可根據 Current protocols in molecular biology (edited by Frederick M.Ausubel et al.，1987)中所記載的方法等、本領域技術人員公知的方法或依照這些的方法來進行。此外，使用市售的文庫時，可根據附帶的使用說明書中記載的方法進行。作為此種通過雜交而選擇的基因，可來自天然，例如來自植物，也可以來自植物以外。且通過雜交而選擇的基因可以是cDNA，也可以是基因組DNA，還可以是化學合成的DNA。
[0106] 上述"1或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列"是指例如 1?20個，優(yōu)選為1?5個，更優(yōu)選為1?3個任意數量的氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/ 或附加的氨基酸序列。作為基因工程的方法之一的定點誘變法因為是可在特定位置轉入特定突變的方法，所以有用，可根據 Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.，1989 等中記載的方法進行。通過將該突變DNA使用適當的表達體系表達，可得到由1或多個的氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列組成的蛋白質。
[0107] 而且，本發(fā)明所涉及的DNA可根據本領域技術人員公知的方法，例如亞磷酰胺法等化學合成的方法，以植物的核酸試樣為模板，使用基于目的基因的核苷酸序列設計的引物的核酸擴增法等得到。
[0108] 本說明書中，用語"同一性"及"同源性"是指在多肽序列（或氨基酸序列）或多核苷酸序列（或堿基序列）中的2條鏈之間，在構成該鏈的各氨基酸殘基之間或各堿基之間的適合關系中，可確定為同一的量（數），指2個多肽序列或2個多核苷酸序列之間的序列相關性的程度，"同一性"及"同源性"可容易地計算出。已知很多測定2個多核苷酸序列或2個多肽序列間的同源性的方法，用語"同一性"及"同源性"為本領域技術人員所周知（例如，參照 Lesk，A.M. (Ed.) Computational Molecular Biology, Oxford University Press,New York, (1988) ；Smith,D. ff. (Ed.), Biocomputing:Informati cs and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993) ；Grifin, A. M. &Grifin, H. G. (Ed. ), Computer Analysis of Sequence Data:Part I, Human Press, New Jersey, (1994)； von Heinje, G. , Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press,New York, (1987) ；Gribskov, M. &Devereux,J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press，NewYork, (1991)等）。
[0109] 此外，本說明書中所述的"同一性"及"同源性"的數值除了特殊說明的情況以外，可為使用本領域技術人員公知的同源性搜索程序計算出的數值，優(yōu)選為使用Mac Vector應用程序（Version9. 5、Oxford Molecular Ltd.，Oxford，England)的 ClustalW 程序計算出的數值。
[oho] 本發(fā)明的多核苷酸（核酸、基因）為"編碼"所著眼的蛋白質的多核苷酸（核酸、基因）。在此，"編碼"是指使所著眼的蛋白質在具備其活性的狀態(tài)下表達。此外，"編碼"包含將所著眼的蛋白質用連接的結構序列（外顯子）編碼，或介由介導序列（內含子）編碼的兩者的含義。
[0111] 具有與生俱來的喊基序列的基因如以下實施例中記載，例如，通過DNA測序僅的分析而得到。而且，編碼具有經修飾的氨基酸序列的酶的DNA以具有與生俱來的堿基序列的DNA為基礎，可使用常用的定點誘變、PCR法合成。例如，將希望修飾的DNA片段通過與生俱來的cDNA或基因組DNA的限制性內切酶處理而得到，并以此為模板，使用轉入所需突變的引物實施定點誘變、PCR法，得到所需的修飾的DNA片段。其后，將轉入該突變的DNA片段與編碼目的酶的其他部分的DNA片段連接即可。
[0112] 或者，為了得到編碼由縮短了的氨基酸序列組成的酶的DNA，例如，將編碼比目的氨基酸序列長的氨基酸序列，例如編碼全長氨基酸序列的DNA用所需限制性內切酶切割，其結果，所得到的DNA片段不編碼目的氨基酸序列的整體的情況下，合成由不足部分的序列組成的DNA片段，并連接即可。
[0113] 此外，通過使所得到的多核苷酸在使用大腸桿菌及酵母中的基因表達體系表達，并測定酶活性，可確認所得到的多核苷酸編碼具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質。而且，通過使該多核苷酸表達，可得到作為多核苷酸產物的具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質?；蛘呒词故褂糜尚蛄刑?記載的氨基酸序列組成的多肽的抗體，也可獲得具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質，還可使用所涉及的抗體，將編碼來自其他生物的具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的多核苷酸進行克隆。
[0114] 本發(fā)明涉及包含所述多核苷酸的（重組）載體、特別是表達載體，進而涉及由該載體轉化的宿主。
[0115] 作為宿主，可使用原核生物或真核生物。作為原核生物，可使用細菌，例如可使用屬于埃希氏菌屬（Escherichia)的細菌例如大腸桿菌（Escherichia coli)，芽孢桿菌屬 (Bacillus)的微生物例如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)等常用的宿主。作為真核生物，可使用低等真核生物，例如真核微生物，例如作為真菌的酵母或絲狀菌。
[0116] 作為酵母，例如可列舉酵母屬（Saccharomyces)微生物，例如釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)等，此外，作為絲狀菌，可列舉曲霉屬（Aspergillus)微生物，例如米曲霉（Aspergillus oryzae)、黑曲霉（Aspergillus niger)，青霉屬（Penicillium) 微生物。作為宿主，可進一步使用動物細胞或植物細胞，作為動物細胞，可使用小鼠、倉鼠、猴子、人等的細胞系，而且昆蟲細胞，例如蠶細胞、蠶的成蟲其自身也作為宿主使用。
[0117] 本發(fā)明的表達載體依賴于轉入它們的宿主的種類，含有表達調控區(qū)，例如啟動子、終止子及/或復制起點等。作為細菌用表達載體的啟動子，使用常用的啟動子，例如trc啟動子、tac啟動子、lac啟動子等，作為酵母用啟動子，例如可使用3 -磷酸甘油醛脫氫酶啟動子、PH05啟動子等，且作為絲狀菌用啟動子，例如可使用淀粉酶啟動子、trpC啟動子等。此外，作為動物細胞宿主用啟動子，可使用病毒性啟動子，例如SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子等。
[0118] 作為在植物細胞內使多核苷酸組成型表達的啟動子的例子，可列舉花椰菜花葉病毒的35SRNA啟動子、rd29A基因啟動子、rbcS啟動子、mac-1啟動子等。此外，為了進行組織特異性的基因表達，可使用在其組織中特異性表達的基因的啟動子。
[0119] 表達載體的制備可使用限制性內切酶、連接酶等根據通常方法進行。此外，通過表達載體的宿主的轉化也可根據通常方法進行。
[0120] 將通過所述表達載體轉化的宿主進行培養(yǎng)、栽培或使其生長發(fā)育，從培養(yǎng)物或培養(yǎng)基中，根據通常方法，例如通過過濾、離心分離、細胞破碎、凝膠過濾色譜法、離子交換色譜法等回收?純化，可得到目的蛋白質。
[0121] 本說明書中，對于來自喜林草的編碼具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的基因已有記述，但本發(fā)明所涉及的多核苷酸不限于來自喜林草的基因，作為編碼具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的基因的起源，可為植物、動物，也可為微生物，只要具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性，無論起源如何，均可用于植物中花色的改變。
[0122] 本發(fā)明也涉及通過將編碼具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的外源性多核苷酸轉入植物，并使其在該植物內含有而得到的植物或其后代或這些的部分或組織。作為該部分或組織的形態(tài)，可以是切花。使用本發(fā)明所涉及的編碼具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的多核苷酸，可將黃酮4'位糖苷化，或抑制黃酮4'位的糖苷化，其結果可改變植物中的花色。
[0123] 在目前的技術水平下，可利用在植物中轉入多核苷酸，并使該多核苷酸組成型或組織特異性表達的技術。向植物中轉入DNA，可通過本領域技術人員公知的方法，例如農桿菌法、雙兀載體法、電穿孔法、PEG法、基因槍法等進行。
[0124] 作為可轉化的植物的例子，可列舉月季、康乃馨、菊花、金魚草、仙客來、蘭花、洋桔梗、小蒼蘭、非洲菊、唐菖蒲、霞草、長壽花、百合、天竺葵、老鸛草、矮牽牛、藍豬耳、郁金香、紅掌、蝴蝶蘭、稻子、大麥、小麥、菜籽、馬鈴薯、番茄、毛白楊、香蕉、藍桉、番薯、大豆、苜蓿、羽扇豆、玉米、花椰菜、大麗花等，但不限于這些。
[0125] 本發(fā)明涉及使用上述切花的加工品（切花加工品）。在此，作為切花加工品，包含使用該切花的干花瓣、保鮮花、干花、樹脂密封品等，但不限于此。
[0126] 此外，根據本發(fā)明的制造方法制造的在4'位羥基上附加糖的黃酮可用于食品、醫(yī) 藥品、化妝品的制造方法等用途。
[0127] 本發(fā)明中，根據反義法、共抑制法、RNAi法等，可抑制植物內目的基因的表達。抑制目的基因的表達的方法可根據本領域技術人員公知的方法進行，例如可列舉反義 RNA/DNA 技術[Bioscience&industry, 50,322 (1992)、化學，46,681(1991)、 Biotechnology, 9,358 (1992)> Trends in Biotechnology,10,87 (1992)> Trends in Biotechnology, 10, 152(1992)、細胞工程，16, 1463(1997)]、三螺旋（triple helix)技術 [Trends in Biotechnology, 10, 132(1992)]等。例如，基因表達的抑制可使用包含與本發(fā)明的基因的反義鏈同一的核苷酸序列的全部或一部分的單鏈核酸分子進行。此種方法作為反義法而已知。反義法中，通過使具有與希望抑制表達的基因互補的序列的RNA高水平表達，可抑制靶基因的表達。該方法中，可使用包含與本發(fā)明所涉及的多核苷酸（基因）的反義鏈同一的核苷酸序列的全部的單鏈RNA。此外，上述方法中，還可使用包含與本發(fā)明的基因的反義鏈同一的核苷酸序列的一部分的單鏈RNA。此種一部分的單鏈RNA只要是可抑制本發(fā) 明的基因的表達即可，只要是本領域技術人員即可適當設計，但優(yōu)選為與本發(fā)明的基因特異性的物質，其鏈長優(yōu)選為5?100核苷酸，更優(yōu)選為5?50核苷酸，進一步優(yōu)選為10? 20核苷酸。
[0128] 基因表達的抑制可使用與本發(fā)明所涉及的基因的正義鏈同一的核苷酸序列的全部或一部分的單鏈核酸分子進行。即該正義單鏈核酸與上述反義單鏈核酸同樣，可用于本發(fā)明的基因表達的抑制。該方法中，可使用與本發(fā)明的基因的正義鏈同一的核苷酸序列的全部的單鏈RNA進行。此外，上述方法中，還可使用包含與基因的正義鏈同一的核苷酸序列的一部分的單鏈RNA。只要此一部分的單鏈RNA可抑制本發(fā)明的基因的表達即可，只要是本領域技術人員即可適當設計，但優(yōu)選為與本發(fā)明的基因特異性的物質，其鏈長優(yōu)選為5? 100核苷酸，更優(yōu)選為5?50核苷酸，進一步優(yōu)選為10?20核苷酸。
[0129] 而且，基因表達的抑制使用包含與本發(fā)明的基因同一的核苷酸序列的全部或一部分的雙鏈核酸分子進行。例如，通過使用該雙鏈核酸分子，可使被子植物中本發(fā)明的基因的反義或正義單鏈核酸表達。本發(fā)明的雙鏈核酸分子優(yōu)選為DNA，其鏈長及具體的核苷酸序列為與目的單鏈核酸分子的鏈長及核苷酸序列對應的序列。例如，使上述反義單鏈核酸表達時，本發(fā)明的雙鏈核酸分子為含有作為編碼鏈的本發(fā)明的基因的反義鏈的物質。此外，使上述正義單鏈核酸表達時，本發(fā)明的雙鏈核酸分子為含有作為編碼鏈的本發(fā)明的基因的正義鏈的物質。
[0130] 雙鏈核酸分子可使用本領域技術人員公知的方法在植物中表達。例如，通過將包含啟動子、本發(fā)明的雙鏈核酸分子及轉錄終止子等的表達載體轉入目的植物中，并栽培所得到的植物體，可使雙鏈核酸分子表達。向植物中轉入表達載體可根據本領域技術人員公知的方法，例如農桿菌法、雙元載體法、電穿孔法、PEG法、基因槍法等進行。
[0131] 作為使用本發(fā)明的核酸分子的基因表達的抑制法的其他例子，可列舉共抑制法。該方法中，具有本發(fā)明的基因的全核苷酸序列的正義雙鏈DNA被轉入目的植物中。由此，本發(fā)明的正義單鏈RNA表達，并通過該RNA極端抑制該基因的表達（Plant Cell9:1357-1368, 1997)。
[0132] 實施例
[0133] 以下根據實施例具體地說明本發(fā)明。
[0134] [實施例1 :喜林草花瓣中的在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的檢測]
[0135] 將喜林草(Nemophila menziesii)的花瓣按如下定義的發(fā)展階段分開采集，用液氮冷凍，在_80°C冰箱內保存：
[0136] 階段1 :未著色、緊實閉合的花蕾（約2_5mm);
[0137] 階段2 :著色、緊實閉合的花蕾（約2_5mm);
[0138] 階段3 :著色、閉合的花蕾、萼片正要張開的花蕾（約5-10mm);
[0139] 階段4 :花瓣正要張開的花蕾（約10_15mm)
[0140] 階段5 :完全開放的花
[0141] <喜林草花瓣提取液的制備>
[0142] 期待在生物合成花色素苷前的花瓣的階段1和2中檢測出黃酮糖基轉移酶的活性。因此，使用階段1和2的花瓣，制備花瓣提取液。將500mg花瓣樣品（_80°C下保存的階段1和2的樣品各250mg)在液氮中冷卻，同時用研缽磨碎，溶解在1. 5mL的提取緩沖液 (組成；磷酸鉀緩沖液（pH7. 5) :100mM、二硫蘇糖醇（DTT) :lmM、聚乙烯吡咯烷酮40 :50mg/ mL、鹿糖：100mg/mL)中。將所得到的蛋白質溶液進行離心分離（10000rpm、4°C、10分鐘），在回收的上清中加入硫酸銨至30%的飽和濃度。4°C下攪拌1小時后，離心分離（lOOOOrpm、 4°C、10分鐘）回收上清。在所得到的上清中添加硫酸銨至飽和濃度70%，4°C下攪拌1小時后，離心分離（10000rpm、4°C、10分鐘），得到沉淀。將該沉淀溶解在500 μ 1的洗脫緩沖液 (組成；!'1^!1(：1(?!17.5):2.51111、01'1':11111、脒苯基甲磺酰氟鹽酸細10〇 :1(^厘）中，使用 NAP_5Colums SepHadex G-25DNA Grade (GE Healthcare 公司）進行色譜柱純化，以除去硫酸銨。將該液作為"花瓣提取液"。離心分離中，使用Avanti HP-26XP(轉子：JA-2)(BECKMAN COULTER 公司）。
[0143] <酶活性測定>
[0144] 混合40 μ 1的花瓣提取液、20 μ 1的5mM UDP-葡萄糖、20 μ 1的1M TrisHCl (ρΗ7· 5)、1 μ 1的500ng/ μ 1芹菜素，將在冰上用水調整至200 μ 1的反應液在30°C 下保持1小時。其后，加入200 μ 1的停止緩沖液（含有0· 1 % TFA的90%乙腈水溶液）使反應停止，將反應液用高效液相色譜法（Prominence (島津制作所）進行分析。檢測器使用島津 PDA SPD-M10AVP 在 330nm 處檢測黃酮。色譜柱使用 Shim-Pack 0DS150mm*4. 6mm(島津制作所）。洗脫使用A液（0. 1 % TFA水溶液）和B液（含有0. 1 % TFA的90%乙腈水溶液）。進行由兩者的8 :2的混合液到3 :7的混合液的10分鐘直線濃度梯度洗脫和在此之后5分鐘的由3:7的混合液的洗脫。流速為0.6mL/分鐘。作為對照，使用在相同條件下使用將花瓣提取液在l〇〇°C下熱處理20分鐘的花瓣提取液進行酶反應的反應液。
[0145] 其結果，不僅生物合成了與芹菜素4'，7-二葡萄糖苷純品、芹菜素7-葡萄糖苷標準品表示相同的保留時間?最大吸收的黃酮，還生物合成了與芹菜素7-葡萄糖苷表示相近的保留時間的黃酮（參照圖7)。不添加 UDP-葡萄糖而進行酶反應時，未生物合成任何產物。
[0146] [實施例2 :芹菜素4' -葡萄糖苷的保留時間?最大吸收的確定]
[0147] 考慮到喜林草花瓣中的芹菜素4'，7-二葡萄糖苷的生物合成途徑時，在生物合成芹菜素4'，7-二葡萄糖苷的過程中，芹菜素4'-葡萄糖苷和芹菜素7-葡萄糖苷應作為中間產物生物合成（參照圖8)。由此，實施例1中檢測出的與芹菜素7-葡萄糖苷表示相近的保留時間的黃酮可判斷為芹菜素4' -葡萄糖苷（參照圖7)?？纱_定芹菜素4' -葡萄糖苷的保留時間?最大吸收。
[0148] 由上述結果表明，喜林草花瓣中存在具有在依賴UDP-葡萄糖的黃酮4'位和7位羥基上轉移糖的活性的蛋白質。有關4'位和7位羥基的糖苷化，認為有1個酶進行兩者的糖苷化的可能性，和由各自不同的酶進行4'位和7位羥基的糖苷化的可能性。
[0149] [實施例3 :編碼具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的基因的候選基因的獲得]
[0150] <總1?隱的分離>
[0151] 使用Plant RNAeasy Kit(QIAGEN公司），根據制造者推薦的方法，從喜林草的階段 1和2的花瓣中分離總RNA。
[0152] <來自喜林草的花瓣的cDNA的表達分析>
[0153] 進行來自30 μ g喜林草的花瓣的總RNA的逆轉錄反應后，制備均一化cDNA文庫。將所制備的文庫通過乳液PCR，進行每個克隆的擴增后，通過基因組測序儀FLX (Roche Diagnostics Japan株式會社）進行堿基序列的確定。此外，將所得到堿基序列數據翻譯成氨基酸序列，提取與龍膽的花色素苷3' -糖基轉移酶的氨基酸序列顯示同源性的序列。裝配這些序列，得到編碼糖基轉移酶的候選基因。
[0154] [實施例4 :編碼具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的基因的候選基因的全長cDNA序列的獲得]
[0155] 實施例3中得到25種糖基轉移酶基因的序列。對于其中10個基因（NmGTO?9)，進行了用于獲得全長cDNA序列的實驗。
[0156] 全長cDNA序列的獲得使用GeneRacer Kit(invitrogen公司），根據制造者推薦的方法進行。從實施例3中得到的cDNA部分序列中選擇其克隆的特異性區(qū)域，以該區(qū)域的序列為基礎設計RACE用引物，通過RACE PCR得到5'，3'末端序列。以該序列為基礎，設計用于擴增全長cDNA序列的引物，以喜林草cDNA為模板，使用KOD-plus polymerase (TOYOBO公司），根據制造者推薦的方法，以50 μ 1進行PCR反應（94°C保持2分鐘，進行30個94°C 15 秒、55°C 30秒、68°C 2分鐘的循環(huán)后，4°C下保持）。喜林草的cDNA使用SuperScriptll Reverse Transcriptase(invitrogen公司），以實施例2中分離的總RNA為模板，根據制造者推薦的方法合成。引物設計成可在大腸桿菌表達載體pET15b(Novagen公司）上插入 NmGTO?9基因，可在全長cDNA的兩端包含限制性內切酶位點。使用該PCR生成物，使用 Zero Blunt Τ0Ρ0 PCR Cloning kit for sequencing(invitrogen)，根據制造者推薦的方法，獲得包含NmGT基因全長的質粒（pTOPO-NmGTO?9)。分析插入質粒的堿基序列，從編碼具有在黃酮4'位轉移糖的活性的蛋白質的基因的候選基因（NmGTO?9)中獲得全長cDNA序列（NmGT8 :序列號1)。
[0157] [實施例5 :具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質候選的酶活性測定實驗（使用粗酶的情況）]
[0158] <大腸桿菌表達構建物的制備>
[0159] 分別用3 μ g相當于pTOPO-NmGTO?9的限制性內切酶處理，回收所得到的約 1. 5kb的DNA片段。2 μ g的載體pET15b也用限制性內切酶處理，與所得到的DNA片段連接，制備大腸桿菌表達構建物（pET-NmGTO?9)。
[0160] <糖基轉移酶在大腸桿菌中的表達>
[0161] 將 pET-NmGTO ?9 使用 One Shot BL21 (DE3) (invitorgen)，根據制造者推薦的方法，轉入大腸桿菌株BL2,獲得轉化大腸桿菌。將該大腸桿菌使用Overnight Express Autoinduction Systeml (Novagen公司），根據制造者推薦的方法培養(yǎng)。在所制備的2mL培養(yǎng)液中，將轉化大腸桿菌在37°C下培養(yǎng)至0D600值為0. 5 (約4小時）。將該大腸桿菌液作為預培養(yǎng)液，加入到50mL的培養(yǎng)液中，27°C下主培養(yǎng)過夜。
[0162] 將主培養(yǎng)過夜的大腸桿菌液進行離心分離（3000rpm、4°C、15分鐘），將集菌后的菌體懸浮于5mL Sonic緩沖液（組成；TrisHCl(pH7. 0) :2. 5mM、二硫蘇糖醇（DTT) :lmM、脒苯基甲磺酰氟鹽酸（APMSF) :10 μ Μ)中，通過超聲波處理粉碎大腸桿菌后，進行離心分離（15000rpm、4°C、10分鐘），回收上清。將其上清作為粗酶液。離心分離使用Avanti HP-26XP (轉子 JA-2) (BECKMAN COULTER 公司）。
[0163] <酶活性測定>
[0164] 混合 80 μ 1 的粗酶液、20 μ 1 的 5mM UDP-葡萄糖、20 μ 1 的 1M TrisHCl (ρΗ7· 5)、 1 μ 1的500ng/μ 1的芹菜素，將在冰上用水調整至200 μ 1的反應液在30°C下保持30分鐘。其后，加入200 μ 1的停止緩沖液（含有0. 1 % TFA的90%乙腈水溶液）使反應停止，反應液用高效液相色譜法（Prominence (島津制作所））進行分析。檢測器使用島津PDA SPD-M10AVP檢測330nm處的黃酮。色譜柱使用Shim-Pack 0DS150mm*4. 6mm (島津制作所）。洗脫使用A液（0. 1 % TFA水溶液）和B液（含有0. 1 % TFA的90 %乙腈水溶液）。進行由兩者的8 :2的混合液到3 :7的混合液的10分鐘直線濃度梯度洗脫和在此之后5分鐘的由 3:7的混合液的洗脫。流速為0.6ml/分鐘。作為對照，使用在相同條件下使用轉入不插入插入片段的PET載體的大腸桿菌的粗酶液而進行酶反應的反應液。
[0165] 其結果，關于NmGT8,可看出底物以外的峰。
[0166] 實施例6以后，對NmGT8(序列號1)加以記載。
[0167] [實施例6 :具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的酶活性測定實驗 (純化附加了 His-Tag的蛋白質的情況）]
[0168] <糖基轉移酶在大腸桿菌中的表達和蛋白質純化>
[0169] 將轉入實施例5中記載的pET_NmGT8的大腸桿菌株BL2使用Overnight Express Autoinduction Systeml (Novagen公司），根據制造者推薦的方法進行培養(yǎng)。在所制備的8mL 培養(yǎng)液中，將在37°C下培養(yǎng)轉化大腸桿菌至0D600值為0. 5(約4小時）。將該大腸桿菌液作為預培養(yǎng)液，加入到200ml的培養(yǎng)液中，25°C下主培養(yǎng)過夜。
[0170] 將主培養(yǎng)過夜的大腸桿菌液進行離心分離（1000Xg、4°C、10分鐘），將集菌的菌體懸浮于20ml的提取液（組成；緩沖液（KC1 :300mM、KH2P04 :50mM、咪唑：5mM) (PH8.0)、脒苯基甲磺酰氟鹽酸（APMSF) :10 μ Μ)中，通過超聲波處理粉碎大腸桿菌后，離心分離（1400 X g、4 °C、20分鐘），回收上清。將該上清通過0. 45 μ m過濾器，使用 Pr〇finia(Bi〇-Rad)，根據制造者推薦的方法，進行His-Tag純化。將所得到的純化蛋白質溶液使用 centrifugal Filters (Ultracel-lOK) (Amicon Ultra 公司）進行離心分離 (7500X g、4°C、15分鐘），將其所濃縮的蛋白質溶液作為"NmGT8蛋白質溶液"。離心分離使用 Avanti HP-26XP (轉子 JA-2) (BECKMAN COULTER 公司）。
[0171] <酶活性測定>
[0172] 混合10μ 1的蛋白質溶液、2μ 1的50mM UDP-葡萄糖、10μ 1的1M TrisHCl (ρΗ7. 5)、5 μ 1的ImM芹菜素，將在冰上用水調整至100 μ 1的反應液在30°C下保持 20分鐘。其后，加入100 μ 1的停止緩沖液（含有〇· 1 % TFA的90 %乙腈水溶液）使反應停止，將反應液用高效液相色譜法（Prominence(島津制作所））進行分析。檢測器使用島津 PDA SPD-M10AVP檢測330nm處的黃酮。色譜柱使用Shim-Pack 0DS150mm*4. 6mm (島津制作所）。洗脫使用A液（0. 1 % TFA水溶液）和B液（含有0. 1 % TFA的90 %甲醇水溶液）。進行由兩者的8 :2的混合液到3 :7的混合液的10分鐘直線濃度梯度洗脫和在此之后6分鐘的由3 :7的混合液的洗脫。流速為0. 6mL/分鐘。
[0173] 其結果，生物合成與芹菜素4' -葡萄糖苷純品表示相同的保留時間?最大吸收的黃酮（參照圖9)。將底物替換成其他的黃酮即木犀草素，在相同反應條件下進行酶反應時，生物合成了木犀草素4' -葡萄糖苷（參照圖11)。另一方面，將底物替換成ImM的芹菜素 7_葡萄糖苷，在相同反應條件下進行酶反應時，未生物合成芹菜素4'，7-二葡萄糖苷（參照圖10)。同樣，將底物替換成ImM的木犀草素7-葡萄糖苷，在相同反應條件下進行酶反應時，也未生物合成木犀草素4'，7_二葡萄糖苷（參照圖11)。由此可表明，與芹菜素、木犀草素7位的糖苷化相比，NmGT8蛋白質先進行4'位的糖苷化（參照圖8)。而且，在分析圖 11中記載的各種類黃酮化合物及相對于芐胍的反應性時，表明NmGT8蛋白質的底物特異性高，可將如芹菜素、木犀草素的黃酮4'位選擇性糖苷化（參照圖11)。
[0174] 另外，還報道了來自彩虹菊的糖基轉移酶基因（Dbs5GT)原本為在芐胍5位羥基上轉移葡萄糖的基因，但在體外試驗（in vitro)中顯示出在類黃酮4'位或7位的任一個輕基上轉移葡萄糖的活性。表明該來自彩虹菊的糖基轉移酶在相對于類黃酮化合物、芐胍的反應性上，與本發(fā)明的NmGT8蛋白質大不相同（參照圖11)。
[0175] NmGT8和NmGT3之間、及NmGT8和NmGT4之間的氨基酸序列的同一性分別為32 %及 32% (參照圖 12-1 ?12-3)。該分析中，使用 MacVector 應用程序（Versionll.02、0xford MolecularLtd.，0xfor，dEngland)的ClustalW程序。在已鑒定的糖基轉移酶中，與NmGT8 同一'I"生最高的氨基酸序列為在月季花色素的3位和5位上附加糖的酶（GenBank accession No. Q4R119)，氨基酸序列的同一性為52% (參照圖14)。其次，與NmGT8同一性高的氨基酸序列為在金魚草的查耳酮4'位上附加糖的酶（如PCT/JP2004/019461中記載），同一性為 51% (參照圖13)。
[0176] 此外，圖15表示以本發(fā)明的NmGT8與所述諸酶的關系為指標的系統(tǒng)樹。
[0177] [實施例7 :編碼具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的基因在藍豬耳中的表達]
[0178] 為了確認本發(fā)明的NmGT8基因是否在植物內翻譯具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質，構建用于表達NmGT8的雙元載體pSPB4583,轉入藍豬耳（Summer Wave)。所轉入的構建物的詳細情況如以下所示（參照圖16)。
[0179] <構建物的制備>
[0180] pSPB4583 以植物轉入用雙兀載體 pBINPLUS (vanEngel et al.，Transgenic ReSerch4, p288)為基本骨架，包含在花椰菜花葉病毒35S啟動子上游具有重復2次的增強子序列的 E1235S 啟動子（Mitsuhara et al.，（1996)Plant Cell PHysiol. 37, p49)、全長 cDNANmGT8 和 mas 終止子。
[0181] 〈基因表達分析>
[0182] 在含有卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上形成不定芽，馴化可看見發(fā)根的個體，使用各個重組藍豬耳的萼片未開裂的花蕾的花瓣，進行基因表達分析?？俁NA分離與實施例3中記載的方法同樣，cDNA合成與實施例4中記載的方法同樣進行。逆轉錄PCR反應以cDNA為模板，使用ExTaq polymarase (Takara公司），根據制造者推薦的方法，以30 μ 1進行（94°C 下保持2分鐘，進行25個94°C 1分鐘、55°C 1分鐘、72°C下保持2分鐘的循環(huán)后，4°C下保持）。設計各個全長cDNA特異性擴增的引物。其結果，可確認出藍豬耳中的NmGT8的轉錄。
[0183] [實施例8 :編碼具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的基因在矮牽牛中的表達]
[0184] 構建用于表達NmGT8的雙元載體pSPB5424、5428,轉入矮牽牛（Surfinia Bouquet red)。矮牽牛因原本不生物合成黃酮，所以，將藍豬耳黃酮合成酶（如PCT/JP2008/061600 中記載，序列號5) -同轉入，評價在矮牽牛中NmGT8是否具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性。所轉入的構建物的詳細情況如以下所示（參照圖17)。
[0185] <構建物的制備>
[0186] pSPB5424以pBINPLUS為基本骨架，包含3個表達盒（1.E1235S啟動子、全長cDNA 三色堇F3' 5' Η(如PCT/JP2004/011958中記載，序列號3)和HSP終止子（Plant Cell Physiology (2010) 51，328-332)，2. E1235S啟動子、全長cDNA藍豬耳黃酮合成酶和HSP終止子，3. E1235S啟動子、全長cDNANmGT8和HSP終止子）。
[0187] pSPB5428以pBINPLUS為基本骨架，包含2個表達盒（1.E1235S啟動子、全長cDNA 藍豬耳黃酮合成酶和HSP終止子，2. E1235S啟動子、全長cDNANmGT8和HSP終止子）。
[0188] 〈基因表達分析>
[0189] 在含有卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上形成不定芽，馴化可看見發(fā)根的個體，使用各個重組矮牽牛中完全開放的花的花瓣，與實施例7中記載的方法同樣進行基因表達分析。其結果，可確認出矮牽牛中的NmGT8的轉錄。
[0190] <花瓣色素分析>
[0191] 對于可確認出有關全長cDNA藍豬耳黃酮合成酶與全長cDNANmGT8的轉錄產物的系統(tǒng)，進行花瓣的色素分析。將〇. 2g完全開放的花的花瓣冷凍干燥24小時以上，用刮板 (spatula)細細敲碎，加入4mL提取緩沖液（組成；含有(λ 1 % TFA的50%乙腈水溶液），超聲波下處理20分鐘。將其花瓣提取液用高效液相色譜法（Prominence (島津制作所））進行分析。分析用與實施例5中記載的條件同樣的條件進行。作為對照，對未轉入基因的非重組矮牽牛與僅轉入藍豬耳黃酮合成酶而生物合成黃酮的重組矮牽牛也同樣進行分析（圖 18)。而且，將稀釋50倍的花瓣提取液用液相色譜-串聯質譜（島津制作所）進行分析。檢測器使用島津 LCMS-IF-T0F，用 433. 1057(〔Api-Glc+H〕+)和 449. 1084(〔Lut-Glc+H〕+)檢測。色譜柱使用Inertsil 0DS-4(250*4. 6mm、5 μ m)(島津制作所）。洗脫使用A液（0· 1% 甲酸水溶液）和B液（含有0. 1 %甲酸的90%乙腈水溶液）。進行從兩者的9 :1的混合液到11 :9的混合液的35分鐘直線濃度梯度洗脫及從11 :9的混合液到0 :10的混合液的10 分鐘直線濃度梯度洗脫和在此之后的5分鐘由0 :10的混合液的洗脫。流速為0. 6mL/分鐘 (圖 19)。
[0192] 其結果，檢測轉入黃酮合成酶和NmGT8的重組矮牽牛中的芹菜素4' -葡萄糖苷和木犀草素4'-葡萄糖苷（圖18)，可知黃酮4'-葡萄糖苷占生物合成的黃酮的95. 6%。還可知剩余的4. 4%為由在黃酮7位轉移糖的矮牽牛的內在活性而生物合成的黃酮7-葡萄糖苷（圖19)。另一方面，可知在非重組矮牽牛中未檢測出黃酮，在僅轉入藍豬耳黃酮合成酶的重組矮牽牛中，黃酮7-葡萄糖苷占生物合成的黃酮的82. 8%。由此可表明，與具有矮牽牛內源性的在黃酮7位轉移糖的活性的蛋白質相比，NmGT8為優(yōu)先發(fā)揮功能的具有在黃酮4'位轉移糖的活性的蛋白質。通過利用NmGT8,可在矮牽牛內高效生物合成黃酮4' -葡萄糖苷。
[0193] [實施例9 :編碼具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的基因在康乃馨中的表達]
[0194] 構建用于使NmGT8表達的雙元載體pSPB5433,轉入到康乃馨（Cream Cinderella) 中。因康乃馨原本不生物合成黃酮，所以將藍豬耳黃酮合成酶一同轉入，評價在康乃馨中 NmGT8是否具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性。所轉入的構建物的詳細情況如以下所示 (參照圖20)。
[0195] pSPB5433 以植物轉入用雙元載體 pWTT2132(DNA Plant Technolo gies，USA = DNAP)為基本骨架，包含4個表達盒（1.金魚草查耳酮合成酶啟動子（如PCT/AU94/00265 中記載）、全長cDNA三色堇F3' 5' Η和H SP終止子，2.金魚草查耳酮合成酶啟動子、全長cDNA藍豬耳黃酮合成酶和HSP終止子，3.康乃馨花色素苷合成酶啟動子（如PCT/ AU/2009/001659中記載）、全長cDNANmGT8和HSP終止子，4.康乃馨花色素苷合成酶啟動子、全長cDNANmGT3 (日本特愿2011-006317)和HSP終止子）。
[0196] [實施例10 :編碼具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的基因在月季中的表達]
[0197] 構建用于表達NmGT8的雙元載體pSPB4577、4578、5437、5440,轉入到月季 (Noblesse、Ritapahyumera)中。因月季原本不生物合成黃酮，所以將藍豬耳黃酮合成酶一同轉入，評價在月季中NmGT8是否具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性。所轉入的構建物的詳細情況如以下所示（參照圖21)。
[0198] pSPB4577以pBINPLUS為基本骨架，包含3個表達盒（1.E1235S啟動子、全長cDNA 三色堇F3' 5' Η和mas終止子，2. E1235S啟動子、全長cDNA藍豬耳黃酮合成酶和mas終止子，3. E1235S啟動子、全長cDNANmGT8和mas終止子）。
[0199] PSPB4578以pBINPLUS為基本骨架，包含3個表達盒（1.紫蘇花色素苷3-?；?轉移酶啟動子（如PCT/JP2010/053909中記載）、全長cDNA三色堇F3' 5' Η和mas終止子，2. E1235S啟動子、全長cDNA藍豬耳黃酮合成酶和mas終止子，3. E1235S啟動子、全長 cDNANmGT8和mas終止子）。[0085]pSPB5437以pBINPLUS為基本骨架，包含5個表達盒 (1. E1235S啟動子、全長cDNA三色堇F3' 5' Η和HSP終止子，2.紫蘇花色素苷3-?；D移染色體基因（如PCT/JP2010/053886中記載，參照序列號7)，3. E1235S啟動子、全長cDNA藍豬耳黃酮合成酶和HSP終止子，4. E1235S啟動子、全長cDNANmGT8和HSP終止子，5. E1235S 啟動子、全長cDNANmGT3和HSP終止子）。
[0200] pSPB5440以pBINPLUS為基本骨架，包含5個表達盒（1.E1235S啟動子、全長cDNA 三色堇F3' 5' Η和HSP終止子，2. E1235S啟動子、cDNA薰衣草花色素苷3-?；D移酶（如 PCT/JP1996/000348中記載，參照序列8)，3. E1235S啟動子、全長cDNA藍豬耳黃酮合成酶和HSP終止子，4. E1235S啟動子、全長cDNANmGT8和HSP終止子，5. E1235S啟動子、全長 cDNANmGT3 和 HSP 終止子）。
[0201] 〈基因表達分析>
[0202] 在含有卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上形成不定芽，馴化可看見發(fā)根的個體，使用各個重組月季的完全開放的花的花瓣，與實施例7中記載的方法同樣進行基因表達分析。其結果，可確認出月季中的NmGT8的轉錄。
[0203] <花瓣色素分析>
[0204] 對于確認出有關全長cDNA藍豬耳黃酮合成酶和全長cDNANmGT8的轉錄產物的系統(tǒng)，進行花瓣的色素分析。將〇. 2g完全開放的花的花瓣冷凍干燥24小時以上，用刮板 (spatula)細細敲碎，加入4mL提取緩沖液（組成；含有(λ 1 % TFA的50%乙腈水溶液），超聲波下處理20分鐘。其花瓣提取液用高效液相色譜法（Prominence (島津制作所））進行分析。分析用與實施例5中記載的條件同樣的條件進行。作為對照，對未轉入基因的非重組月季也同樣進行分析（圖22)。將稀釋50倍的花瓣提取液用液相色譜-串聯質譜（島津制作所）進行分析。檢測器使用島津"1^-正-1'0?，用433.1057(〔4?丨-61〇+扣+)和 449. 1084(〔Lut-Glc+H〕+)檢測。色譜柱使用 Inertsil 0DS_4(250*4. 6πιπι、5μηι)(島津制作所）。洗脫使用Α液（0. 1 %甲酸水溶液）和Β液（含有0. 1 %甲酸的90%乙腈水溶液）。進行從兩者的9 :1的混合液到11 :9的混合液的35分鐘直線濃度梯度洗脫及從11 :9的混合液到0 :10的混合液的10分鐘直線濃度梯度洗脫和在此之后的5分鐘由0 :10的混合液的洗脫。流速為〇· 6ml/分鐘（圖23)。
[0205] 其結果，檢測出轉入了黃酮合成酶和NmGT8的重組月季中的芹菜素4' -葡萄糖苷和木犀草素4' -葡萄糖苷（圖22)，可知黃酮4' -葡萄糖苷占生物合成的黃酮的97.0%。還可知剩余的3. 0%為通過在黃酮7位轉移糖的月季內在活性而生物合成的黃酮7-葡萄糖苷（圖23)。另一方面，非重組月季中未檢測出黃酮。由此可表明，與具有月季內源性的在黃酮7位轉移糖的活性的蛋白質相比，NmGT8為優(yōu)先發(fā)揮功能的具有在黃酮4'位轉移糖的活性的蛋白質。通過利用NmGT8,可在月季內高效生物合成黃酮4' -葡萄糖苷。
[0206] 本發(fā)明中，首次鑒定了編碼具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的多核苷酸。通過使本發(fā)明的多核苷酸在適當的宿主細胞內表達，可制造具有在黃酮4'位羥基上特異性轉移糖的活性的蛋白質。根據本發(fā)明，通過使具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質在植物內組成型或組織特異性表達，可用于花色的改變。此外，通過本發(fā)明，也可提供在4'位羥基上附加糖的黃酮的制法及根據該制法得到的食品、醫(yī)藥品、化妝品等。
[0001] 序列表（SEQUENCE LISTING) <110〉三得利控股株式會社（Suirtory丨丨oldings Co., Ltd.) <120〉新型糖基轉移騰基因及其使用（Novel glycotransferase and use thereof) <130> SP2012-013KAA880-PCT derived from from 1114578) <150〉 JP 2012-007105 <151〉2012-1-17 <160〉 13 <170〉 Patent丨n version 3,5 <210> 1 <211> 1425 <212> DNA <213〉喜林草（Nemophilamenziesii) <220> <221> CDS <222〉(1).. (1425) <223> NmGTS <^400> 1 atg gag aaa aaa act att att ctg tat ccc tct oca ggc ata ggt cac 48
[0002] Met Glu Lys Lys Thr lie lie Leti Tyr Pro Ser Pro Gly lie Gly His 15 10 15 tta gtt tcc atg gtt gag ctt get aag etc att ett aat cgt gaa cca 96 Leu Val Ser Met Val Glu Leu Ala Lys Leu lie Leu Asn Arg Glu Pro 20 25 30 tea tac tcc ate att atx ttt att tet tea gca cca Lac tet act ggc 144 Ser Tyr Ser lie lie lie Phe Me Ser Ser Ala Pro Tyr Ser Thr Gly 35 40 45 tea agt gcc cct tat att age cat gtt tea gcc acc aca tea ggc ate 192 Ser Ser Ala Pro Tyr lie Ser His Val Ser Ala Thr Thr Ser Gly lie 50 55 60 tcc ttc cac cac etc cot gtc etc gtc ctt ccc ccc aac acc ttc age 240 Ser Phe His His Leu Pro Val Leu Val Leu Pro Pro Asn Thr Phe Ser 65 70 75 80 tcc ttc gaa gaa ata gca tat aaa att cct caa ctt aac aat ccc aat 288 Ser Phe Glu Glu lie Ala Tyr Lys lie Pro Gin L^u Asn Asn Pro Asn 85 90 95 tta aaa eta gcc ctt caa aca ate tcc aaa gaa tea agt gat etc aaa 336 Leu Lys Leu Ala Leu Gin Thr Ile Ser Lys Glu Ser Ser Asp Leu Lys 100 105 110 gcc ttc ate ata gac ttc ttc tgc act get gca gtt gaa gtc tet tea 384
[0003] Ala Phe Me lie Asp Phe Phe Cys Thr Ala Ala Val Glu Val Ser Ser 115 120 125 aac ctt gaa att cct acc tat ttc ttc ttt aca tct ggt tct tct get 432 Asn Leu Glu Me Pro Thr Tyr Phe Phe Phe Thr Ser Gly Ser Ser Ala 130 135 140 atg tgt caa ttc eta tac ctt cca act ctt cat gaa acc ata acc caa 480 Met Cys Gin Phe Leu Tyr Leu Pro Thr Leu His Glu Thr Ile Thr Gin 145 150 155 160 aaa gac ttg caa gat cct. aac act tac gtt cac att cca ggt att cca 528 Lys Asp Leu Gin Asp Pro Asn Thr Tyr Val His lie Pro Gly lie Pro 165 170 175 cct ate cat tct tta gaa ttg cct aag gtt tta tcc aat agg agt acc 576 Pro lie His Ser Leu Asp Leu Pro Lys Val Leu Ser Asn Arg Ser Thr 180 185 190 gtg tta tat aaa gag ctt ata aac act gca aac cag atg gca aag tgt 624 Val Leu Tyr Lys Glu Leu lie Asr Thr Ala Asn Gin Met Ala Lys Cys 195 200 205 tct gga ate ttg ata aac gca ttt gaa aca ctt gaa cca aaa get gtc 672 Ser Gly Ile Leu Ile Asn Ala Phe Glu Thr Leu Glu Pro Lys Ala Val 210 215 220 aaa gca tta aaa gaa ggt tta tgc acc cct ggt atg cca act cca cct 720
[0004] Lys Ala Leu Lys Glu Gly Leu Cys Thr Pro Gly Met Pro Thr Pro Pro 225 230 235 240 gtt tat tgt ate gga ccg ett ate get age ggt gat aaa gga aat gtc 768 Val Tyr Cys Me Gly Pro Leu lie Ala Ser Gly Asp Lys Gly Asn Val 245 250 255 aat gat get cat ggg cat gag att Ua act tgg tta aac tet caa cct 816 Asn Asp Ala His Gly His Glu Me Leu Thr Trp Leu Asn Ser Gin Pro 260 265 270 agt aaa agt gtt gtg ttt eta tgc ttt ggt agt tta ggt act ttt aag 864 Ser Lys Ser Val Val Phe Leu Cys Phe Gly Ser Leu Gly Thr Phe Lys 275 280 285 gaa gat cag ttg aag gaa att get ata ggg ttg gaa aat agt ggc cat 912 Glu Asp Gin Leu Lys Qlu Me Ala Me Gly Leu Glu Asn Ser Gly His 290 295 3U0 agg ttt tta tgg gta atg aaa agt ccc cct att gat gac aaa acc aag 960 Arg Phe Leu Trp Val Met Lys Ser Pro Pro He Asp Asp Lys Thr Lys 305 310 315 320 cgt ttc tta cca cca cca gag cca gat ttt aat gta tta ttg cct gaa 1008 Arg Phe Leu Pro Pro Pro Glu Pro Asp Phe Asn Val Leu Leu Pro Glu 325 330 335 ggt ttt ttg gag aga act aaa gaa aga gga gtt att gtg aag tea tgg 1056
[0005] Gly Phe Leu Glu Arg Thr Lys Glu Arg Gly Val Ile Val Lys Ser Trp 340 345 350 gcg cct caa ttg get ata ttg aat cat gat gca ata ggc gga ttt gtt 1104 Aia Pro Gin Leu Ala Me Leu Asn His Asp Ala Me Gly Gly Phe Val 355 360 365 act cat igz ggt tgg aac tea gtt Ug gaa get att Lgt ggt ggt gtg 1152 Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Val Leu Glu Ala Ile Cys Gly Gly Val 370 375 380 cca atg tta gca tgg oca tta tat get gag caa agg gtg aat aga gta 1200 Pro Met Leu Ala Trp Pro Leu Tyr Ala Glu Gin Arg Val Asn Arg Val 385 390 395 400 tgt atg gtg gaa gag atg aag gtg gcg ctg cca ttg gag gag tet gta 1248 Cys Met Val Glu Glu Met Lys Val Ala Leu Pro Leu Qlu Glu Ser Val 405 410 415 gat ggg ttt gta atg gca teg gag att gag aaa aga gtt aag gaa ttg l29o Asp Gly Phe Val Met Ala Ser Glu lie Glu Lys Arg Val Lys Glu Leu 420 425 430 gtg gat tat gag agt agt gaa gca att aga gat caa gtt aag ata atg 1344 Val Asp Tyr Glu Ser Ser Glu Ala lie Arg Asp Gin Val Lys lie Met 435 440 445 agt gaa aaa get aaa act gca gtt gca gtt agt gga tea tcc cat gat 1392
[0006] Ser Glu Lys Ala Lys Thr Ala Val Ala Val Ser Gly Ser Ser His Asp 450 455 460 gca ttg acc aaa eta ctg gat ggt tgg aaa tag 142b Aia Leu Thr Lys Leu Leu Asp Gly Trp Lys 465 470 <210> 2 <2I1> 474 <2I2> PRT 〈213> 喜林草（Nemophilamenziesii) <ACO> 2 Met Glu Lys Lys Thr lie lie Leu Tyr Pro Ser Pro Gly lie Gly His 15 10 15 Leu Val Ser Met Val Glu Leu Ala Lys Leu lie Leu Asn Arg Glu Pro 20 30 Ser Tyr Ser Me lie lie Phe lie Ser Ser Ala Pro Tyr Ser Thr Gly 35 40 45 Ser Ser Ala Pro Tyr Ile Ser His Val Ser Ala Thr Thr Ser Gly Me
[0007] 50 55 60 Ser Phe His His Leu Pro Val Leu Val Leu Pro Pro Asn Thr Phe Ser 65 70 75 80 Ser Phe Glu Glu lie Ala Tyr Lys Me Pro Gin Leu Asn Asn Pro Asn 85 90 95 Leu Lys Leu Ala Leu Gin Thr lie Ser Lys Glu Ser Ser Asp Leu Lys 100 105 110 Ala Phe Me lie Asp Phe Phe Cys Thr Ala Ala Val Glu Val Ser Ser 115 120 125 Asn Leu Glu Me Pro Thr Tyr Phe Phe Phe Thr Ser Gly Ser Ser Ala 130 135 140 Met Cys Gin Phe Leu Tyr Leu Pro Thr Leu His Glu Thr Ile Thr Gin 145 150 155 160 Lys Asp Leu Gin Asp Pro Asn Thr Tyr Val His lie Pro Gly lie Pro
[0008] 165 170 175 Pro lie His Ser Leu Asp Leu Pro Lys Val Leu Ser Asn Arg Ser Thr 180 185 190 Val Leu Tyr Lys Glu Leu lie Asn Thr Ala Asn Gin Met Ala Lys Cys 195 200 205 Ser Gly Me Leu lie Asn Ala Phe Glu Thr Leu Glu Pro Lys Ala Val 210 215 220 Lys Ala Leu Lys Glu Gly Leu Cys Thr Pro Gly Met Pro Thr Pro Pro 225 230 235 240 Val Tyr Cys Me Gly Pro Leu lie Ala Ser Gly Asp Lys Gly Asn Val 245 250 255 Asn Asp Ala His Gly His Glu lie Leu Thr Trp Leu Asn Ser Gin Pro 260 265 270 Ser Lys Ser Val Val Phe Leu Cys Phe Gly Ser Leu Gly Thr Phe Lys
[0009] 275 280 285 Glu Asp Gin Leu Lys Glu lie Ala lleGly Leu Glu Asn Ser Gly His 290 295 300 Arg Phe Leu Trp Val Met Lys Ser Pro Pro lie Asp Asp Lys Thr Lys 305 310 315 320 Arg Phe Leu Pro Pro Pro Glu Pro Asp Phe Asn Val Leu Leu Pro Glu 325 330 335 Gly Phe Leu Glu Arg Thr Lys Glu Arg Gly Val Ile Val Lys Ser Trp 340 345 350 Ala Pro Gin Leu Ala Ile Leu Asn His Asp Ala Ile Gly Gly Phe Val 355 °60 365 Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Val Leu Glu Ala Ile Cys Gly Gly Val 370 375 380 Pro Met Leu Ala Trp Pro Leu Tyr Ala Glu Gin Arg Val Asn Arg Val
[0010] 385 390 395 400 Cys Met Val Glu Glu Met Lys Val Ala Leu Pro Leu Glu Glu Ser Val 405 410 415 Asp Gly Phe Val Met Ala Ser Glu lie Glu Lys Arg Val Lys Glu Leu 420 425 430 Val Asp Tyr Glu Ser Ser Glu Ala lie Arg Asp Gin Val Lys lie il/let 435 440 445 Ser Glu Lys Ala Lys Thr Ala Val Ala Val Ser Gly Ser Ser His Asp 450 455 460 Ala Leu Thr Lys Leu Leu Asp Gly Trp Lys 465 470 <210〉 3 <211> 1521 <2I2> DNA <213〉三色1?!: (Viola x wittrockiana)
[0011] <220〉 <221> misc_feature <223〉全長三色堇（complete length Pansy) F3f 5'H cDNA 〈220〉 <221> CDS 〈222〉(1).. (1521) 〈400〉 3 atg gca att eta gtc acc gac ttc gtt gtc geg get ata att ttc ttg 48 Met Ala Me Leu Val Thr Asp Phe Val Val Ala Ala lie Me Phe Leu 15 10 15 ate act egg ttc tta gtt cgt tet ett ttc aag aaa cca acc ega ccg 96 lie Thr Arg Phe Leu Val Arg Ser Leu Phe Lys Lys Pro Thr Arg Pro 20 25 30 etc CCG ccg ggt GCt etc ggt tgg ccc ttg gtg ggc gee etc cct etc 144 Leu Pro Pro Gly Pro Leu Gly Trp Pro Leu Val Gly Ala Leu Pro Leu 35 40 45 eta ggc gcc atg cct cac gtc gca eta gcc aaa etc get aag aag tat 192 Leu Gly Ala Met Pro His Val Ala Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Tyr 50 55 60 ggt ccg ate atg cac eta aaa atg ggc aeg tgc gac atg gtg gtc geg 240 Gly Pro lie Met His Leu Lys Met Gly Thr Cys Asp Met Val Val Ala
[0012] 65 70 75 80 tcc acc ccc gag teg get cga gcc ttc etc aaa acg eta gac etc aac 2°B Ser Thr Pro Glu Ser Ala Arg Ala Phe Leu Lys Thr Leu Asp Leu Asn 85 90 95 ttc tee aac ege cca ccc aac geg ggc gca tee cac eta geg tac ggc 336 Phe Ser Asn Arg Pro Pro Asn Ala Gly Ala Ser His Leu Ala Tyr Gly 100 105 110 geg cag gac tta gtc ttc gee aag tac ggt ccg agg tgg aag act tta 384 Ala Gin Asp Leu Val Phe Ala Lys Tyr Gly Pro Arg Trp Lys Thr Leu 115 120 125 aga aaa ttg age aac etc cac atg eta ggc ggg aag geg ttg gat gat 432 Arg Lys Leu Ser Asn Leu His Met Leu Gly Gly Lys Ala Leu Asp Asp 130 135 140 tgg gca aat gtg agg gtc acc gag eta ggc cac atg ett aaa gee atg 480 Trp Ala Asn Val Arg Val Thr Glu Leu Gly His Met Leu Lys Ala Met 145 150 155 160 tgc gag geg age egg tgc ggg gag gcc gtg gtg ctg gee gag atg etc 528 Cys Glu Ala Ser Arg Cys Gly Glu Pro Val Val Leu Ala Glu Met Leu 165 170 175 aeg tac gcc atg geg aac atg ate ggt caa gtg ata etc age egg ege 576 Thr Tyr Ala Met Ala Asn Met Ile Gly Gin Val Ile Leu Ser Arg Arg
[0013] 180 185 190 gtg ttc gtg acc aaa ggg aoc gag tct aac gag ttc aaa gac atg gtg 624 Val Phe Val Thr Lys Gly Thr Glu Ser Asn Glu Phe Lys Asp Met Val 195 200 205 gtc gag ttg atg acg tcc gcc ggg tac tt.c aac ate ggt gac ttc ata 672 Val Glu Leu Met Thr Ser Ala Gly Tyr Phe Asn Ile Gly Asp Phe Ile 210 215 220 ccc teg ate get tgg atg gat ttg caa ggg ate gag ega ggg atg aag 720 Pro Ser lie Ala Trp Met. Asp Leu Gin Gly lie Glu Arg Gly Met Lys 225 230 235 240 aag ctg cac acg aag ttt gat gtg tta ttg acg aag atg gtg aag gag 76? Lys Leu His Thr Lys Phe Asp Val Leu Leu Thr Lys Met Val Lys Glu 245 250 255 cat aga geg acg agt cat gag ege aaa ggg aag gca gat ttc etc gao 816 His Arg Ala Thr Ser His Glu Arg Lys Gly Lys Ala Asp Phe Leu Asp 260 265 270 gtt etc ttg gaa gaa tgc gac aat aca aat ggg gag aag ett agt att 864 Val Leu Leu Glu Glu Cys Asp Asn Thr Asn Gly Glu Lys Leu Ser Ile 275 280 285 acc aat ate aaa get gtc ett ttg aat eta ttc acg geg ggc acg gac 912 Thr Asn lie Lys Ala Val Leu Leu Asn Leu Phe Thr Ala Gly Thr Asp
[0014] 290 295 300 aca tct teg age ata ate gaa tgg gcg tta acg ga芪 atR ate aaR aat 960 Thr Ser Ser Ser Me Me Glu Trp Ala Leu Thr Glu Met lie Lys Asn 305 310 315 320 ccg aeg ate tta aaa aag geg caa gag gag atg gat ega gtc ate ggt. 1008 Pro Thr lie Leu Lys Lys Ala Gin Glu Glu Met Asp Arg Val Ile Gly 325 330 335 cgt gat egg agg ctg etc gaa teg gac ata teg age etc ccg tac eta 1056 Arg Asp Arg Arg Leu Leu Glu Ser Asp Ile Ser Ser Leu Pro Tyr Leu 340 345 350 caa gee att get aaa gaa aeg tat ege aaa cac cog teg aeg cct etc 1104 Gin Ala lie Ala Lys Glu Thr Tyr Arg Lys His Pro Ser Thr Pro Leu 355 360 365 aac ttg ccg agg att geg ate caa gca tgt. gaa gtt gat ggc tac tao 1152 Asn Leu Pro Arg Ile Ala Ile Gin Ala Cys Glu Val Asp Gly Tyr Tyr 370 375 oo0 ate cct aag gac geg agg ett age gtg aac att tgg geg ate ggt egg 1200 Ile Pro Lys Asp Ala Arg Leu Ser Val Asn He Trp Ala lie Gly Arg 385 390 395 400 gac ccg aat gtt tgg gag aat ccg ttg gag ttc ttg ccg gaa aga ttc 1248 Asp Pro Asn Val Trp Glu Asn Pro Leu Glu Phe Leu Pro Glu Arg Phe
[0015] 405 410 415 ttg tct gaa gag aat ggg aag ate aat ccc ggt ggg aat gat ttt gag 1296 Leu Ser Glu Glu Asn Gly Lys lie Asn Pro Gly Gly Asn Asp Phe Glu 420 425 430 ctg att ccg ttt gga gcc ggg agg aga att tgt geg ggg aca agg atg 1344 Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly Thr Arg Met 435 440 445 gga atg gtc ett gta agt tat att ttg ggc act ttg gtc cat tct ttt 1392 Gly Met Val Leu Val Ser Tyr lie Leu Gly Thr Leu Val His Ser Phe 450 455 460 gat tgg aaa tta cca aat ggt gtc get gag ett aat atg gat gaa agt 1440 Asp Trp Lys Leu Pro Asn Gly Val Ala Glu Leu Asn Met Asp Glu Ser 465 470 475 480 ttt ggg ett gca ttg caa aag gcc gtg ccg etc teg gCG ttg gtc age 1488 Phe Gly Leu Ala Leu Gin Lys Ala Val Pro Leu Ser Ala Leu Val Ser 485 490 495 cca egg ttg gcc tea aac geg tac gGa acc tga 1521 Pro Arg Leu Ala Ser Asn Ala Tyr Ala Thr 500 505 <210〉 4
[0016] <211> 506 <212〉 PRT <213〉三色堇（Viola x wittrockiana) <400> 4 Met Ala lie Leu Val Thr Asp Phe Val Val Ala Ala lie lie Phe Leu 15 10 15 Ile Thr Arg Phe Leu Val Arg Ser Leu Phe Lys Lys Pro Thr Arg Pro 20 25 30 Leu Pro Pro Gly Pro Leu Gly Trp Pro Leu Val Gly Ala Leu Pro Leu 35 40 45 Leu Gly Ala Met Pro His Val Ala Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Tyr 〇0 55 60 Gly Pro lie Met His Leu Lys Met Gly Thr Cys Asp Met Val Val Ala 65 70 75 80 Ser Thr Pro Glu Ser Ala Arg Ala Phe Leu Lys Thr Leu Asp Leu Asn 85 90 95
[0017] Phe Ser Asn Arg Pro Pro Asn Ala (aly Ala Ser His Leu Ala Tyr Gly 100 105 110 Ala Gin Asp Leu Val Phe Ala Lys Tyr Gly Pro Arg Trp Lys Thr Leu 115 120 125 Arg Lys Leu Ser Asn Leu His Met Leu Gly Gly Lys Ala Leu Asp Asp 130 135 140 Trp Ala Asn Val Arg Val Thr Glu Leu Gly His Met Leu Lys Ala Met 145 150 155 160 Cys Glu Ala Ser Arg Cys Gly Glu Pro Val Val Leu Ala Glu Met Leu 165 170 175 Thr Tyr Ala Met Ala Asn Met lie Gly 6ln Val lie Leu Ser Arg Arg 180 185 190 Val Phe Val Thr Lys Gly Thr Glu Ser Asn Glu Phe Lys Asp Met Val 195 200 205
[0018] Val Glu Leu Met Thr Ser Ala Gly Tyr Phe Asn Ile Gly Asp Phe Ile 210 215 220 Pro Ser lie Ala Trp Met Asp Leu Gin Gly lie Glu Arg Gly Met Lys 225 230 23〇 240 Lys Leu His Thr Lys Phe Asp Val Leu Leu Thr Lys Met Val Lys Glu 245 250 255 His Arg Ala Thr Ser His Glu Arg Lys Gly Lys Ala Asp Phe Leu Asp 260 265 270 Val Leu Leu Glu Glu Cys Asp Asn Thr Asn Gly Glu Lys Leu Ser lie 275 280 285 Thr Asn Ile Lys Ala Val Leu Leu Asn Leu Phe Thr Ala Gly Thr Asp 290 295 300 Thr Ser Ser Ser lie Ile Glu Trp Ala Leu Thr Glu Met Ile Lys Asn 305 310 315 320
[0019] Pro Thr lie Leu Lys Lys Ala Gin Glu Glu Met Asp Arg Val lie Gly 325 '330 335 Arg Asp Arg Arg Leu Leu Glu Ser Asp lie Ser Ser Leu Pro Tyr Leu 340 345 350 Gin Ala lie Ala Lys Glu Thr Tyr Arg Lys His Pro Ser Thr Pro Leu 355 360 365 Asn Leu Pro Arg lie Ala lie Gin Ala Cys Glu Val Asp Gly Tyr Tyr 370 375 380 Ile Pro Lys Asp Ala Arg Leu Ser Val Asn lie Trp Ala lie Gly Arg 385 390 395 400 Asp Pro Asn Val Trp Glu Asn Pro Leu Glu Phe Leu Pro Glu Arg Phe 405 410 415 Leu Ser Glu Glu Asn Gly Lys lie Asn Pro Gly Gly Asn Asp Phe Glu 420 425 430
[0020] Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly Thr Arg Met 435 440 445 Gly Met Val Leu Val Ser Tyr lie Leu Gly Thr Leu Val His Ser Phe 450 455 460 Asp Trp Lys Leu Pro Asn Gly Val Ala Glu Leu Asn Met Asp Glu Ser 465 470 475 480 Phe Gly Leu Ala Leu Gin Lys Ala Val Pro Leu Ser Ala Leu Val Ser 485 490 495 Pro Arg Leu Ala Ser Asn Ala Tyr Ala Thr 500 505 <210〉 5 <211> 1539 <212> DNA <213〉藍豬耳（Torenia fournier) <220〉
[0021] <221> mi$c_feature <223〉全長藍豬耳（complete length Torenia) FNS <220〉 <22l> CDS <222〉⑴··(丨539) <400> 5 atg gac aca gtc tta ate aca etc tac acc gcc ctg ttc gtc ate acc 48 Met Asp Thr Val Leu lie Thr Leu Tyr Thr Ala Leu Phe Val lie Thr 15 10 15 acc acc ttc etc etc etc etc ege ega agg gga cca ccg tet ccg ccc 96 Thr Thr Phe Leu Leu Leu Leu Arg Arg Arg Gly Pro Pro Ser Pro Pro 20 25 30 ggt cct etc tee eta ccc ata att ggc cac etc cac etc etc ggc cca 144 Gly Pro Leu Ser Leu Pro Me lie Gly His Leu His Leu Leu Gly Pro 35 40 45 aga etc cac cac aeg ttc cat gaa ttc tea etc aaa tac ggc cca ttg 192 Arg Leu His His Thr Phe His Glu Phe Ser Leu Lys Tyr Gly Pro Leu 50 55 60 ate cag etc aag etc ggc teg ate ccg tgc gtc gtg gcc teg aeg ccc 240 lie Gin Leu Lys Leu Gly Ser lie Pro Cys Val Val Ala Ser Thr Pro 65 70 75 80
[0022] gag etc geg aga gag ttt ett aag aeg aac gag etc geg ttc tee tet 288 Glu Leu Ala Arg Glu Phe Leu Lys Thr Asn Glu Leu Ala Phe Ser Ser 85 90 95 ege aag cac tet aeg gee ata gac ate gtc ace tac gac teg tee ttt 336 Arg Lys His Ser Thr Ala lie Asp lie Val Thr Tyr Asp Ser Ser Phe 100 105 110 get ttc tet ccg tac gga ccc tac tgg aag tac ate aag aaa ctg tgt 384 Ala Phe Ser Pro Tyr Gly Pro Tyr Trp Lys Tyr Ile Lys Lys Leu Gys 115 120 125 acc tac gag ctg etc gga geg agg aac etc gga cac ttt cag ccc att 432 Thr Tyr Glu Leu Leu Gly Ala Arg Asn Leu Gly His Phe Gin Pro Ile 130 135 140 agg aat etc gag gtc agg tee ttt ctg cag ett ctg atg cac aag age 480 Arg Asn Leu Glu Val Arg Ser Phe Leu Gin Leu Leu Met His Lys Ser 145 150 155 160 ttt aag ggc gag agt gtg aat gtg aca gac gag ctg gtg agg ctg aeg 528 Phe Lys Gly Glu Ser Val Asn Val Thr Asp Glu Leu Val Arg Leu Thr 165 170 175 age aat gtg ata tee cac atg atg ctg age ata agg tgc teg gaa gat 576 Ser Asn Val Me Ser His Met Met Leu Ser lie Arg Cys Ser Glu Asp 180 185 190
[0023] gaa ggc gat get gag geg geg aga aca gtg ata ege gag gtg aeg cag 624 Glu Gly Asp Ala Glu Ala Ala Arg Thr Val lie Arg Glu Val Thr Gin 195 200 205 ata ttt ggg gaa ttc gat gtt aeg gac ata ata tgg ttt tgc aag aaa 672 lie Phe Gly Glu Phe Asp Val Thr Asp Me lie Trp Phe Cys Lys Lys 210 215 220 ttc gat ctg cag ggg ata aag aag agg tea gag gat: att cag agg agg 720 Phe Asp Leu Gin Gly lie Lys Lys Arg Ser Glu Asp lie Gin Arg Arg 225 2°0 235 240 tat gat get ttg etc gag aag att att agt gat aga gag aga teg agg 768 Tyr Asp Ala Leu Leu Glu Lys lie lie Ser Asp Arg Glu Arg Ser Arg 245 250 255 agg oaa aat cgt gat aag cat ggt ggc ggt aac aat gag gag gee aag 816 Arg Gin Asn Arg Asp Lys His Gly Gly Gly Asn Asn Glu Glu Ala Lys 260 265 270 gat ttt ett gat atg ttg ett gat gtg atg gag agt ggg gac aeg gag 864 Asp Phe Leu Asp Met Leu Leu Asp Val Met Glu Ser Gly Asp Thr Glu 275 280 285 gtc aaa ttc act aga gag cat etc aag get ttg att Gtg gat ttc ttc 912 Val Lys Phe Thr Arg Glu His Leu Lys Ala Leu Ile Leu Asp Phe Phe 290 29b 300
[0024] acg gcc ggt acg gac aca aca gcc ata gcc acc gag tgg gcc ate gee 960 Thr Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ala lie Ala Thr Glu Trp Ala lie Ala 305 310 315 320 gag etc ate aac aac ccg aac gtc ttg aag aag gee caa gaa gaa ata 1008 Glu Leu lie Asn Asn Pro Asn Val Leu Lys Lys Ala Gin Glu Glu lie 325 330 335 tee egg ate ate gga acc aag egg ate gta caa gaa tee gac gcc cca 1056 Ser Arg lie Me Gly Thr Lys Arg lie Val Gin Glu Ser Asp Ala Pro 340 345 °50 gac eta ccc tac etc cag gcc ate ate aag gag acg ttc egg etc cac 1104 Asp Leu Pro Tyr Leu Gin Ala lie lie Lys Glu Thr Phe Arg Leu His 355 360 365 cca ccg ate ccg atg etc teg cgt aag tee aGC tee gat tgc acg gtc 1152 Pro Pro lie Pro Met Leu Ser Arg Lys Ser Thr Ser Asp Cys Thr Val 370 375 380 aac ggc tac aaa ate caa gcc aag age etc ttg ttc gtg aac ata tgg 1200 Asn Gly Tyr Lys lie Gin Ala Lys Ser Leu Leu Phe Val Asn lie Trp 385 390 395 400 tee ate ggt ega aac cct aat tac tgg gaa age cct atg gag ttc agg 1248 Ser Ile Gly Arg Asn Pro Asn Tyr Trp Glu Ser Pro Met Glu Phe Arg 405 410 415
[0025] ccc gag egg ttc ttg gag aag gga ege gag tee ate gac gtc aag ggc 1296 Pro Glu Arg Phe Leu Glu Lys Gly Arg Glu Ser Ile Asp Val Lys Gly 420 425 430 cag cac ttt gag etc ttg cct ttt ggg aeg ggc ege agg ggc tgt ccc Gin His Phe Glu Leu Leu Pro Phe Gly Thr Gly Arg Arg Gly Cys Pro 435 440 445 ggt atg ttg ctg get ata caa gag gtg gtc age ate att ggg acc atg 1392 Gly Met Leu Leu Ala lie Gin Glu Val Val Ser Me lie Gly Thr Met 450 455 460 gtt cag tgc ttc gac tgg aaa ttg gca gat. ggt teg ggc aat aat. gtg 1440 Val Gin Cys Phe Asp Trp Lys Leu Ala Asp Gly Ser Gly Asn Asn Val 465 470 475 480 gac atg acc gaa egg tet gga ttg acc get ccg aga geg ttc gat ctg 1488 Asp Met Thr Glu Aig Ser Gly Leu Thr Ala Pro Arg Ala Phe Asp Leu 485 490 495 gtt tgc egg ttg tat cca egg gtt gac ccg gee aca ata teg ggt get 1536 Val Cys Arg Leu Tyr Pro Arg Val Asp Pro Ala Thr lie Ser Gly Ala 500 505 510 tga 1539 <210〉 6
[0026] <211> 512 <212> PRT <213〉藍豬耳（Torenia fournier) <400> 6 Met Asp Thr Val Leu lie Thr Leu Tyr Thr Ala Leu Phe Val lie Thr 15 10 15 Thr Thr Phe Leu Leu Leu Leu Arg Arg Arg Gly Pro Pro Ser Pro Pro 20 25 °0 Gly Pro lei1 Ser Leu Pro Me lie Gly His Leu His Leu Leu Gly Pro 35 40 45 Arg Leu His His Thr Phe His Glu Phe Ser Leu Lys Tyr Gly Pro Leu GO 55 60 lie Gin Leu Lys Leu Gly Ser lie Pro Cys Val Val Ala Ser Thr Pro 65 70 75 80 Glu Leu Ala Arg Glu Phe Leu Lys Thr Asn 6lu Leu Ala Phe Ser Ser 85 90 95
[0027] Arg Lys His Ser Thr Ala lie Asp lie Val Thr Tyr Asp Ser Ser Phe 100 105 110 Ala Phe Ser Pro Tyr Gly Pro Tyr Trp Lys Tyr Ile Lys Lys Leu Cys 115 120 125 Thr Tyr Glu Leu Leu Gly Ala Arg Asn Leu Gly His Phe Gin Pro Ile 130 135 140 Arg Asn Leu Glu Val Arg Ser Phe Leu Gin Leu Leu Met His Lys Ser 145 150 155 160 Phe Lys Gly Glu Ser Val Asn Val Thr Asp Glu Leu Val Arg Leu Thr 165 170 175 Ser Asn Val lie Ser His Met Met Leu Ser lie Arg Cys Ser Glu Asp 180 185 190 Glu Gly Asp Ala Glu Ala Ala Arg Thr Val lie Arg Glu Val Thr Gin 195 200 205
[0028] lie Phe Gly Glu Phe Asp Val Thr Asp lie lie Trp Phe Cys Lys Lys 210 215 220 Phe Asp Leu Gin Gly lie Lys Lys Arg Ser Glu Asp lie Gin Arg Arg 225 2?0 23b 240 Tyr Asp Ala Leu Leu Glu Lys lie lie Ser Asp Arg Glu Arg Ser Arg 245 250 255 Arg Gin Asn Arg Asp Lys His Gly Gly Gly Asn Asn Glu Glu Ala Lys 260 265 270 Asp Phe Leu Asp Met Leu Leu Asp Val Met Glu Ser Gly Asp Thr Glu 27b 280 285 Val Lys Phe Thr Arg Glu His Leu Lys Ala Leu Ile Leu Asp Phe Phe 290 295 300 Thr Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ala Ile Ala Thr Glu Trp Ala lie Ala 305 310 315 320
[0029] 61u Leu lie Asn Asn Pro Asn Val Leu Lys Lys Ala Gin Glu Glu lie 325 '330 335 Ser Arg lie lie Gly Thr Lys Arg lie Val Gin Glu Ser Asp Ala Pro 340 345 350 Asp Leu Pro Tyr Leu Gin Ala lie lie Lys Glu Thr Phe Arg Leu His 355 360 365 Pro Pro lie Pro Met Leu Ser Arg Lys Ser Thr Ser Asp Cys Thr Val 370 375 380 Asn Gly Tyr Lys lie Gin Ala Lys Ser Leu Leu Phe Val Asn lie Trp 385 390 395 400 Ser Ile Gly Arg Asn Pro Asn Tyr Trp Glu Ser Pro Met Glu Phe Arg 405 410 415 Pro Glu Arg Phe Leu Glu Lys Gly Arg Glu Ser Ile Asp Val Lys Gly 420 425 430
[0030] Gin His Phe Glu Leu Leu Pro Phe Gly Thr Gly Arg Arg Gly Gys Pro 435 440 445 Gly Met Leu Leu Ala lie Gin Glu Val Val Ser lie lie Gly Thr Met 450 455 460 Val Gin Cys Phe Asp Trp Lys Leu Ala Asp Gly Ser Gly Asn Asn Val 465 470 475 480 Asp Met Thr Glu Arg Ser Gly Leu Thr Ala Pro Arg Ala Phe Asp Leu 485 490 495 Val Cys Arg Leu Tyr Pro Arg Val Asp Pro Ala Thr lie Ser Gly Ala 500 505 510 <210〉 7 <211> 4087 <212> DNA 〈213〉紫辦（Perillafrutescens)
[0031] <220〉 <221〉 misc-feature <223〉紫芥（Peril la) 3AT <220> <221〉基因（gene) <222/ (1).. (4087) <400> 7 aactattatg atcccacaga gtttttgaca gatgagtctt caggaggaga tgctgaacct 60 tttcactact ctactgaacg catcacaagt ttatcggctt atatgactaa tagggatcaa 120 cttcacaaca gagaggctca tagagGtctt aaagaggatt tgatcgagca catatggaaa 180 aaattcggca ctaactaaat atataattta cgttttatgc actcgtaatt taaaatttca 240 tgtgtctcat tgtagtttat ttaattatgt tttcactctt gtaattttta ttttgttgtg 300 aagtaaatta tRaatttata attatatgRS taattttttg ataattatgc aattaaaaat 360 aattaatatt ttttaaatgc aagagaaaaa tgttatttta ataacatgtt cttattaaaa 420 aataaaatga taaatatttt atgtaggttg ggagaaaatg aaaaaataat attttatttg 480 aaggttgggt tggatgaggt cactgatggg agtataaata atactccctc cgtcccataa 540 ttattgtcca ttattccttt ttgggatgtc ccaaaattat agtcotattc taaattggga 600
[0032] ttgtatttaa atattotttt acaaatataa ccctatttga tatagtatga atgcaattaa 660 tatagtaaaa aaataagggc aatataggat aattattgta aattgtatat ttccaataca 720 tattaaatgt gatttcttaa tctgtgtgaa aataggaagt ggactataat tatgggacgg 780 agggagtata aagttggagg ttgtggatgt ggaggagaaa gaaattaata ttttatttaa 840 agattggatt aaaggaggtc actgatgtgg gtagtcttag aggaaatgta gtcttagagg 900 aaatctgccc agcaaaataa aataataagt aaataaataa actaaatatg tattgaatgc 960 gacatctagc aatatagcca catatatagt gcagtagcac gcagcgctcg ttactcgtca 1020 gtcgtcaaag aatggtaagt atagaaaagc atctttaaat aacacaccaa aaaccacagc 1080 tacgttcaac accgccatga ccaccaccgt gatcgaaacg tgtagagttg ggccaccgcc 1140 ggactcggtg gcggagcaat cgttgccgct cacattcttc gacatgacgt ggctgcattt 1200 tcatcccatg cttcagctcc tcttctacga attcccttgt tccaagcaac atttctcaga 1260 atccatcatt ccaaaactca aacaatotct ctctaaaact ctcatacact tcttccctct 1320 ctcatgcaat ttaatctacc cttcatctcc ggagaaaatg cccgagtttc ggtatctatc 1380 gggggactcg gtttctttca ctatcgcaga atctagcgac gacttcgatg atctcgtcgg 1440
[0033] aaatcgcgca gaatctcccg ttaggctcta caacttcgtc cctaaattgc cgcagattgt 1500 cgaagaatct gatagaaaac tcttccaagt tttcgccgtg caggtgactc ttttcccagg 1560 tcgaggcgtc ggtattggaa tagcaacgca tcacaccgtt agcgatgccc cgtcgtttct 1620 cgcctttata acggcttggg cttggatgag caaacacatt gaagatgaag atgaagagtt 1680 taaatctttg ccagttttcg atagatccgt cataaaatat ccgacgaaat ttgactcgat 1740 ttattggaaa aaggcgctaa aatttccttt gcaatctcgt catccGtcat taccgacgga 1800 ccgcattcga accacgttcg ttttcaccca atccgaaatt aagaaattga agggttcgat 1860 tcagtccaga gttccaagtt tagtccatct ctcatctttt gtagcgattg cagcttatat 1920 gtgggctggc gtaacgaaat cactcacagc- agatgaagac cacgacgacg gggatgcatt 1980 tttcttgatt ccggtcgatc taaggccacg attagatccg ccagttcccg aaaattactt 2040 cgggaactgc ttatcgtacg cgctgccgag aatgcggcgg cgagagctgg tgggagagaa 2100 aggggtgttt ctggcggctg aggcaatcgc ggcggagatc aaaaaaagga tcaacgacaa 2160 gagaatatta gaaacggtgg agaaatggtc gctggagatt cgtgaagcgt tgcagaaatc 2220 atatttttcg gtggcaggat cgagcaagct agatctttac ggtgcagatt ttggatgggg 2280
[0034] gaaggcgaga aagcaagaaa tattgtcgat tgatggggag aaatatgcaa tgacgctttg 2340 taaagccagg gatttcgaag gaggattgga ggtttgcttg tctttgccta aggacaaaat 2400 ggatgctttt gctgcttatt tttcagcggg aattaatggt taataaatgt atgtaattaa 2460 actaatatta ttatgtaaca attaattaag tgttgagtaa cgtgaagaat aatatctttt 2520 acciattata tatttatgag ttggttcaaa taaaatcact tcatttattg tattaaccgt 2580 ttagtgttct tctcaccata ttttggtgct attttttaaa aaatgttttt tttattgtat 2640 tttagtatta attgttttac cactaaaatt acagtaaaat gcaagatagt ttaattttta 2700 catttacata tgaaacacat tctctttata accaacctct ctatatatat aatatgtgtg 2760 tatgtatgta tacacatgta tgaatactag aaatatatct taaaccatcc atccttcaaa z820 aatttcgggg ccatattgca tggtgacatt ataatatttg ataatttctt cgaacacgtt 2880 attaattcaa tttaataatt ctaataaaaa gacgctcaga caatatatgt agataggatc 2940 ggcccaaagg ggtgtctggg tgggctgtcg cccatgggcc ccgaaatctt aggggcaaaa 3000 aaaaaaaaat tcattatacc tagggcaaaa aaattaccgc tcttcacttc tctgcctctc 3060 tccctcatcc ctcgttcctc ctctctcttc cctatgtacg cctctttcac tccctccccc 3120
[0035] tctctcagtt ctctatcact tgtattttgt attgaaaact tgttgaaaac taaaccaaaa 3180 atagaaaaag gtatagaaaa tttgaaaaca aaggttgttt ttttgtgttg ctgcagttcc 3240 caaacttgcc gagttgccga cttgccgtgt tgaattgtta tatatgttaa aagcctaaaa 3300 tatatccttt cagaattgag atggattgtt gtaactatca ggtttttttt attgagaatt 3360 ttagatcaat tagttatctt gtaatttttt attcttttta atacaatact ccctccatcc 3420 caatagGaag gtccccttgc tattgggcac gggtattaag gaggaggatt attataatga 3480 aaattaatat aaagtaagtg gattccactt tattaaggaa tattataatc aaaagtaata 3540 taaagtaagt ggattccact ttaattagga cactaattat tttctttttt ggtatgagac 3600 tttgctattg ggacatccca aaaaggcaaa agagaccttg ctattaggac ggtggacgtg 3660 ctgccgaggc acgcaaatta atttaccttt cctcttctat actaactcgt agtagcggcg 3720 agtaaaggtc gaaccctcaa ggagcaattg aactagatgt gctattagaa ataaaataaa 3780 cacaagtgag aggggagttt ttggtttcaa tttaactaaa actaattatg aaaatgaaaa °840 aacaaatata aaacataaac aggtagacga aatatgataa agatagaatt ctagttctcg ^900 gttcagttat. cacctttctc caagtatttc atgaataatg caacgcctct tttcatacaa 3960
[0036] cttagaatcg atgtccaaag gttaatatca agctttattt acctaattgt ctcgtacgat 4020 tagttaacta aaacaagctc tttaattaac tctactcaat tagataacct agaataagct 4080 ctctaga 4087 〈210〉 8 <211> 1356 〈212〉 DMA 〈213〉薰衣草（Lavender officinal I is) <220> 〈22.1 > mi sc-feature <223> Lavender 3AT <220〉 <221> CDS <222〉 (1).. (1356) <400> 8 atg acc acc etc etc gaa tcc tcc ega gtg geg ccg cct cca ggc aeg 48 Met Thr Thr Leu Leu Glu Ser Ser Arg Val Ala Pro Pro Pro Gly Thr 15 10 15
[0037] gtg get gag cag tea etc ccg etc acc ttc ttc gao atg aeg tgg ctg 96 Val Ala Glu Gin Ser Leu Pro Leu Thr Phe Phe Asp Met Thr Trp Leu 20 25 30 cat ttc cac ccc atg ett cag ett etc ttc tac gaa etc ccc tgt tee 144 His Phe His Pro Met Leu Gin Leu Leu Phe Tyr Glu Leu Pro Cys Ser 35 40 45 aaa ccc gee ttc etc gaa acc gtc gtt. ccg aaa etc aaa caa tee tta 192 Lys Pro Ala Phe Leu Glu Thr Val Val Pro Lys Leu Lys Gin Ser Leu 50 55 60 tet eta acc etc aaa cac ttc ttc ccc ett tea tgc aat eta ate tac 240 Ser Leu Thr Leu Lys His Phe Phe Pro Leu Ser Cys Asn Leu lie Tyr 65 70 75 80 cct eta teg ccg gag aaa atg ccg gag ttc egg tat cag aac ggt gac 288 Pro Leu Ser Pro Glu Lys Met Pro Glu Phe Arg Tyr Gin Asn Gly Asp 85 90 95 teg gtt tet ttc aeg att atg gag tet age gac gat tat gaa gat etc 336 Ser Val Ser Phe Thr lie Met Glu Ser Ser Asp Asp Tyr Glu Asp Leu 100 105 110 gtc gga gat cat ccg cat tee get cat aaa tac tac tgc ttt gee cct 384 Val Gly Asp His Pro His Ser Ala His Lys Tyr Tyr Cys Phe Ala Pro 115 120 125
[0038] cag ctg ccg ccg ata gtc gag gaa tct gat egg aaa ttg ttt caa gtt 432 Gin Leu Pro Pro lie Val Glu Glu Ser Asp Arg Lys Leu Phe Gin Val 130 135 140 tta gcc gtg caa gtg act ctg ttt ccc ggt ege ggg gtg tgc ate gga 480 Leu Ala Val Gin Val Thr Leu Phe Pro Gly Arg Gly Vai Cys lie Gly 145 150 155 160 ata aeg aeg cac cac acc gtt age gat. get cca teg ttt gta ggg ttt 528 Ile Thr Thr His His Thr Val Ser Asp Ala Pro Ser Phe Val Gly Phe 165 170 175 atg aag agt tgg get tee ate act aaa ttc gga gga gat gat gaa ttc 576 Met Lys Ser Trp Ala Ser Me Thr Lys Phe Gly Gly Asp Asp Glu Phe 180 185 190 ttg gac gga aaa ggt gaa tgt ttg ccg gtt ttc gac ega teg etc gtg 624 Leu Asp Gly Lys Gly Glu Cys Leu Pro Val Phe Asp Arg Ser Leu Val 195 200 205 aat tat ccg cct aaa ttg gac aca tat tta tgg aac aac geg cag aaa 672 Asn Tyr Pro Pro Lys Leu Asp Thr Tyr Leu Trp Asn Asn Ala Gin Lys 210 215 220 Ggt ccg ttg gaa teg cag cat cca tct tta ccg aeg gat egg att ega 720 Arg Pro Leu Glu Ser Gin His Pro Ser Leu Pro Thr Asp Arg lie Arg 22b 230 235 240
[0039] get acc tac ett ttc acc caa tet gaa att aag aaa ttg aag ggt ttg 768 Ala Thr Tyr Leu Phe Thr Gin Ser Glu lie Lys Lys Leu Lys Gly Leu 245 250 255 att cag aga aaa gcc cca aat gta gtt aat etc tet tee ttc gtc geg 816 lie Gin Arg Lys Ala Pro Asn Val Val Asn Leu Ser Ser Phe Val Ala 260 265 270 ate gca get tat ate tgg acc ggc ate gcc aaa teg gtc gga gat tac 864 Ile Ala Ala Tyr Ile Trp Thr Gly Ile Ala Lys Ser Val Gly Asp Tyr 275 280 285 aaa gac gtg gat gac gac aaa ege get ttc ttt tta att ccg ate gat 912 Lys Asp Val Asp Asp Asp Lys Arg Ala Phe Phe Leu lie Pro lie Asp 290 295 300 tta agg ccg cgt ttg gat ccg ccg get ccg ggg aac tac ttc gga aac 960 Leu Arg Pro Arg Leu Asp Pro Pro Ala Pro Gly Asn Tyr Phe Gly Asn m 310 315 320 tgt eta teg ttt geg atg geg aag ate ctg egg egg gat ttg gtc gga 1008 Cys Leu Ser Phe Ala Met Ala Lys Ile Leu Arg Arg Asp Leu Val Gly 325 330 335 gat gaa ggg gtg ttt egg gca get gag geg ate geg geg gaa ata gag 1056 Asp Glu Gly Val Phe Arg Ala Ala Glu Ala lie Ala Ala Glu lie Glu 340 345 350
[0040] aag agg acg age gac aag aag att eta gaa act gtg gag aac tgg ccg 1104 Lys Arg Thr Ser Asp Lys Lys lie Leu Glu Thr Val Glu Asn Trp Pro 355 360 365 tet gag att ege gaa gee ttg caa aac tgt tat ttc teg gtg geg gga 1152 Ser Glu lie Arg Glu Ala Leu Gin Asn Cys Tyr Phe Ser Val Ala Gly 370 375 380 teg age agg ett gat ett tac ggc geg gat ttt gga tgg ggt aag geg 1200 Ser Ser Arg Leu Asp Leu Tyr Gly Ala Asp Phe Gly Trp Gly Lys Ala 385 390 395 400 gtg aag caa gag ata ctg teg att gat gga gag aag ttt acg atg teg 1248 Val Lys Gin Glu lie Leu Ser lie Asp Gly Glu Lys Phe Thr Met Ser 405 410 415 ttg tgt aaa ccg agg gat get gee gga gga ttg gag gtt gga ttg tet 1296 Leu Cys Lys Pro Arg Asp Ala Ala Gly Gly Leu Glu Val Gly Leu Ser 420 425 430 ttg cca aag gag gaa ttg caa get ttt gat gat tat ttt geg gag gga 1344 Leu Pro Lys Glu Glu Leu Gin Ala Phe Asp Asp Tyr Phe Ala Glu Gly 435 440 445 ata aag ggt tga 1356 Ile Lys Gly 450
[0041] <210> 9 <211> 451 <212〉 PRT <213> 薰衣草（Lavender officinal 丨 is) <400> 9 Met Thr Thr Leu Leu Glu Ser Ser Arg Val Ala Pro Pro Pro Gly Thr 15 10 15 Val Ala Glu Gin Ser Leu Pro Leu Thr Phe Phe Asp Met Thr Trp Leu 20 25 30 His Phe His Pro Met Leu Gin Leu Leu Phe Tyr Glu Leu Pro Cys Ser 35 40 45 Lys Pro Ala Phe Leu Glu Thr Val Val Pro Lys Leu Lys Gin Ser Leu 50 55 60 Ser Leu Thr Leu Lys His Phe Phe Pro Leu Ser Cys Asn Leu lie Tyr 65 70 75 80
[0042] Pro Leu Ser Pro Glu Lys Met Pro Glu Phe Arg Tyr Gin Asn Gly Asp 85 90 95 Ser Val Ser Phe Thr lie Met Glu Ser Ser Asp Asp Tyr Glu Asp Leu 100 105 110 Val Gly Asp His Pro His Ser Ala His Lys Tyr Tyr Cys Phe Ala Pro 115 120 125 Gin Leu Pro Pro lie Val Glu Glu Ser Asp Arg Lys Leu Phe Gin Val 130 135 140 Leu Ala Val Gin Val Thr Leu Phe Pro Gly Arg Gly Val Cys lie Gly 145 150 155 160 lie Thr Thr His His Thr Val Ser Asp Ala Pro Ser Phe Val Gly Phe 165 170 175 Met Lys Ser Trp Ala Ser lie Thr Lys Phe Gly Gly Asp Asp Glu Phe 180 185 190
[0043] Leu Asp Gly Lys Gly Glu Cys Leu Pro Val Phe Asp Arg Ser Leu Val 195 200 205 Asn Tyr Pro Pro Lys Leu Asp Thr Tyr Leu Trp Asn Asn Ala Gin Lys 210 215 220 Arg Pro Leu Glu Ser Gin His Pro Ser Leu Pro Thr Asp Arg lie Arg 225 230 235 240 Ala Thr Tyr Leu Phe Thr Gin Ser Qlu lie Lys Lys Leu Lys Gly Leu 245 250 255 lie Gin Arg Lys Ala Pro Asn Val Val Asn Leu Ser Ser Phe Val Ala 260 265 270 lie Ala Ala Tyr lie Trp Thr Gly lie Ala Lys Ser Val Gly Asp Tyr 275 280 285 Lys Asp Val Asp Asp Asp Lys Arg Ala Phe Phe Leu Ile Pro Ile Asp 290 295 300
[0044] Leu Arg Pro Arg Leu Asp Pro Pro Ala Pro Gly Asn Tyr Phe Gly Asn 305 310 315 320 Cys Leu Ser Phe Ala Met Ala Lys lie Leu Arg Arg Asp Leu Val Gly 325 '330 335 Asp Glu Gly Val Phe Arg Ala Ala Glu Ala lie Ala Ala Glu lie Glu 340 345 350 Lys Arg Thr Ser Asp Lys Lys lie Leu Glu Thr Val Glu Asn Trp Pro 355 360 365 Ser Glu lie Arg Glu Ala Leu Gin Asn Cys Tyr Phe Ser Val Ala Gly 370 375 380 Ser Ser Arg Leu Asp Leu Tyr Gly Ala Asp Phe Gly Trp Gly Lys Ala 385 390 395 400 Val Lys Gin Glu lie Leu Ser lie Asp Gly Glu Lys Phe Thr Met Ser 405 410 415
[0045] Leu Gys Lys Pro Arg Asp Ala Ala Gly Gly Leu Glu Val Gly Leu Ser 420 425 430 Leu Pro Lys Glu Glu Leu Gin Ala Phe Asp Asp Tyr Phe Ala Glu Gly 435 440 445 lie Lys Gly 450 <210> 10 <211> 1395 <212〉 DMA <213〉喜林草（Meniophilamenziesii) > <221〉 misc-feature <223> NmGT3 <220〉 <221> CDS <222> (1).. (1395) aoo> 10 atg cca tea ate ctg age aat age gca cac att eta etc ttt cca ttt 48
[0046] Met Pro Ser lie Leu Ser Asn Ser Ala His lie Leu Leu Phe Pro Phe 15 10 15 cct act tea gga cat att ata ccc ate ett gat ett gcc aac caa tta 96 Pro Thr Ser Gly His Me lie Pro lie Leu Asp Leu Ala Asn Gin Leu 20 25 30 ett gcc cgt ggc tta acc ate acc ate tta ate aca ccc gca aac eta 144 Leu Ala Arg Gly Leu Thr Me Thr lie Leu He Thr Pro Ala Asn Leu 35 40 45 act ett etc too aca cag ttg ata gag etc gac cgt ett ggt tee eta 192 Thr Leu Leu Ser Thr Gin Leu lie Glu Leu Asp Arg Leu Gly Ser Leu 50 55 60 cat act ttg gtc ett cot ttt cca aac ccc ccc aac cot tea gag act 240 His Thr Leu Val Leu Pro Phe Pro Asn Pro Pro Asn Pro Ser Glu Thr 65 70 75 80 agt ttg got R〇a aga gtt cat get agt agt caa eta tea aac acc ate 288 Ser Leu Ala Ala Arg Val His Ala Ser Ser Gin L^u Ser Asn Thr lie 85 90 95 ata caa tgg ttc caa tet cac aca tea ccc cct gtt gcc att gtt tet 336 lie Gin Trp Phe Gin Ser His Thr Ser Pro Pro Val Ala lie Val Ser 100 105 110 gat ttt ttc ett ggc tgg act aac age tta gca tea caa ttg gga ate 384
[0047] Asp Phe Phe Leu Gly Trp Thr Asn Ser Leu Ala Ser Gin Leu Gly Ile 115 120 125 ccg cgt ctt gta ttt tgg cca teg ggt gtt caa ega tet teg etc gta 432 Pro Arg Leu Val Phe Trp Pro Ser Gly Vai Gin Arg Ser Ser Leu Val 130 135 140 gat tat ata tgg caa aat gat caa ttg tea gat tcc gac cac caa ate 480 Asp Tyr Ile Trp Gin Asn Asp Gin Leu Ser Asp Ser Asp His Gin Me 145 150 155 160 caa gac aat tot gtg att tea ttt cct gat gta ccg aac tea cca gca 528 Gin Asp Asn Ser Val lie Ser Phe Pro Asp Val Pro Asn Ser Pro Ala 165 170 175 tac cca aag tgg caa goo tgt ggt ctt agt act cag tat aag aaa gga 576 Tyr Pro Lys Trp Gin Ala Cys Gly Leu Ser Thr 6ln Tyr Lys Lys Gly 180 185 190 gac cca age tgg gaa ttt ttc aag aat ggt gtt tta gca aat aca caa 624 Asp Pro Ser Trp Glu Phe Phe Lys Asn Gly Val Leu Ala Asn Thr Gin 195 200 205 age tgg ggt get ate tat aat tet ttt agg gac tta gaa gga gtt tat 672 Ser Trp Gly Ala lie Tyr Asn Ser Phe Arg Asp Leu Glu Gly Val Tyr 210 215 220 att gat tat ate aag aag aaa atg ggc cat gga aga gtt tgg gca gtt 720
[0048] lie Asp Tyr lie Lys Lys Lys Met Gly His Gly Arg Val Trp Ala Val 225 230 235 240 ggg cca ctt ttg ccc gca aat gat gca tea aaa ege ggt gga tea tgt 768 Giy Pro Leu Leu Pro Ala Asn Asp Ala Ser Lys Arg Gly Gly Ser Cys 245 250 255 gta atg ccc att gat gat gta atg aca tgg tta gat aeg aaa acc aat 816 Val Met Pro Ile Asp Asp Val Met Thr Trp Leu Asp Thr Lys Thr Asn 260 265 270 tea gac aat tot gtt gtt tat gtc tgt ttt ggt agt ega gta gag tta 864 Ser Asp Asn Ser Val Val Tyr Val Cys Phe Gly Ser Arg Val Glu Leu 275 280 285 aca acc gag caa eta gat tet tta gca get gca ctt gaa ate agt ggg 912 Thr Thr Glu Gin Leu Asp Ser Leu Ala Ala Ala Leu Qlu Me Ser Gly 290 295 3U0 gtt cat ttc ata ttg tgt gtg aag tta cat cag gag ate tea aag gag 960 Val His Phe lie Leu Cys Val Lys Leu His Gin Glu lie Ser Lys Glu 305 310 315 320 tac gaa gat ega gtg get gga aga gga ttg ate ata agg gga tgg gca 1008 Tyr Glu Asp Arg Val Ala Gly Arg Gly Leu lie lie Arg Gly Trp Ala 325 330 335 cca caa gtc geg ata tta agg cat ega get gtg ggt gog ttt ttg act 1056
[0049] Pro Gin Val Ala lie Leu Arg His Arg Ala Val Gly Ala Phe Leu Thr 340 345 350 cat tgt ggg tgg aat tcc ata tta gaa gga ata get geg ggt gtg gtg 1104 His Cys Gly Trp Asn Ser Me Leu Glu Giy lie Ala Ala Gly Val Val 355 360 365 atg eta aca tgg cca aggt get gat caa tU aeg aat get aac tta 1152 Met Leu Thr Trp Pro Met Gly Ala Asp Gin Phe Thr Asn Ala Asn Leu 370 375 380 tta gta gat gag tta aag gtg geg atg aag get tgt gaa ggc ggt gat. 1200 Leu Val Asp Glu Leu Lys Val Ala Met Lys Ala Cys Glu Gly Gly Asp 385 390 395 400 agt aac gtg ccc aac cot gcc atg ttg get aat gta tta gee gag tea 1248 Ser Asn Val Pro Asn Pro Ala Met Leu Ala Asn Val Leu Ala Glu Ser 405 410 415 ata aat ggt ggt agg get gag agg gag aga gtg aeg gag ctg tgt gat 1296 lie Asn Gly Gly Arg Ala Glu Arg Glu Arg Val Thr Glu Leu Cys Asp 420 425 430 get gcc ttg aag get gtt cag agt gga aac ggt agt tea gca aaa gat 1344 Ala Ala Leu Lys Ala Val Gin Ser Gly Asn Gly Ser Ser Ala Lys Asp 435 440 445 ttg gac teg eta act aat caa etc aat ggt tta aag gta aaa att aac 1392
[0050] Leu Asp Ser Leu Thr Asn Gin Leu Asn Qly Leu Lys Val Ly$ Me Asn 450 455 460 taa 1395 <210^ 11 <211> 464 <212> PRT <213〉喜林草（Nemophila menziesM) <400> 11 Met Pro Ser lie Leu Ser Asn Ser Ala His lie Leu Leu Phe Pro Phe 15 10 15 Pro Thr Ser Gly His lie Me Pro Me Leu Asp Leu Ala Asn Gin Leu 20 25 30 Leu Ala Arg Gly Leu Thr Ile Thr Ile Leu Ile Thr Pro Ala Asn Leu 35 40 45 Thr Leu Leu Ser Thr Gin Leu lie Glu Leu Asp Arg Leu Gly Ser Leu 50 55 60
[0051] His Thr Leu Val Leu Pro Phe Pro Asn Pro Pro Asn Pro Ser Glu Thr 65 70 75 80 Ser Leu Ala Ala Arg Val His Ala Ser Ser Gin Leu Ser Asn Thr Ile 85 90 95 lie Gin Trp Phe Gin Ser His Thr Ser Pro Pro Val Ala lie Val Ser 100 105 110 Asp Phe Phe Leu Gly Trp Thr Asn Ser Leu Ala Ser Gin Leu Gly lie 115 120 125 Pro Arg Leu Val Phe Trp Pro Ser Gly Val Gin Arg Ser Ser Leu Val 130 135 140 Asp Tyr lie Trp Gin Asn Asp Gin Leu Ser Asp Ser Asp His Gin lie 145 150 155 160 Gin Asp Asn Ser Val lie Ser Phe Pro Asp Val Pro Asn Ser Pro Ala 165 170 175
[0052] Tyr Pro Lys Trp Gin Ala Cys Gly Leu Ser Thr Gin Tyr Lys Lys Gly 180 185 190 Asp Pro Ser Trp Glu Phe Phe Lys Asn Gly Val Leu Ala Asn Thr Gin 195 200 205 Ser Trp Gly Ala lie Tyr Asn Ser Phe Arg Asp Leu Glu Gly Val Tyr 210 215 220 lie Asp Tyr lie Lys Lys Lys Met Qly His Gly Arg Val Trp Ala Val 225 230 235 240 Gly Pro Leu Leu Pro Ala Asn Asp Ala Ser Lys Arg Gly Gly Ser Cys 245 250 255 Val Met Pro lie Asp Asp Val Met Thr Trp Leu Asp Thr Lys Thr Asn 260 265 270 Ser Asp Asn Ser Val Val Tyr Val Cys Phe Gly Ser Arg Val Glu Leu 275 280 285
[0053] Thr Thr Glu Gin Leu Asp Ser Leu Ala Ala Ala Leu Glu Ile Ser Gly 290 295 300 Val His Phe lie Leu Cys Val Lys Leu His Gin Glu lie Ser Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Glu Asp Arg Val Ala Gly Arg Gly Leu Me lie Arg Gly Trp Ala 325 330 335 Pro Gin Val Ala lie Leu Arg His Arg Ala Val Gly Ala Phe Leu Thr 340 345 350 His Cys Gly Trp Asn Ser Ile Leu Glu Gly Ile Ala Ala Gly Val Val 355 360 365 Met Leu Thr Trp Pro Met Gly Ala Asp 61n Phe Thr Asn Ala Asn Leu 370 375 380 Leu Val Asp Glu Leu Lys Val Ala Met Lys Ala Cys Glu Gly Gly Asp 385 390 395 400
[0054] Ser Asn Val Pro Asn Pro Ala Met Leu Ala Asn Val Leu Ala 61u Ser 405 410 415 lie Asn Gly Gly Arg Ala Glu Arg Glu Arg Val Thr Glu Leu Cys Asp 420 425 430 Ala Ala Leu Lys Ala Val Gin Ser Gly Asn Gly Ser Ser Ala Lys Asp 435 440 445 Leu Asp Ser Leu Thr Asn Gin Leu Asn Gly Leu Lys Val Lys lie Asn 450 455 460 <210> 12 <211> 1428 <212> DNA <213> 喜林草（Nemophilamenziesii) <220〉 <221> misc_feature <223> NmGT4 <220〉
[0055] <221> CDS <222〉 (1).. (1428) <400> 12 atg gca get cag ett cat gtt gtc ttc ttt cca ttc atg get caa ggc 48 Met Ala Ala Gin Leu His Val Val Phe Phe Pro Phe Met Ala Gin Gly 15 10 15 cac tta ata ccc acc ett gaa atg gtc aaa etc ttc tet tet cgt ggt 96 His Leu Ile Pro Thr Leu Glu Met Val Lys Leu Phe Ser Ser Arg Gly 20 25 30 ett aag acc acc ata gtc acc act aaa ttt tat get cct geg gtt aca 144 Leu Lys Thr Thr lie Val Thr Thr Lys Phe Tyr Ala Pro Ala Val Thr 35 40 45 aaa tee ata gaa aaa acc aaa cat aca gga aac caa ate aat ata att 192 Lys Ser Ile Glu Lys Thr Lys His Thr Gly Asn Gin Ile Asn lie Me 50 55 60 ate ata aaa ttc cct tet gee gag gtt gga tta ccc gaa gga tet gaa 240 lie lie Lys Phe Pro Ser Ala Glu Val Gly Leu Pro Glu Gly Ser Glu 65 70 75 80 agt etc gac aaa ctg aaa tea cct gac atg ttc atg aaa ttt ttc aag 288 Ser Leu Asp Lys Leu Lys Ser Pro Asp Met Phe Met Lys Phe Phe Lys 85 90 95
[0056] get ett tet tta tta caa gaa cca ttt gag caa ato tta caa gaa ttg 336 Ala Leu Ser Leu Leu Gin Glu Pro Phe Glu Gin Me Leu Gin Glu Leu 100 105 110 tet cct gat tgt ate gtt tet gat atg ttc ttc cca tgg act act get 384 Ser Pro Asp Cys lie Val Ser Asp Met Phe Phe Pro Trp Thr Thr Ala 115 120 125 tea get get aaa ttc gat ate ccg aga ttt gtt ttc cat ggt tta agt 432 Ser Ala Ala Lys Phe Asp Me Pro Arg Phe Val Phe His Gly Leu Ser 130 135 140 ett ttc gca ctg tgt gtt teg gag aat atg aga ttc tac aag cca ttc 480 Leu Phe Ala Leu Cys Val Ser Glu Asn Met Arg Phe Tyr Lys Pro Phe 145 150 155 160 aag aat ctg gga tet gaa tea tta gat tea gaa ccg gtc atg ttg cct 528 Lys Asn Leu Gly Ser Glu Ser Leu Asp Ser Glu Pro Val Met Leu Pro 165 170 175 gat ttc ccg aat cag att gag ttc agt aaa gtt caa gtc cct gaa ttt 576 Asp Phe Pro Asn 6ln lie Glu Phe Ser Lys Val Gin Val Pro Glu Phe 180 185 190 gaa gtt ggt gaa agt aaa aac gag ate atg gag ttg tta aat caa gtt 624 Glu Val Gly Glu Ser Lys Asn Glu lie Met Glu Leu Leu Asn Gin Val 195 200 205
[0057] aag gaa tcc gag gtt aaa age tat ggg att att ato aat agt ttt aat 672 Lys Glu Ser Glu Val Lys Ser Tyr Gly Me lie Me Asn Ser Phe Asn 210 215 220 gaa ett gag aaa gat tac gtt gat tac tat aga aac gtt tgg gga aga 720 Glu Leu Glu Lys Asp Tyr Val Asp Tyr Tyr Arg Asn Vai Trp Gly Arg 225 230 235 240 ega gca tgg ett ett ggt cct tta teg tta tet aat: ege gat gat gaa 768 Arg Ala Trp Leu Leu Gly Pro Leu Ser Leu Ser Asn Arg Asp Asp Glu 245 250 255 gta aaa gat cag aca gat gaa cac gga tet tta aaa tgg ett gat teg 816 Val Lys Asp Gin Thr Asp Glu His Gly Ser Leu Lys Trp Leu Asp Ser 260 265 270 aag aaa cca gat tea gtt att tac gta tgt ttt gga agt gta geg cct 864 Lys Lys Pro Asp Ser Val lie Tyr Val Cys Phe Gly Ser Val Ala Pro 275 280 285 tta agt agt teg caa tta cac gag att get tta gga ett gaa tet teg 912 Leu Ser Ser Ser 6ln Leu His Glu lie Ala Leu Gly Leu Glu Ser Ser 290 295 300 ggt caa cag ttc att tgg gta gtc aag gaa cgt gaa gat ggt gag aaa 960 Gly Gin Gin Phe lie Trp Val Val Lys Glu Arg Glu Asp Gly Glu Lys 305 310 315 320
[0058] tgg tta cct gaa gga ttt gag gag aga att aag gat aag gga tta ate 1008 Trp Leu Pro Glu Gly Phe Glu Glu Arg lie Lys Asp Lys Gly Leu lie 325 330 335 ata ega ggg tgg gcc cca caa gta teg att ett gaa cat gaa tet aca 1056 lie Arg Gly Trp Ala Pro Gin Val Ser Me Leu Glu His Glu Ser Thr 340 345 350 ggg ggt ttc gtg act cat tgt ggg tgg aac tea gtg etc gag get gta 1104 Gly Gly Phe Val Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Val Leu Glu Ala Val 355 360 365 tet gca ggg gta gtt atg gca aca ttg cct aca ttt geg gaa caa cct 1152 Ser Ala Gly Val Val Met Ala Thr Leu Pro Thr Phe Ala Glu Gin Pro 370 375 380 ttt aac gaa aag ctg tta aeg aaa gtt ttg aag att ggg ata cct att 1200 Phe Asn Glu Lys Leu Leu Thr Lys Val Leu Lys Ile Gly Ile Pro Ile 385 390 395 400 ggt tea cca tta teg aat aga ggt aag agt ggt gtg aaa aaa gaa gag 1248 Giy Ser Pro Leu Ser Asn Arg Gly Lys Ser Gly Val Lys Lys Glu Glu 405 410 415 ata get gag geg atg aaa ggg att atg gaa ggt gaa gaa get ett gaa 1296 Ile Ala Glu Ala Met Lys Gly Ile Met Glu Gly Glu Glu Ala Leu Glu 420 425 430
[0059] atg aga ate ega gca aag agt ttg aaa gag atg get tgg aaa get gtt 1344 Met Arg lie Arg Ala Lys Ser Leu Lys Glu Met Ala Trp Lys Ala Val 435 440 445 gaa gaa gga ggt tet tct. tat aat gat ttg act tet ttg att gat gga 1392 Glu Glu Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Asp Leu Thr Ser Leu lie Asp Gly 450 455 460 gtc aaa get tat cgt tea caa tea aac aag ata tga 1428 Val Lys Ala Tyr Arg Ser Gin Ser Asn Lys lie 465 470 475 〈210〉 13 〈211〉 475 <212> PRT 〈213〉喜林草（Nemophilamenziesii) <400〉 13 Met Ala Ala Gin Leu His Val Val Phe Phe Pro Phe Met Ala Gin Gly 15 10 15 His Leu lie Pro Thr Leu Glu Met Val Lys Leu Phe Ser Ser Arg Gly 20 25 30
[0060] Leu Lys Thr Thr lie Val Thr Thr Lys Phe Tyr Ala Pro Ala Val Thr 35 40 45 Lys Ser lie Glu Lys Thr Lys His Thr Gly Asn Gin Ile Asn lie Ile 50 55 60 lie lie Lys Phe Pro Ser Ala Glu Val Gly Leu Pro Glu Gly Ser Glu 65 70 75 80 Ser Leu Asp Lys Leu Lys Ser Pro Asp Met Phe Met Lys Phe Phe Lys 85 90 95 Ala Leu Ser Leu Leu Gin Glu Pro Phe Glu Gin Ile Leu Gin Glu Leu 100 105 110 Ser Pro Asp Cys lie Val Ser Asp Met Phe Phe Pro Trp Thr Thr Ala 115 120 125 Ser Ala Ala Lys Phe Asp lie Pro Arg Phe Val Phe His Gly Leu Ser 130 135 140
[0061] Leu Phe Ala Leu Cys Val Ser Glu Asn Met Arg Phe Tyr Lys Pro Phe 145 150 155 160 Lys Asn Leu Gly Ser Glu Ser Leu Asp Ser Glu Pro Val Met Leu Pro 165 170 175 Asp Phe Pro Asn Gin lie Glu Phe Ser Lys Val Gin Val Pro Glu Phe 180 185 190 Glu Val Gly Glu Ser Lys Asn Glu lie Met Glu Leu Leu Asn Gin Val 195 200 205 Lys Glu Ser Glu Val Lys Ser Tyr Gly lie lie lie Asn Ser Phe Asn 210 215 220 Glu Leu Glu Lys Asp Tyr Val Asp Tyr Tyr Arg Asn Val Trp Gly Arg 225 230 235 240 Arg Ala Trp Leu Leu Gly Pro Leu Ser Leu Ser Asn Arg Asp Asp Glu 245 250 255
[0062] Val Lys Asp Gin Thr Asp Glu His Gly Ser Leu Lys Trp Leu Asp Ser 260 265 270 Lys Lys Pro Asp Ser Val lie Tyr Val Cys Phe Gly Ser Val Ala Pro 275 280 285 Leu Ser Ser Ser Gin Leu His Glu lie Ala Leu Gly Leu Glu Ser Ser 290 295 300 Gly Gin Gin Phe lie Trp Val Val Lys Glu Arg Glu Asp Gly Glu Lys 305 310 315 320 Trp Leu Pro Glu Gly Phe Glu Glu Arg lie Lys Asp Lys Gly Leu lie 325 330 335 lie Arg Gly Trp Ala Pro Gin Val Ser lie Leu Glu His Glu Ser Thr 340 345 350 Gly Gly Phe Val Thr His Cys Gly Trp Asn Ser Val Leu Glu Ala Val 355 360 365
[0063] Ser Ala Gly Val Val Met Ala Thr Leu Pro Thr Phe Ala Glu Gin Pro 370 375 380 Phe Asn Glu Lys Leu Leu Thr Lys Val Leu Lys Ile Gly Me Pro Ile 385 390 395 400 Gly Ser Pro Leu Ser Asn Arg Gly Lys Ser Gly Val Lys Lys Glu Glu 405 410 415 lie Ala Glu Ala Met Lys Gly Me Met Glu Gly Glu Glu Ala Leu Glu 420 425 430 Met Arg Ile Arg Ala Lys Ser Leu Lys Glu Met Ala Trp Lys Ala Val 43b 440 445 Glu Glu Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Asp Leu Thr Ser Leu Ile Asp Gly 450 455 460 Val Lys Ala Tyr Arg Ser Gin Ser Asn Lys Me 465 470 475
【權利要求】
1. 一種多核苷酸，其特征在于，選自以下（a)?（e): (a) 多核苷酸，其由序列號1的堿基序列組成； (b) 多核苷酸，其為與由序列號1的堿基序列的互補堿基序列組成的多核苷酸在嚴謹條件下雜交的多核苷酸，且編碼具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質； (c) 多核苷酸，其編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質； (d) 多核苷酸，其編碼由序列號2的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質；及 (e) 多核苷酸，其編碼具有與序列號2的氨基酸序列有90%以上同一性的氨基酸序列，且具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質。
2. 根據權利要求1中所述的多核苷酸，其特征在于，為（a)由序列號1的堿基序列組成的多核苷酸。
3. 根據權利要求1中所述的多核苷酸，其特征在于，為（c)編碼由序列號2的氨基酸序列組成的蛋白質的多核苷酸。
4. 根據權利要求1中所述的多核苷酸，其特征在于，為（f)編碼具有與序列號2的氨基酸序列有95%以上同一性的氨基酸序列，且具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的多核苷酸。
5. 根據權利要求4中所述的多核苷酸，其特征在于，為（g)編碼具有與序列號2的氨基酸序列有97%以上同一性的氨基酸序列，且具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的多核苷酸。
6. 根據權利要求5中所述的多核苷酸，其特征在于，為（h)編碼具有與序列號2的氨基酸序列有98%以上同一性的氨基酸序列，且具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的多核苷酸。
7. 根據權利要求1?6中任一項所述的多核苷酸，其特征在于，為DNA。
8. -種蛋白質，其特征在于，由權利要求1?7中任一項所述的多核苷酸編碼。
9. 一種載體，其特征在于，含有權利要求1?7中任一項所述的多核苷酸。
10. -種非人宿主，其特征在于，轉入了權利要求9中所述的載體。
11. 一種方法，其特征在于，使用權利要求1?7中任一項所述的多核苷酸在黃酮4'位羥基上附加糖。
12. -種植物或者其后代或它們的部分或者組織，其特征在于，轉入權利要求1?7中任一項所述的多核苷酸且含有該多核苷酸。
13. 根據權利要求12中所述的植物的部分，其特征在于，為切花。
14. 一種切花加工品，其特征在于，使用權利要求13中所述的切花。
15. -種具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質的制造方法，其特征在于，包含以下工序：培養(yǎng)權利要求10中所述的非人宿主或使其生長發(fā)育，且從該非人宿主中提取具有在黃酮4'位羥基上轉移糖的活性的蛋白質。
16. -種在4'位羥基上附加糖的黃酮的制造方法，其特征在于，包含以下工序：培養(yǎng)權利要求10中所述的非人宿主或使其生長發(fā)育，且從該非人宿主中提取在4'位羥基上附加糖的黃酮。
17. -種食品，其特征在于，含有通過權利要求16中所述的制造方法制造的在4'位羥基上附加糖的黃酮。
18. -種醫(yī)藥品，其特征在于，含有通過權利要求16中所述的制造方法制造的在4'位羥基上附加糖的黃酮。
19. 一種化妝品，其特征在于，含有通過權利要求16中所述的制造方法制造的在4'位羥基上附加糖的黃酮。
【文檔編號】A61K31/7042GK104066840SQ201380005375
【公開日】2014年9月24日申請日期:2013年1月16日優(yōu)先權日:2012年1月17日
【發(fā)明者】田中良和, 興津奈央子, 松井啓祐申請人:三得利控股株式會社

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