一種白喉類毒素的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種白喉類毒素的制備方法，它包括如下步驟：(1)取白喉桿菌培養(yǎng)液，加入硫酸銨至硫酸銨的終濃度為20～24％(w/v)，離心，去除沉淀，澄清過濾；(2)加入硫酸銨至硫酸銨的終濃度為21～25％(w/v)，離心，收集沉淀；(3)將沉淀溶解后超濾，即為精制毒素；(4)取精制毒素，加入甲醛溶液，脫毒，即可。本發(fā)明方法制備的白喉類毒素純度高、單體含量高、殘余氨基含量高、效力好、毒性低、且制備工藝能規(guī)?；a(chǎn)，工藝穩(wěn)定，操作易于控制，成本低，生產(chǎn)效率高，應(yīng)用前景良好。
【專利說明】
一種白喉類毒素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物制品領(lǐng)域，具體涉及一種制備白喉類毒素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 白喉(Diphtheria)是由白喉桿菌所引起的一種急性呼吸道傳染病，以發(fā)熱，氣憋， 聲音嘶啞，犬吠樣咳嗽，咽、扁桃體及其周圍組織出現(xiàn)白色偽膜為特征。嚴(yán)重者全身中毒癥 狀明顯，可并發(fā)心肌炎和周圍神經(jīng)麻痹。
[0003]白喉毒素由白喉棒狀桿菌分泌表達(dá)，分子量約58KD，包含A、B兩個片段，B片段負(fù)責(zé) 粘附和穿透細(xì)胞，A片段具有ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，能終止蛋白合成導(dǎo)致細(xì)胞死亡。將白喉 毒素精制、脫毒制備成白喉類毒素單苗或多聯(lián)疫苗后進(jìn)行預(yù)防接種，能有效防止白喉的爆 發(fā)流行。根據(jù)疫苗不良反應(yīng)監(jiān)測，白破(DT)二聯(lián)、吸附無細(xì)胞百白破(DTaP)三聯(lián)疫苗依然存 在一定的副反應(yīng)。以DTaP為基礎(chǔ)，與b型流感嗜血桿菌疫苗(Hib)、脊髓灰質(zhì)炎疫苗（IPV)等 單苗聯(lián)合，開發(fā)能減少注射次數(shù)、具高附加值的多聯(lián)疫苗是當(dāng)前細(xì)菌性疫苗的研究熱點及 發(fā)展趨勢。隨著多聯(lián)疫苗的研發(fā)，對多聯(lián)疫苗各成分的質(zhì)量提出了更高的要求，白喉類毒素 原液的質(zhì)量也需予以更多的關(guān)注。
[0004] 毒素純度越高，雜質(zhì)含量越低，有利于降低副反應(yīng)。當(dāng)前白喉毒素的提純工藝均采 用硫酸銨鹽析純化的方法，該方法操作簡單，通量高、成本低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本專利通過硫酸銨鹽析方法實現(xiàn)了白喉毒素精制純化，但工藝過程的精細(xì)控制使 得制備的類毒素純度高、單體含量高、殘余氨基含量高，且該工藝能規(guī)?；a(chǎn)，工藝穩(wěn)定， 應(yīng)用前景好。
[0006] 本發(fā)明提供了一種白喉類毒素的制備方法以及該方法制備得到的白喉類毒素。
[0007] 本發(fā)明白喉類毒素的制備方法，它包括如下步驟：
[0008] (1)取白喉桿菌培養(yǎng)液，加入硫酸銨至硫酸銨的終濃度為20~24% (w/v)，離心，去 除沉淀，澄清過濾；
[0009] (2)加入硫酸銨至硫酸銨的終濃度為21~25%(w/v)，離心，收集沉淀；
[0010] ⑶將沉淀溶解后超濾，即為精制毒素；
[0011] (4)取精制毒素，加入甲醛溶液，脫毒，即可。
[0012] 步驟(1)中，所述白喉桿菌培養(yǎng)液的白喉毒素絮狀單位為160~200Lf/ml。
[0013] 步驟(1)中，所述離心的轉(zhuǎn)速為13000~17000轉(zhuǎn)/分鐘，優(yōu)選15000轉(zhuǎn)/分鐘。
[0014]步驟(1)中，離心采用連續(xù)流離心機(jī)離心;和/或，澄清過濾采用微孔膜筒式濾器進(jìn) 行澄清過濾。
[0015] 步驟(2)中，加入硫酸銨之前先進(jìn)行超濾，所述超濾是超濾至原體積的1/6-1/10， 超濾采用膜孔徑為10kD的超濾膜。
[0016] 步驟(2)中，所述離心的條件是4000~6000轉(zhuǎn)/分鐘，離心的時間為40~60分鐘。
[0017] 步驟（3)中，超濾至殘余硫酸銨濃度小于千分之一；超濾采用膜孔徑為lOkD超濾 膜。
[0018] 步驟（4)中，加入甲醛溶液至甲醛的終濃度為0.4~0.5% (v/v)，脫毒的溫度為 36.5~38.5°C，脫毒的時間為30~45天。
[0019]步驟(4)中，加入甲醛溶液前先對精制毒素進(jìn)行稀釋，稀釋的倍數(shù)為1.5~1.7倍， 然后加入賴氨酸，賴氨酸的終濃度為0.15~0.25% (w/v);
[0020] 本發(fā)明還提供了前述方法制備得到的白喉類毒素。
[0021] 綜上，本發(fā)明方法制備得到的白喉類毒素質(zhì)量優(yōu)良，純度在2150Lf/mgPN以上，并 且其單體含量高達(dá)90 %、殘余氨基含量高于18mo 1-NH/mo 1DT、效力好、毒性低。此外，本發(fā)明 制備方法能規(guī)?；a(chǎn)，工藝穩(wěn)定，操作易于控制，成本低，生產(chǎn)效率高，應(yīng)用前景好。
[0022] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0023] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0024]圖1 3批白喉類毒素原液280nm下HPLC分析峰型結(jié)果，三批峰圖高度重合進(jìn)一步證 明產(chǎn)品的批間一致性。
【具體實施方式】
[0025]菌株：白喉PW8株(CMCC 38007)
[0026]儀器和試劑：
[0027] 儀器:DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；1000L發(fā)酵罐，成都 英德生物工程有限公司；GQLY-125N/150N連續(xù)流離心機(jī)，遼陽陽光制藥機(jī)械有限公司； FLTR0N超濾器，日本株式會社；SAS011G23J微孔膜筒式濾器，頗爾過濾器(北京)有限公司； 超濾膜，頗爾過濾器(北京)有限公司。
[0028] 試劑：甲醛溶液，廣東光華科技股份有限公司;硫酸銨，成都市科龍化工試劑廠。
[0029] 實施例1本發(fā)明制備白喉類毒素的方法
[0030] 一、制備方法
[0031] 1.白喉培養(yǎng)
[0032] 檢定合格的白喉桿菌啟開后經(jīng)培養(yǎng)基傳代，后進(jìn)行培養(yǎng)，至得到白喉毒素絮狀單 位達(dá)160Lf/ml的培養(yǎng)液，即可。
[0033] 2.-段鹽析收集上清
[0034]培養(yǎng)液中加入硫酸銨至濃度為24% (w/v)，進(jìn)行一段鹽析，連續(xù)流離心機(jī)13000轉(zhuǎn)/ 分鐘離心去除沉淀，再經(jīng)微孔膜筒式濾器進(jìn)行澄清過濾，收集上清。
[0035] 3.二段鹽析
[0036] 上清液經(jīng)10KD超濾膜超濾濃縮至原體積的1/6,加入硫酸銨至濃度為21 % (w/v)， 進(jìn)行二段鹽析，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心60分鐘，收集沉淀。
[0037] 4 ·超濾脫鹽
[0038] 二鹽沉淀經(jīng)溶液溶解后，用10kD超濾膜超濾脫鹽至殘余硫酸銨含量小于千分之 一，即為精制毒素。
[0039] 5.脫毒
[0040] 精制毒素用注射用水稀釋1.5倍后，加入賴氨酸溶液至其終濃度為0.15% (g/ml)， 加入甲醛溶液至甲醛的終濃度為0.4% (ml/ml)，置38.5°C脫毒30天，即可。
[0041] 二、收率
[0042]經(jīng)檢測，本發(fā)明制備方法在培養(yǎng)液體積為500L的情況下，制備白喉類毒素的收率 為 54.7%〇
[0043] 實施例2本發(fā)明制備白喉類毒素的方法
[0044] -、制備方法
[0045] 1.白喉類毒素培養(yǎng)
[0046] 檢定合格的白喉桿菌啟開后經(jīng)培養(yǎng)基傳代，后進(jìn)行培養(yǎng)，至得到白喉毒素絮狀單 位達(dá)180Lf/ml的培養(yǎng)液，即可。
[0047] 2.-段鹽析收集上清
[0048]培養(yǎng)液中加入硫酸銨至濃度為20% (w/v)，進(jìn)行一段鹽析，連續(xù)流離心機(jī)15000轉(zhuǎn)/ 分鐘離心去除菌體，再經(jīng)微孔膜筒式過濾器進(jìn)行澄清過濾，收集上清。
[0049] 3.二段鹽析
[0050] 上清液經(jīng)10KD超濾膜超濾濃縮至原體積的1/8,加入硫酸銨至濃度為23% (w/v)， 進(jìn)行鹽二段析，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心50分鐘，收集沉淀。
[0051 ] 4.超濾脫鹽
[0052]超濾去除硫酸銨同實施例1。
[0053] 5.脫毒
[0054] 精制毒素用注射用水稀釋1.6倍后，加入賴氨酸溶液至其終濃度為0.2%(g/ml)， 加入甲醛溶液至甲醛的終濃度為0.45% (ml/ml)，置37°C脫毒40天，即可。
[0055] 二、收率
[0056]經(jīng)檢測，本發(fā)明制備方法在培養(yǎng)液體積為500L的情況下，制備白喉類毒素的收率 為 62.1%。
[0057]實施例3本發(fā)明制備白喉類毒素的方法 [0058] 一、制備方法
[0059] 1.白喉類毒素培養(yǎng)
[0060]檢定合格的白喉桿菌啟開后經(jīng)培養(yǎng)基傳代，后進(jìn)行培養(yǎng)，至得到白喉毒素絮狀單 位達(dá)200Lf/ml的培養(yǎng)液，即可。
[0061 ] 2.-段鹽析收集上清
[0062]培養(yǎng)液中加入硫酸銨至濃度為22% (w/v)，進(jìn)行一段鹽析，連續(xù)流離心機(jī)17000轉(zhuǎn)/ 分鐘離心去除菌體，再經(jīng)微孔膜筒式過濾器進(jìn)行澄清過濾，收集上清。
[0063] 3.二段鹽析
[0064] 上清液經(jīng)10KD超濾膜超濾濃縮至原體積的1/10,加入硫酸銨至濃度為25% (w/v)， 進(jìn)行二段鹽析，6000轉(zhuǎn)/分鐘離心40分鐘，收集沉淀。
[0065] 4 ·超濾脫鹽
[0066] 超濾去除硫酸銨同實施例1。
[0067] 5.脫毒
[0068]精制毒素用注射用水稀釋1.7倍后，加入賴氨酸溶液至其終濃度為0.25% (g/ml)， 加入甲醛溶液至甲醛的終濃度為0.5% (ml/ml)，置36.5°C脫毒45天，即可。
[0069] 二、收率
[0070] 經(jīng)檢測，本發(fā)明制備方法在培養(yǎng)液體積為500L的情況下，制備白喉類毒素的收率 為 69.4%。
[0071] 質(zhì)量檢測：
[0072] 1.按現(xiàn)行藥典方法對3個實施例白喉類毒素原液樣品進(jìn)行檢定。
[0073] 2. TNBS檢測白喉類毒素殘余氨基數(shù)量
[0074] 3. HPLC檢測白喉類毒素單體含量 [0075] 檢測結(jié)果如下表和圖1所示：
[0076]表1 3個實施例白喉類毒素原液質(zhì)量結(jié)果統(tǒng)計
[0078]由表1可知，三批白喉類毒素原液純度、單體含量、殘余氨基值均較高，批間一致性 良好。
[0079] 實驗結(jié)果證明，本發(fā)明方法生產(chǎn)出的白喉類毒素原液質(zhì)量高，不易造成接種副反 應(yīng)，更多的殘余氨基說明抗原完整性好。單體含量高、殘留氨基高有利于開發(fā)高質(zhì)量的單苗 或多聯(lián)疫苗。
[0080] 綜上，本發(fā)明方法制備的白喉類毒素質(zhì)量優(yōu)良，純度在2150Lf/mgPN以上，單體含 量高達(dá)90%，殘余氨基含量高于18m 〇l-NH/m〇l TT，且制備工藝能規(guī)?；a(chǎn)，工藝穩(wěn)定，操 作易于控制，成本低，生產(chǎn)效率高，應(yīng)用前景良好。
【主權(quán)項】
1. 一種白喉類毒素的制備方法，其特征在于： (1) 取白喉桿菌培養(yǎng)液，加入硫酸銨至硫酸銨的終濃度為20~24% (w/v)，離心，去除沉 淀，澄清過濾； (2) 加入硫酸銨至硫酸銨的終濃度為21~25% (w/v)，離心，收集沉淀； (3) 將沉淀溶解后超濾，即為精制毒素； (4) 取精制毒素，加入甲醛溶液，脫毒，即可。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(1)中，所述白喉桿菌培養(yǎng)液的白 喉毒素絮狀單位為160~200Lf/ml。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟（1)中，所述離心的轉(zhuǎn)速為13000 ~17000轉(zhuǎn)/分鐘，優(yōu)選15000轉(zhuǎn)/分鐘。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(1)中，離心采用連續(xù)流離心機(jī)離 心;和/或，澄清過濾采用微孔膜筒式濾器進(jìn)行澄清過濾。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(2)中，加入硫酸銨之前先進(jìn)行超 濾，所述超濾是超濾至原體積的1/6-1/10,超濾采用膜孔徑為10kD的超濾膜。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(2)中，所述離心的條件是4000~ 6000轉(zhuǎn)/分鐘，離心的時間為40~60分鐘。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(3)中，超濾至殘余硫酸銨濃度小 于千分之一;超濾采用膜孔徑為10kD超濾膜。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(4)中，加入甲醛溶液至甲醛的終 濃度為0.4~0.5% (v/v)，脫毒的溫度為36.5~38.5°C，脫毒的時間為30~45天。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(4)中，加入甲醛溶液前先對精制 毒素進(jìn)行稀釋，稀釋倍數(shù)為1.5~1.7,然后加入賴氨酸，賴氨酸的終濃度為0.15~0.25 % (w/v)〇10. 權(quán)利要求1~9任意一項所述方法制備的白喉類毒素。
【文檔編號】C07K1/36GK106046127SQ201610655056
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月10日 公開號201610655056.X, CN 106046127 A, CN 106046127A, CN 201610655056, CN-A-106046127, CN106046127 A, CN106046127A, CN201610655056, CN201610655056.X
【發(fā)明人】秦敏, 張飛偉, 張華 , 唐朝暉, 吳永超, 顧潔, 耿其秀
【申請人】成都生物制品研究所有限責(zé)任公司