專利名稱：轉(zhuǎn)基因植物中新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的傳感器檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)織廣增(LAMP)技術(shù)與納米硫電化學(xué)DNA傳/im^TO檢測(cè)轉(zhuǎn)基因夕卜源基m~~§ 素^^ (nptii)的方法，即轉(zhuǎn)基因植物中新霉素磷^^m因的傳 背景技術(shù)磷^^,eomycinPhosphotransferase II， NPTII)基因;i^今植tlJi^^化中鵬最為廣泛的選搟祝?？p因編碼新霉素磷,移K ^Si:g:-3,-磷,移嫩3111]110浙0)*3'*31)11011^隱11)，其編碼^M^SIf^C^教aminoglycoside angibk)tics)如卡那霉素(kanamycin^Km)、新霉素 (neomycin)、 G418纖酸化而失活?？敲辜甪tM^^m能與植物細(xì)胞贈(zèng)柳離體中的核 糖體30S小亞凝蹈合，影響70S趟^;^I的形成，干擾Bli錄體^f立體的蛋白質(zhì)合成，從而導(dǎo)雜 物細(xì)胞死亡。NPTII基因在轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因番茄、轉(zhuǎn)基因馬鈴薯、轉(zhuǎn)基因油菜中廣g用，中國(guó)國(guó) 家標(biāo)準(zhǔn)中把可以NPTII基因作為轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的^S因。ii^現(xiàn)有^1ti仿法都^S于PCR mt熒光pcr的，沒(méi)有4頓環(huán)介導(dǎo)^mr增^^測(cè)NFrn基因的，也沒(méi)有W^頓環(huán)介導(dǎo)^^增技術(shù)與納米標(biāo)己電化學(xué)DNA傳KS;^ffl檢測(cè)NPTn基因附艮導(dǎo)，且現(xiàn)有^^法#4檢 ^*高、耗時(shí)長(zhǎng) 點(diǎn)o發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的^lt糊米硫化鉛被己電化學(xué)DNA傳iife術(shù)與環(huán)介導(dǎo)^a擴(kuò)增糊檢測(cè)NPTII基因 的方法，以劃艮現(xiàn)有技術(shù) 點(diǎn)，從而為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)^ft簡(jiǎn)單靈敏的方法。本發(fā)明的頓原理為(1) ^^設(shè)it"^且可以iR5脾巴DNA六個(gè)不同序列的兩個(gè)內(nèi)弓嫩(上游內(nèi)引 物和下游內(nèi)弓卿)和兩個(gè)外弓嫩(上嫩卜引物和下嫩卜弓嫩)，內(nèi)引t^含耙DNA的!BC鏈和反義練(2)其中一個(gè)內(nèi)引牧rt先和耙DNA雜交，te的^S換DNA合 具^(guò)^度 換活性的DNA聚 娜的參與下由^t外引物啟動(dòng)，釋放出單鏈DNA，荊乍為由雜效鵬的另一端的一個(gè)內(nèi)引物和一個(gè)外 引物啟動(dòng)的DNA合^t反，產(chǎn)生一個(gè)原始的莖環(huán)DNA; (3)內(nèi)弓嫩以原始執(zhí)DNAf^，啟動(dòng)鏈 置換DNA的合成，產(chǎn)生一個(gè)原始的新DNA和一憤的由兩倍莖誠(chéng)的執(zhí)DNA; (4)在離斜牛 下，內(nèi)引物以莖環(huán)DNA為模阪，iiaSB^^成多^tWlEDNASfiJ^鵬莖環(huán)DNA，在一小時(shí)內(nèi) 該循環(huán)a^r使耙DNA累積到l(f拷貝。擴(kuò)增的^J與納^^立子標(biāo)己DNA徽電化學(xué)傳li^相結(jié)合， a3l電極表面的^T雜交和高靈i^的電化^l!啶，從而^"增^的多少轉(zhuǎn)化為電信號(hào)的測(cè)定結(jié)果。本發(fā)明的檢測(cè)^a^括以下步驟首5feafi^介導(dǎo)^r增得到擴(kuò)ms^物-新霉素磷^^sis因的雙鏈目標(biāo)序列、離m^鏈目標(biāo)序列^7K浴中熱J ^^鏈目標(biāo)序列后錢電極表面自組裝固定，艮p得到新霄素憐^t移,因的目標(biāo)序列《,電極、然后將纟|^^硫化鉛對(duì)來(lái)源 霉素磷酸轉(zhuǎn)移 因的探針靜U進(jìn)行豐新己得到^Hfl^f序列，將該^E^f"序列與目標(biāo)序列《,電豐肚的目標(biāo)序列進(jìn)行^ 雜交并進(jìn)行同位棘陽(yáng)極溶出法的電化翔啶，且環(huán)介導(dǎo)^^擴(kuò)增鵬中有(i)環(huán)介導(dǎo)^r增鵬瓶包括lOxlheimopol ^Ri^爰沖液、300—500nmoI/LdNTP、 2—4證ol/L硫,、0.8—1.2 pmol上游5內(nèi)引物、0.8—1.2jimol/L下游內(nèi)引物、0.2—0.3pmol/L上齢卜弓l物、0.2—03 nmol/L下微卜引物和l一 1.5 mol/L甜菜堿，1 U/pLUNG酶；其中l(wèi)OxThetmopol SiMi沖液含有200 mmol /LpH8.8的三羥基甲基氨 基甲烷一鹽酸、10Ommol/l氯化鉀、100mmol/l硫,、20mmoI/l硫M^和1X曲j頓x-100; 其中，上游內(nèi)引物5-CTGATAGCGGTCCGCCACACGGAAAATGGCCGCTnTCTG-3 、下游內(nèi)引物5隱ACATAGCGTrGGCTACCCGTGAGCGATACCGTAAAGCACGAG墨3、 上齢卜弓l物5-TGCTTGCCGAATArCATGGT-3 、 下齡卜弓慨5"CGATAGAAGGCGATGCGC-3;(2) BstDNA聚銻8U/nL 。上述的dNTP內(nèi)的四種I^t糖M的質(zhì)量比為dUTP:dATP:dGTP:dCTP=2:l:l:l。 戰(zhàn)環(huán)介導(dǎo)離擴(kuò)增(LAMP)鵬液每管23 nL的劇趙5^J: 2.5 pL lOxTh畫pol鵬劍液、 1.0 nL 1Ommol/L dNTP (四種脫ft^糖核酸的混彌)、1.020 pmol/L上游內(nèi)引物(FIP)、 1.0 pL 20 Mmol/L下游內(nèi)引物(BIP)、 0.25^L20nmol/L上微卜弓嫩(F3)、 0.25ML20Mmol/L下微卜弓卿(B3)、 0.5pL100mmol/LMgSO4、 12.5^2^4甜|^口4&細(xì)20 (滅菌雙蒸水)。(3) 納米硫化鉛(PbS)撒序列硫液，其制備方法如下將8.0-13.0 mL驢乙働瞎iJ 50.0mL濃度為02"0.5mmol/l的石B^IS (Pb(NO3)2)溶液中混合均勻， 用0.4^0.6 mol/L Sft化鈉(NaOH)溶液調(diào)節(jié)混合液的pHit^勺為7,通氮?dú)怊?0-45min后，在to i^^和氮?dú)鈌跌下向戰(zhàn)混合液中緩慢滴加1.2-1.6 mmo]/L的硫化鈉(NAS)溶液30.0mL。滴加完畢后， ^^20"30h,混合,fttfe^f色，即可得到納米PbS溶膠。取5.0mL納米PbS溶麟心純化， 水te分散于2.0raL水中，加入100mL40."0.0mmol/L乙教3-二甲基氨S^二鵬MS (EDC)、 100 nL 40.,.0 mmoI/L N-羥基琥珀酰亞胺(NHS )及0.1 mmol/L ssDNA探針序列 (5'-CTCCGCGGCGAGCTAA-3')，室溫下Jtft 15-20 h，該鵬鵬10000 r/minT^心2(M0 min，用 磷膨爰沖溶液(PBS)洗滌多次，再分散于PBS溶液中，f薛晗有豐斜己^f麻啲納米PbS-^^序列 標(biāo)己液，于-2°0下保剤寺用。(4) NPTII基因單鏈目標(biāo)序列錢電極表面的固定 將金電極在^!R比為3:7的30n雙tt7j^口濃,階混合溶液中力口熱5min，以除去有tT^質(zhì)；然后將談金電鵬0.05nm的三割仁鋁(Al2Oj)懸濁Wfc，鶴依次在翻、乙醇、二次蒸餾水中超聲洗 漆Mmin，般電極表面^)t滑鏡面，然JggA8.(M4.0mmol/L織乙酸溶液中，室溫下^^碟10-15 h，取出后用大*7乂浸泡沖洗，艮隙至喊基乙酸自組SM,的金電極(SAM/Au);將NPTII基因的擴(kuò) 增，雙鏈目標(biāo)序列在IOO 'C7jC浴中煮沸10溯，然后在冰浴中'^I7賴時(shí)薛IJNPTII基因單鏈目標(biāo)摔 歹lj;將SAM/Au電極ftA含4.0"6.0腿ol/L乙S(3-二甲基氨l^)^二Wa離(EDC)禾n8,0mmol/L N-^^珀M安(NHS)的PBS溶液中活化30min，然后ftX含有NPTlI基因單鏈目標(biāo)序列的PBS緩 沖液(pH7.4)中，25T保存12h，取出電卞版用縫PBS沖冼除去未固定的NFni基因單鏈目標(biāo)序 歹!)，就可以得到固魏NPTII基因單鏈目標(biāo)序列制,電極(ssDNA/SAM/Au)。(5) 上逝斷布電極上固定的>^11基因單鏈目標(biāo)序列與納米？&3- Mf序列標(biāo)己液中的標(biāo)己^^序 列的雜頓進(jìn)行電化翔J定將固定了^11基因單鏈目標(biāo)序列糊,電豐^^內(nèi)米？68- W"序列iHB液中，40T水浴中反應(yīng) 30-50min，自鋭糊，取出后用含0.1%十二^i^, SDS的磷,沖溶液(PBS)浸泡并鵬電極， 除去未雜交的標(biāo)己微序列；用150ML1.0mol/LHNO3溶解金電極表面的納米硫化鉛(PbS) "min， 將所ff^^至3mL醋,(NaOAoHOAc)緩沖溶液中(pH=4.7，含1.8xl()4mol/LHg^)。以玻碳電 極為工作電極，NaOAoHOAc為電解質(zhì)，細(xì)同位,陽(yáng)極溶出法測(cè)定釋放出的Pb2、子，以七.84V處 的陽(yáng)極溶出峰為測(cè)量信號(hào)，電化學(xué)工作站的^^[如下傷麥、時(shí)間300 s，傷3只電位-l.lV，電位增量 0.004 V，振幅0.05V，脈沖驢0.06s，采樣寬度0.02s，脈沖周期0.25。娜戰(zhàn)施檢測(cè)轉(zhuǎn)基因外源基因NPTII驗(yàn)法，依次包括下列步戰(zhàn)l)-(3):(1) 待檢樣品DNA的提恥^頓樣品核酸，提取方法不限定，只要會(huì)^^iffi^取的DNAOD260/280軎瀕超iJl.6"2.0即可，濃 鵬U 10-100 ng/nL就可以。即提取待檢樣品DNA作為環(huán)介導(dǎo)#^擴(kuò)增鵬6^，其中提取樣品DNA 的OEbeo280在1.6"2.0范圍內(nèi)，lO-lOOng/^L范圍內(nèi)；(2) 進(jìn)行NPTII基因環(huán)介導(dǎo)^W增:鵬A_ 23jiL LAMP ^^液的鵬管中力口入1mL待檢樣品,DNA，和0.5pL的UNG酶，于恒船K浴上50。C體3min，于恒溫95 。C體3—5min，立即置于冰上1 —3 min;B. 在鵬管中加入lpLBstDNA聚彌；C. 于恒溫60—65。C腿45—90min;D. 將離調(diào)到80—95 。C，鵬3—5min后中l(wèi)hgm薛杯介導(dǎo)^W"增鵬的NPTlI基因雙鏈目 標(biāo)序列擴(kuò)增，的雙鏈目標(biāo)序列，取出待用。(3) NPTn基因單鏈目標(biāo)序列錢電極表面的固定 將J^M導(dǎo)NPTII基因雙鏈目標(biāo)序列擴(kuò)增，的雙鏈目標(biāo)序列在100 。C7K浴中薪弗10溯，然后在冰浴中'^I74^P得到NPTI1基因單鏈目標(biāo)序列(目標(biāo)ssDNA)，將SAM/Au電極^A含4.0^6.0 mmol/L EDC和目標(biāo)ssDNA的MES緩沖液中20-30 保存15-25 h，取出電豐鵬贈(zèng)PBS沖冼5 min除去為固 定的目標(biāo)ssDNA，即得到固定有目標(biāo)ssDNA的修飾電極(ssDNA/SAM/Au)。(4) ，的納米PbS"W"序列fei己液中附giamf序列與固定^hM電feJl的目標(biāo)ssDNA雜交得 到納賴射己微-目敏鏈腿固定了目標(biāo)ssDNA的^W電卞誠(chéng)JCAMf序列^HB液中，40^水浴中SiS30"50min，自然冷卻，取 出后用含0.1%808的？88浸泡并沖冼電極，除去未雜交的豐莉己探針序列，即得到納賴斜^N目標(biāo) 雙鏈DNA。(5) iH己TO"-目標(biāo)觀鏈DNA的電化^il定用150pL1.0mol/LHNO3溶解金電極表面上的^iB微-目標(biāo)觀鏈DNA上的納米硫化鉛(PbS)冬8 min，將戶屑離鵬至3mL酉t^k緩沖溶液(NaOAoHOAc)中(pH=4.7，含1.8xl()4mo]/LH^+)。以 電極為工作電極，NaOAc-HOAc為E^f質(zhì)，，同位,陽(yáng)極溶出法測(cè)定釋放出的Pb,子，以-0.84 V處的陽(yáng)極溶出峰為測(cè)量信號(hào)，i^號(hào)即為電化^^測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中新霉素磷^^l^因的依據(jù)，電 化學(xué)工作站的實(shí)^#1^口下沉積時(shí)間300s，沉積電位-UV，電位增量0.004^振幅0,05V，脈沖寬 度0.06s，采樣寬度0.02s，脈沖周期0,2s。
具體實(shí)施方式
下列^M例進(jìn)"^i兌明本發(fā)明，但不應(yīng)當(dāng)作對(duì)本發(fā)明的限制。 鄉(xiāng)例l按下歹鵬方制作納米PbS-徽序歹訴斜激(i)鄉(xiāng)脒PbS5(Wf序列的硫?qū)?1.0 mL統(tǒng)基乙,瞎U 50.0 mL濃度為0.4 mmol/L的Pb(NO3)2溶液中混合均勻,用0.5 mol/LNaOH 溶液調(diào)節(jié)混合液的pHf^勺為7，通氮?dú)饩€30 min后，在m^TF向J^混合液中緩漫滴加1.5 mmol/L 的Na2S溶液30,0mL (氮?dú)馕?。滴加完畢后，懇 ^24 h，混合^M郝i^^色。i^^鄉(xiāng)恪 的PbS量子點(diǎn)具有良好的穩(wěn)定性。取5.0mLPbS納米溶麟'C^6化，7Kte分散于2.0mL水中，加入100 mL50.0mmol/LEDC、 100 pL 50.0 mmol/LNHS及0.1 mmoI/L^tf"序列，室溫下,18h， i^g^鵬10000 r/minTM心30 min，用 PBS溶液洗滌多次，再分散于PBS溶液中，f薛糊米PbS-微序列fei己液，于-2T下保存。按照以下辦進(jìn)微測(cè)(1) 樣品DNA的提取GBT 19495.3-2004方S^取樣品的DNA。(2) 進(jìn)行轉(zhuǎn)基因5^t (品系MON802)的NPTn基因環(huán)介導(dǎo)^UT增目A. ^^23^1^\^/5^液八的/5^管中力口入1^待檢繊DNA，和0,5nLUNG酶，于度溫 7jC浴上50。C腿3mJn, 95。C方爐5min，立即置于冰上1 min;B. 在ffi管中力口入1 pLBstDNA聚彌；C. 于H^7jc浴上65 。C體1小詠D. 將水浴調(diào)到80。C，鵬3min后中止Si^取出鵬管，艮P得到環(huán)介導(dǎo)^a擴(kuò)增鵬的NPTII基 因WT增，的雙鏈目標(biāo)序列，將其^A4t:恒溫待用。(3) NPTII基因單鏈目標(biāo)序列在金電極表面的固定 將將金電極在^f只比為3:7的30。/。雙^7KfP濃自的混合溶液中加熱5min，以除去有l(wèi)fl^質(zhì)；然后將金電豐細(xì)0.05拜的^203懸濁 ^， ^ 依次在翻、乙醇、二次蒸tg7jC超聲2min'《臉電極表 面)t^t^面，然后mAl0.0mmol/l驢乙e^液中，室溫下ii^iS裝12h，取出后用^MtK浸泡沖 洗，即得到巰基乙醇自組SJK,的金電極(SAM/Au)。將環(huán)介導(dǎo)^^廣增鵬的NPTlI基因^r增產(chǎn)物的雙鏈目標(biāo)序列在ioo 。C7jc浴中^^io溯，然后在冰浴中'l^i辨卩得到NFrn基因單鏈目標(biāo)膀U(目標(biāo)ssDNA)，將SAM/Au電極MA含5.0mmol/LEDC和目標(biāo)ssDNA的MES緩沖液中25^保存18 h,取出電f細(xì)娃PBS沖洗5 min除去未固定的目標(biāo)ssDNA，即得到ssDNA/SAM/Au。(4) 納米PbS"Mf序列iHB液中,射己^^序列與固定^hM電ai:的目標(biāo)ssDNA雜効穀嗍米 標(biāo)WN目敏鏈DNA:將固定了目標(biāo)ssDNA飾,電fe&jCAW"序列feiB液中，40 t7K浴中鵬40min，自然冷卻，取 出后用含0.1% SDS的PBS浸泡并沖洗電極，除去未雜交WiH己Mf序列，即得到納賴^3 ^-目標(biāo) 雙鏈DNA。(5) 納米inamt"-目標(biāo)改鏈DNA的電化^i啶用150 pL 1.0 mol/LHNOa溶解金電極表面上固定的納*1射己 -目fe5^鏈DNA上的納彩內(nèi)米PbS85min，將所^^^^至3mL醋^i沖溶液中(pH=4.7，含1.8xl04mol/LHg^)。以繊電極為工作電 極，NaOAc-HOAc為^l 質(zhì)，細(xì)同位織陽(yáng)極溶出法測(cè)定釋放出的Pb2、5以力.84 V處的陽(yáng)極溶出 峰為測(cè)量信號(hào)，謝言號(hào)即為電化^^測(cè)出轉(zhuǎn)基因植物中NFrlI基因的依據(jù)，電化學(xué)工作站的實(shí)^##*口 下^OR時(shí)間300s， ^^只電位-UV,電位增量0.004 V，振幅0.05V，脈沖驗(yàn)0.06s，采樣寬度0.02s， 脈沖周期0,2s?？椑?按下列方法進(jìn)fi^內(nèi)米硫化鉛t斜己電化學(xué)DNA傳感技術(shù)與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增TO檢測(cè)轉(zhuǎn)基因番茄 (Zeneca)夕卜鵬因NPTII:(1) LAMP鵬膝含有15ML10xTliennopol^gi^l沖液、1.0ML10mmol/LdNTP、 1.0ML20Mmol/L上游內(nèi)引物(F1P)、 1.0ML20Mmol/L下游內(nèi)引物(BIP)、 0.25^L20pmol/L上嫩卜引物(F3)、 0.25pL20Mmol/L下齢卜引物 (B3)、 0.5ML100訓(xùn)ol/LMgSO4、 12單2moI/L甜麯、1 U4iLUNG,B4jjLddH20 (頓職水)。 其中戶腿的上游內(nèi)引物、下游內(nèi)引物、上微卜引物、下微卜引物同上。 ，dNTP內(nèi)的四種脫ftt亥糖核酸的混^tl的質(zhì)量比為dUTP:dAIP:dGTP:dCTP= 2:1:1:1。(2) ; BstDNA聚鏑8U/mL; 按照以下辦進(jìn)行艦(1) 樣品DNA^JI取{頓GBT 19495.3-2004方^l取樣品的DNA。(2) 進(jìn)行NPTlI基因環(huán)介導(dǎo)^r增鵬A 23mL LAMP aS液的a^管中力口入1mL待檢豐鎌DNA，和0.5mL的UNG酶，亍直溫水浴上50。C廳3min， 95。C體5min，立即置于冰上lmin;B. 在M^管中力口入lnLBstDNA聚娜；C. 于恒船X浴上65。C總1 h;D. 將7K浴調(diào)到80'C，鵬3min后中l(wèi)h&^取出^&m管，即得至杯介導(dǎo)^a擴(kuò)增鵬的NPTII基 因的擴(kuò)增，的雙鏈目標(biāo)序列，將其駄4。C恒溫待用。(3) NPTII基因在金電極表面的固定 將金電極在體積比為3:7的30y汲ft7jO]濃硫酸的混合溶液中加熱5min，以除去有IH^質(zhì)；然后將金電豐細(xì)0.05Mm的Al2Q3懸濁M^;， ^*依次在翻、乙醇、二^^餾7爐聲2min， 4臉電極表面 ;滑鏡面，然JgMAl0.0mmol/L驢乙ll^液中，室溫下Wia裝12h，取出后用^M7K浸泡沖冼， 即得到統(tǒng)基乙醇自組^^,的金電極(SAM/Au)。將環(huán)介導(dǎo)^W增鵬的NPTII基因的擴(kuò)增產(chǎn)吻的 雙鏈目標(biāo)序列在100 。C7K浴中蕭弗10姚然磁冰浴中鵬糊得到贈(zèng)II基因單鏈目標(biāo)序列(目 標(biāo)ssDNA)，將SAM/Au電極^A含5.0 mmol/LEDC和目標(biāo)ssDNA的MES緩沖液中251保存18 h， 取出電禾鵬^PBS沖冼5 min除去未固定的目標(biāo)ssDNA，艮時(shí)導(dǎo)到ssDNA/SAM/Au。(4) 納米PbS，序列feia液中辦^iaW"序列與固定&i^電fei:的目標(biāo)ssDNA雜交得至糊米將固定了目標(biāo)ssDNA附,電tMAW"序列iHa液中，40匯7]C浴中，40min，自然冷卻，取出后用含0.1% SDS的PBS浸泡并沖冼電極，除去未雜交的fei己^f序列，即得到納*)^己 ^-目標(biāo) 雙鏈DNA。(5) ^t私己^N目標(biāo)雙鏈DNA的電化翔啶 用150pL l.Omol/LHNQj溶解金電極表面上固定的納^iHSMI"-目標(biāo)汲鏈DNA上的納^l米PbS 5min，將^W^赫至3mL^^I沖溶液中(pH=4.7，含1.8xl04mo]/LHg^)。以 電極為工作電 極，NaOAoHOAc為柳質(zhì)，細(xì)同位線陽(yáng)極溶出法測(cè)定釋放出的Pb2^子，以4.84V處的陽(yáng)極溶出 峰為測(cè)量信號(hào)，謝言號(hào)即為電化^t測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中新霉素磷^^移ltt因的依據(jù)，電化學(xué)工作站的實(shí) 3^^下^f只時(shí)間300s， 、Kf只電位-l.lV,電位增量0.004 V，振幅0.05V，脈沖ffi0.06s，采樣 離0.02s，脈沖周期0,2s。核苷,列表<110>山東出入境檢驗(yàn)檢疫局1t驗(yàn)^S技術(shù)中心<120>轉(zhuǎn)基因植物中新霉素磷酸轉(zhuǎn)移 因的傳 ^測(cè)方法<160>4<210>1<211>40<212>DNA<213> Al序列<221> prim—bind<222>(1)."(40)<400>1ctgatagcgg tccgccacac ggaaaatggc cgcttttctg 40<210>2〈11>42<212>DNA<213> AX序列<221> prim—bind<222>(1)...(42)<400>2acatagcgtt ggctacccgt gagcgatacc gtaaagcacg ag 42<210>3 <211>20 <212>DNA <213> AI序列<221>prim_bind<222>(1》..(20)<400>3tgcttgccga atatcatggt 20<210>4 <211> 18 <212>DNA <213> AI序列 <221> prim一bind <222>(1)...(18) ,0>4cgatagaagg cgatgcgc 18<210>5<211>21《12>DNA<213> AI序列<221> prim—bind《22>(1》..(21)<400>5Agcgataccg taaagcacga g 2權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因植物中新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的傳感器檢測(cè)方法，其特征在于該方法有以下步驟環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)得到擴(kuò)增反應(yīng)物-新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的雙鏈目標(biāo)序列、以及將該雙鏈目標(biāo)序列在水浴中熱解成單鏈目標(biāo)序列后在金電極表面自組裝固定，即得到新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的單鏈目標(biāo)序列修飾電極、然后將納米硫化鉛對(duì)來(lái)源于新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的探針序列進(jìn)行標(biāo)記得到標(biāo)記探針序列，將該標(biāo)記探針序列與目標(biāo)序列修飾電極上的目標(biāo)序列進(jìn)行分子雜交并進(jìn)行陽(yáng)極溶出法的電化學(xué)測(cè)定，所得電化學(xué)信號(hào)即為電化學(xué)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的依據(jù)，且其中環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)中有(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液包括10×Thermopol反應(yīng)緩沖液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸鎂、0.8-1.2μmol上游內(nèi)引物、0.8-1.2μmol/L下游內(nèi)引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜堿，1U/μL UNG酶；其中10×Thermopol反應(yīng)緩沖液含有200mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和1％曲拉通X-100；其中，上游內(nèi)引物5-CTGATAGCGGTCCGCCACACGGAAAATGGCCGCTTTTCTG-3、下游內(nèi)引物5-ACATAGCGTTGGCTACCCGTGAGCGATACCGTAAAGCACGAG-3、上游外引物5-TGCTTGCCGAATATCATGGT-3、下游外引物5-CGATAGAAGGCGATGCGC-3；(2)Bst DNA聚合酶8U/μL。
2. 如權(quán)利要求1中所述的轉(zhuǎn)基因植物中新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的傳感器檢測(cè)方 法，其特征是上述的dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的質(zhì)量比為 dUTP:dATP:dGTP:dCTP=2:1:1:1。
3. 如權(quán)利要求1中所述的轉(zhuǎn)基因植物中新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的傳感器檢測(cè)方 法，其特征是上述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)依次包括下列步驟(1) 待檢樣品DNA的提取提取待檢樣品DNA作為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的模板，其中提取樣品DNA的光密 度值OD260/280在1.6-2.0范圍內(nèi)，濃度在10-100 ng/^L之內(nèi)；(2) 進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)A. 在裝有23pLLAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入1 上述的待檢樣品模板DNA， 恒溫50 。C放置3 min后于于恒溫95 。C放置3 — 5min，立即置于冰上l一3min;B. 在反應(yīng)管中加入lpLBstDNA聚合酶；C. 于恒溫60 — 65 。C放置45 — 90 min;D. 將溫度調(diào)到80 — 95 °C，反應(yīng)3 — 5min后中止反應(yīng)得到新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 雙鏈目標(biāo)序列擴(kuò)增產(chǎn)物的雙鏈目標(biāo)序列，取出待用。
4. 如權(quán)利要求1中所述的轉(zhuǎn)基因植物中新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的傳感器檢測(cè)方 法，其特征是上述的得到新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因雙鏈目標(biāo)序列擴(kuò)增產(chǎn)物的雙鏈目標(biāo)序 列在水浴中熱解成新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因單鏈目標(biāo)序列后在金電極表面自組裝固定 的步驟將金電極在體積比為3:7的30%雙氧水和濃硫酸的混合溶液中加熱5 min，以除去 有機(jī)雜質(zhì)；然后將其金電極用0.05pm的三氧化二鋁懸濁液拋光，接著依次在丙酮、 乙醇、二次蒸餾水中超聲洗滌l-4min，使金電極表面成光滑鏡面，然后浸入8.0-14.0 mmol/L巰基乙酸溶液中，室溫下避光組裝10-15 h，取出后用大量水浸泡沖洗，即得 到巰基乙酸自組裝膜修飾的金電極；然后將新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因雙鏈目標(biāo)序列擴(kuò)增 產(chǎn)物的雙鏈目標(biāo)序列在100 'C水浴中煮沸IO分鐘，然后在冰浴中快速冷卻得到新霉 素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的單鏈目標(biāo)序列；將上述巰基乙酸自組裝膜修飾的金電極浸入含 4.0-6.0 mmol/L乙基(3-二甲基氨丙酸)碳二亞胺鹽酸鹽和8.0 mmol/L N-羥基琥珀酰亞 胺的磷酸鹽緩沖溶液中活化30 min，然后浸入含有單鏈目標(biāo)序列的pH 7.4的磷酸鹽緩 沖液中，25。C保存12 h，取出電極后用大量磷酸鹽緩沖溶液沖洗5min除去未固定的 新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的單鏈目標(biāo)序列，即得到固定有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的單鏈目標(biāo)序列修飾電極。
5. 如權(quán)利要求1中所述的轉(zhuǎn)基因植物中新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的傳感器檢測(cè)方 法，其特征在于上述的納米硫化鉛對(duì)來(lái)源于新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的探針序列進(jìn)行標(biāo) 記得到納米硫化鉛-探針序列標(biāo)記液，其步驟如下將8.0-13.0 pL巰基乙酸加到50.0mL濃度為0.2-0.5 mmol/L的硝酸鉛溶液中混合 均勻，用0.4-0.6 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)混合液的pH值約為7，通氮?dú)獬?0- 45min 后，在磁力攪拌和氮?dú)獗Ｗo(hù)下向上述混合液中緩慢滴加1.2-1.6 mmol/L的硫化鈉溶液 30.0 mL，滴加完畢后，繼續(xù)攪拌20-30 h，混合液逐漸地變成棕色，即可得到納米硫 化鉛溶膠。取5.0mL納米硫化鉛溶膠離心純化，水洗后分散于2.0mL水中，加入100 40.0-60.0 mmol/L乙基(3-二甲基氨丙酸)碳二亞胺鹽酸鹽、100 pL 40.0-60.0 mmol/L N-羥基琥珀酰亞胺及0.1 mmol/L ssDNA探針序列5'-CTCCGCGGCGAGCTAA-3'，室 溫下攪拌15-20 h，該反應(yīng)物在10000 r/min下離心20-40 min，用磷酸鹽緩沖溶液洗滌 多次，再分散于磷酸鹽溶液中得到含有標(biāo)記探針序列的納米硫化鉛-探針序列標(biāo)記液， 于-2 。C下保存待用。
6.如權(quán)利要求1中所述的轉(zhuǎn)基因植物中新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的傳感器檢測(cè)方 法，其特征是上述的納米硫化鉛-探針序列標(biāo)記液中的標(biāo)記探針序列與單鏈目標(biāo)序列修 飾電極上的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的單鏈目標(biāo)序列進(jìn)行分子雜交并進(jìn)行同位鍍汞陽(yáng) 極溶出法的電化學(xué)測(cè)定，其步驟如下將固定有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的單鏈目標(biāo)序列修飾電極放入納米硫化鎘-探針 序列標(biāo)記液中，40 。C水浴中反應(yīng)30-50 min，自然冷卻，取出后用含0.1%十二烷基硫 酸鈉的磷酸緩沖溶液磷酸鹽緩沖溶液浸泡并沖洗電極，除去未雜交的標(biāo)記探針序列； 用150 1.0 mol/L HN03溶解金電極表面的納米硫化鉛4-8 min，將所得溶液移至3 mLpH4.7的含1.8xl()4mol/L汞離子的醋酸鹽緩沖溶液中，以玻碳電極為工作電極， 醋酸鹽緩沖溶液為電解質(zhì)，采用同位鍍汞陽(yáng)極溶出法即可測(cè)定出上述溶液中的鉛離 子，所得的電化學(xué)信號(hào)即為電化學(xué)檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因植物中新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的依 據(jù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因植物中新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的傳感器檢測(cè)方法，其特征是該方法包括以下步驟環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增得到擴(kuò)增反應(yīng)物-新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的雙鏈目標(biāo)序列、將該雙鏈目標(biāo)序列在水浴中熱解成單鏈目標(biāo)序列后在金電極表面自組裝固定，即得到新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的目標(biāo)序列修飾電極、然后將納米硫化鉛對(duì)來(lái)源于新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的探針序列進(jìn)行標(biāo)記得到標(biāo)記探針序列，將該標(biāo)記探針序列與目標(biāo)序列修飾電極上的目標(biāo)序列進(jìn)行分子雜交，并進(jìn)行同位鍍汞陽(yáng)極溶出法的電化學(xué)測(cè)定，檢測(cè)出相應(yīng)的鉛離子，其優(yōu)點(diǎn)是快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高而且使用方便。
文檔編號(hào)G01N27/327GK101260440SQ20081009398
公開日2008年9月10日 申請(qǐng)日期2008年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月25日
發(fā)明者劉彩霞, 偉 孫, 敏 孫, 奎 焦, 高宏偉 申請(qǐng)人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心