本發(fā)明屬于酶的基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種細(xì)胞表面展示PET分解酶的重組大腸桿菌及構(gòu)建及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

當(dāng)今塑料制品由于其廉價便捷的特性，廣泛使用于工業(yè)生產(chǎn)和日常生活中，在為我們提供方便的同時也帶來了嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。其中聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)是一種重要的塑料制品，如生活中常見的許多種飲料瓶都含有PET。

2016年3月日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌Ideonella sakaiensis可以利用PET作為主要的碳源和能源。該菌株可以產(chǎn)生一種能夠催化分解PET生成乙二醇(TPA)、對苯二甲酸(MHET)以及(2-羥乙基)對苯二甲酸的分解酶，稱聚對苯二甲酸乙二醇酯分解酶(PETase)。這也是人類歷史上第一次在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)能分解PET的分解酶。該分解酶與傳統(tǒng)的能分解PET的脂肪酶和角質(zhì)酶不同，它的酶促反應(yīng)比較溫和，不需要高溫即可進行有效的酶促反應(yīng)，且該酶的PET分解效率相較其它PET分解酶較高。但由于野生菌株產(chǎn)酶能力有限、生長周期長和降解速率慢，極大地限制了該酶的推廣應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種細(xì)胞表面展示PET分解酶的重組大腸桿菌。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種細(xì)胞表面展示PET分解酶的重組大腸桿菌的構(gòu)建。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種細(xì)胞表面展示PET分解酶的重組大腸桿菌的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

細(xì)胞表面展示PET分解酶的重組大腸桿菌的構(gòu)建，包括如下步驟：

(1)化學(xué)合成錨定蛋白基因，化學(xué)合成如SEQ ID No.1所示的PETase基因；

(2)利用PCR將錨定蛋白基因的核苷酸序列和PETase基因的核苷酸序列連接，得到融合序列；

(3)將融合序列連接到大腸桿菌表達載體pET22b上，得到融合表達載體；

(4)將融合表達載體轉(zhuǎn)入表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)中，得到細(xì)胞表面展示PET分解酶的重組大腸桿菌。

所述錨定蛋白基因為SEQ ID No.2所示的inaK-N、SEQ ID No.3所示的Lpp-OmpA、SEQ ID No.4所示的BrkA或SEQ ID No.5所示的AIDA。

上述構(gòu)建方法構(gòu)建的細(xì)胞表面展示PET分解酶的重組大腸桿菌。

上述細(xì)胞表面展示PET分解酶的重組大腸桿菌在全細(xì)胞催化分解PET的用途。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的構(gòu)建將目的蛋白具有PET降解功能的PETase，通過inaK-N、BrkA、AIDA或Lpp-OmpA錨定蛋白定位到細(xì)胞表面，并具有生物催化活性高的特點，解決了野生菌株產(chǎn)PETase能力有限、生長周期長和降解速率慢的問題，且酶無需分離純化，其制備方法和使用都很簡單。

附圖說明

圖1為重組細(xì)胞組分的Western blot分析圖；

其中圖1-1為BL21/pET22bNP細(xì)胞組分的Western blot分析圖；

圖1-2為BL21/pET22bLOP細(xì)胞組分的Western blot分析圖；

圖1-3為BL21/pET22bBP細(xì)胞組分的Western blot分析圖；

圖1-4為BL21/pET22bAP細(xì)胞組分的Western blot分析圖。

圖2為重組細(xì)胞組分的免疫熒光顯微鏡照片；

其中圖2-1為BL21/pET22bNP細(xì)胞組分的免疫熒光顯微鏡照片；

圖2-2為BL21/pET22bLOP細(xì)胞組分的免疫熒光顯微鏡照片；

圖2-3為BL21/pET22bBP細(xì)胞組分的免疫熒光顯微鏡照片；

圖2-4為BL21/pET22bAP細(xì)胞組分的免疫熒光顯微鏡照片；

圖3為全細(xì)胞催化酶活測定。

具體實施方式

本發(fā)明所涉及的四個錨定蛋白基因序列來自Genbank。

pET22b市售。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。

實施例1：細(xì)胞表面展示PET分解酶的重組大腸桿菌(BL21/pET22bNP)的構(gòu)建及應(yīng)用

化學(xué)合成錨定蛋白如SEQ ID No.2所示的inaK-N基因，化學(xué)合成如SEQ ID No.1所示的PETase基因；

以inaK-基因序列和PETase基因序列為模板設(shè)計引物。

上游引物inaK-NF1 5’GGAATTCCATATGACACTTGATAAGGCGC 3’(劃線部分為NdeI酶切位點)

下游引物inaK-NR1 5’ATAAGGATTGGTTTGAGTCTGTAAGTTCTGAGGGG 3’

上游引物inaK-NF2:5’CAGAACTTACAGACTCAAACCAATCCTTATGCCC 3’

下游引物inaK-NR2:5’CCCTCGAGGCTACAGTTGGCGGTACGA 3’(劃線部分為XhoI酶切位點)

以人工合成的inaK-N基因和PETase基因為模板進行PCR擴增獲得目的基因inaK-N和PETase。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸2min；34個循環(huán)后72℃保溫10min。將PCR產(chǎn)物跑膠驗證，回收目的條帶。

overlap PCR：加入等質(zhì)量的inaK-N和PETase PCR產(chǎn)物，反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸2min；12個循環(huán)后72℃保溫10min。

第三輪PCR以第二輪overlap產(chǎn)物為模板，擴增目的基因inaK-N-PETase。反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30sec；53℃退火30sec；72℃延伸3min；22個循環(huán)后72℃保溫10min。將PCR產(chǎn)物跑膠驗證，回收目的條帶(inaK-N基因的核苷酸序列和PETase基因的核苷酸序列連接后的融合序列)。

PCR純化產(chǎn)物經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收目的片段，再與經(jīng)過同樣酶切處理過的表達載體pET-22連接構(gòu)建質(zhì)粒pET22bNP，4℃過夜。取10μL連接產(chǎn)物pET22bNP轉(zhuǎn)化到100μlEscherichia coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含Amp的LB固體平板上，37℃溫箱培養(yǎng)13h，從轉(zhuǎn)化板上挑取幾株單菌落，接種于5ml含有100μg/mL氨芐抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃快速振蕩12h。取600μL菌液加入400μL甘油混勻凍存，并用剩余菌液提取質(zhì)粒送Genewiz公司測序，從而獲得重組質(zhì)粒pET22bNP。

將測序正確的pET22bNP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到100μl大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布與含氨芐抗性的LB固體平板上，37℃溫箱培養(yǎng)13h，從轉(zhuǎn)化板上挑取單克隆菌落，從而獲得細(xì)胞表面展示PET分解酶的重組大腸桿菌BL21/pET22bNP，簡稱BL21/pET22bNP重組大腸菌株。

Western blot:

取BL21/pET22bNP重組大腸菌株200μl，離心去上清，加20μl培養(yǎng)基重懸，加4μl6×loading buffer。100℃加熱15min。

SDS-PAGE上樣后恒流跑膠

轉(zhuǎn)膜：順序為1層海綿2層濾紙蛋白膠硝酸纖維素膜2層濾紙，低溫100V，60min。

封閉：0.5g脫脂奶粉溶于10ml PBST(5％)，室溫孵育1h。PBST洗三次。

將2.5μl一抗溶于5ml脫脂牛奶中，4℃孵育過夜。PBST洗三次。

將2.5μl二抗溶于5ml PBST溶液中，室溫孵育1h，PBST洗三次。

顯色：等體積加入A液B液，均勻滴在膜上，曝光，見圖1-1。

免疫熒光：

載玻片的處理：將70％酒精、1％HCL溶液(933ml 75％酒精、27ml 37％HCL、40ml H2O)加入玻片架白盒子，浸泡1h。將新的載玻片放在玻片架白盒子內(nèi)，加入70％酒精、1％HCL溶液，泡1h。用ddH2O清洗浸泡過的載玻片。將玻片架拿出放在超凈臺內(nèi)風(fēng)干。載玻片上用疏水的筆在畫大小適宜的圈，在超凈臺內(nèi)操作。在圈圈里加入適量多聚賴氨酸(按1mg/1ml配制)。室溫下結(jié)合10min后吸走，將玻片放入另一款白盒子內(nèi)，室溫下放置一晚。

取OD＝1 1ml的BL21/pET22bNP重組大腸菌株，500g 5min 4℃離心，用1ml pH＝7.0的HEPS洗三次，后用900ul HEPS重懸，并加入100ul 37％福爾馬林，室溫固定1h。用1ml pH＝7.0的HEPS洗三次，后用1ml PBS洗一次，再用200ul PBS重懸后，取適量加入疏水圈，室溫結(jié)合15min后吸走。在疏水圈內(nèi)加入適量的3％BSA(0.3g BSA溶于10ml PBST溶液)，封閉30min。在疏水圈內(nèi)加入適量含有一抗(1:1000)的3％BSA(0.3g BSA溶于10ml PBST溶液)，在濕盒中加入適量水，將載玻片放入其中，4℃過夜。將玻片放在玻片架上，用PBST洗三次(靜置即可)，每次5min。在圈圈內(nèi)加入適量含有二抗的PBS溶液(1:200)，在濕盒中加入適量水，將載玻片放入其中，室溫1h。PBST洗三次后，封片，鏡檢，見圖2-1。

BL21/pET22bNP重組大腸菌株全細(xì)胞催化反應(yīng)

PET膜的處理：用打孔器將PET膜裁成直徑為2mm的圓片，選擇完好的放在一個EP管中。雙蒸水沖洗數(shù)次，加入Triton X 100加熱wash 1～2次，雙蒸水洗掉Triton X 100直到無泡，加入Na2CO3溶液加熱沖洗若干次，雙蒸水洗若干次，放在干凈的培養(yǎng)皿中60℃烘干。

取BL21/pET22bNP重組大腸菌株，以0.1％的體積比接種量接種于含100μg/mL氨芐抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃220rpm/min振蕩12h，然后將此活化的菌液再以0.1％體積比接種量接種到新鮮的LB誘導(dǎo)培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)4-6h，待菌體密度OD600在0.6-1.2范圍內(nèi)，加入終濃度0.1mMIPTG16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)24h左右。3500rpm離心5min,加入Glycine/NaOH pH＝9buffer重懸，3500rpm離心5min，重復(fù)上述操作。

加入Glycine/NaOH pH＝9buffer 100μL重懸，放入處理過的PET膜，開始反應(yīng)。

一段時間后終止反應(yīng)，4℃5000g離心10min，取上清，加入終止液，85℃滅活10min。測量240nm處產(chǎn)物MHET的吸收峰，見圖3。

實施例2：細(xì)胞表面展示PET分解酶的重組大腸桿菌(BL21/pET22bLOP)的構(gòu)建及應(yīng)用

化學(xué)合成錨定蛋白如SEQ ID No.3所示的Lpp-OmpA基因，化學(xué)合成如SEQ ID No.1所示的PETase基因；

以Lpp-OmpA基因序列和PETase基因序列為模板設(shè)計引物。

上游引物L(fēng)OP-F1 5’GGTCTTCCATATGAAAGCTACTAAACTGGTAC 3’(劃線部分為NdeI酶切位點)

下游引物L(fēng)OP-R1 5’CACTACCTCCACCACCGTTGTCCGGACGAGTG 3’

上游引物L(fēng)OP-F2:5’CACTCGTCCGGACAACGGTGGTGGAGGTAGTG 3’

下游引物L(fēng)OP-R2:5’CCCTCGAGGCTACAGTTGGCGGTACGA 3’(劃線部分為XhoI酶切位點)

以人工合成Lpp-OmpA基因和PETase基因為模板進行PCR擴增獲得目的基因Lpp-OmpA和PETase。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸2min；34個循環(huán)后72℃保溫10min。將PCR產(chǎn)物跑膠驗證，回收目的條帶。

overlap PCR：加入等質(zhì)量的Lpp-OmpA和PETase PCR產(chǎn)物，反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸2min；12個循環(huán)后72℃保溫10min。

第三輪PCR以第二輪overlap產(chǎn)物為模板，擴增目的基因Lpp-OmpA-PETase。反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30sec；53℃退火30sec；72℃延伸3min；22個循環(huán)后72℃保溫10min。將PCR產(chǎn)物跑膠驗證，回收目的條帶(Lpp-OmpA基因的核苷酸序列和PETase基因的核苷酸序列連接后的融合序列)。

PCR純化產(chǎn)物經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收目的片段，再與經(jīng)過同樣酶切處理過的表達載體pET-22b連接構(gòu)建質(zhì)粒pET22bLOP，4℃過夜。取10μL連接產(chǎn)物pET22LOP轉(zhuǎn)化到100μlEscherichia coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含Amp的LB固體平板上，37℃溫箱培養(yǎng)13h，從轉(zhuǎn)化板上挑取幾株單菌落，接種于5ml含有100μg/mL氨芐抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃快速振蕩12h。取600μL菌液加入400μL甘油混勻凍存，并提取質(zhì)粒送Genewiz公司測序，從而獲得重組質(zhì)粒pET22bLOP。

將測序正確的pET22bLOP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到100μl大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布與含氨芐抗性的LB固體平板上，37℃溫箱培養(yǎng)13h，從轉(zhuǎn)化板上挑取單克隆菌落，從而獲得細(xì)胞表面展示PET分解酶的重組大腸桿菌BL21/pET22bLOP，簡稱BL21/pET22bLOP重組大腸菌株。

Western blot:

取BL21/pET22BLOP重組大腸桿菌株200μl，離心去上清，加20μl培養(yǎng)基重懸，加4μl 6×loading buffer。100℃加熱15min。

SDS-PAGE上樣后恒流跑膠

轉(zhuǎn)膜：順序為1層海綿2層濾紙蛋白膠硝酸纖維素膜2層濾紙，低溫100V，60min。

封閉：0.5g脫脂奶粉溶于10ml PBST(5％)，室溫孵育1h。PBST洗三次。

將2.5μl一抗溶于5ml脫脂牛奶中，4℃孵育過夜。PBST洗三次。

將2.5μl二抗溶于5ml PBST溶液中，室溫孵育1h，PBST洗三次。

顯色：等體積加入A液B液，均勻滴在膜上，曝光，見圖1-2。

免疫熒光：

載玻片的處理：將70％酒精、1％HCL溶液(933ml 75％酒精、27ml 37％HCL、40ml H2O)加入玻片架白盒子，浸泡1h。將新的載玻片放在玻片架白盒子內(nèi)，加入70％酒精、1％HCL溶液，泡1h。用ddH2O清洗浸泡過的載玻片。將玻片架拿出放在超凈臺內(nèi)風(fēng)干。載玻片上用疏水的筆在畫大小適宜的圈，在超凈臺內(nèi)操作。在圈圈里加入適量多聚賴氨酸(按1mg/1ml配制)。室溫下結(jié)合10min后吸走，將玻片放入另一款白盒子內(nèi)，室溫下放置一晚。

取OD＝1 1ml的BL21/pET22bLOP重組大腸菌株，500g 5min 4℃離心，用1ml pH＝7.0的HEPS洗三次，后用900ul HEPS重懸，并加入100ul 37％福爾馬林，室溫固定1h。用1ml pH＝7.0的HEPS洗三次，后用1ml PBS洗一次，再用200ul PBS重懸后，取適量加入疏水圈，室溫結(jié)合15min后吸走。在疏水圈內(nèi)加入適量的3％BSA(0.3g BSA溶于10ml PBST溶液)，封閉30min。在疏水圈內(nèi)加入適量含有一抗(1:1000)的3％BSA(0.3g BSA溶于10ml PBST溶液)，在濕盒中加入適量水，將載玻片放入其中，4℃過夜。將玻片放在玻片架上，用PBST洗三次(靜置即可)，每次5min。在圈圈內(nèi)加入適量含有二抗的PBS溶液(1:200)，在濕盒中加入適量水，將載玻片放入其中，室溫1h。PBST洗三次后，封片，鏡檢，見圖2-2。

BL21/pET22bLOP重組大腸菌株全細(xì)胞催化反應(yīng)

PET膜的處理：用打孔器將PET膜裁成直徑為2mm的圓片，選擇完好的放在一個EP管中。雙蒸水沖洗數(shù)次，加入Triton X 100加熱wash 1～2次，雙蒸水洗掉Triton X 100直到無泡，加入Na2CO3溶液加熱沖洗若干次，雙蒸水洗若干次，放在干凈的培養(yǎng)皿中60℃烘干。

取BL21/pET22bLOP重組大腸菌株，以0.1％的體積比接種量接種于含100μg/mL氨芐抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃220rpm/min振蕩12h，然后將此活化的菌液再以0.1％體積比接種量接種到新鮮的LB誘導(dǎo)培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)4-6h，待菌體密度OD600在0.6-1.2范圍內(nèi)，加入終濃度0.1mMIPTG16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)24h左右。3500rpm離心5min,加入Glycine/NaOH pH＝9buffer重懸，3500rpm離心5min，重復(fù)上述操作。

加入Glycine/NaOH pH＝9buffer 100μL重懸，放入處理過的PET膜，開始反應(yīng)。

一段時間后終止反應(yīng)，4℃5000g離心10min，取上清，加入終止液，85℃滅活10min。測量240nm處產(chǎn)物MHET的吸收峰，見圖3。

實施例3：細(xì)胞表面展示PET分解酶的重組大腸桿菌(BL21/pET22bBP)的構(gòu)建及應(yīng)用

化學(xué)合成錨定蛋白如SEQ ID No.4所示的BrkA基因，化學(xué)合成如SEQ ID No.1所示的PETase基因；

以BrkA基因序列和PETase基因序列為模板設(shè)計引物。

上游引物BrkA1 5’GGAATTCCATATGTACTTGGATCGTTTTCGGCA3’(劃線部分為NdeI酶切位點)

下游引物BrkA2 5’ATAAGGATTGGTTTGCCCGGCGTCCTGAGCATGT3’

上游引物BrkA3 5’ATGCTCAGGACGCCGGGCAAACCAATCCTTATGCC3’

下游引物BrkA4 5’GAGATATTCCGGCGCTACAGTTGGCGGTACGA3’

上游引物BrkA5 5’GCCAACTGTAGCGCCGGAATATCTCTTAGTGTT3’

下游引物BrkA6 5’CCGCTCGAGTCAAAACGAGTACCGATAGCC 3’(劃線部分為XhoI酶切位點)

以人工合成的BrkA基因和PETase基因為模板進行PCR擴增獲得目的基因sp、PETase、βbarrel。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸3min；34個循環(huán)后72℃保溫10min。將PCR產(chǎn)物跑膠驗證，回收目的條帶sp、PETase、βbarrel。

overlap PCR：體系中加入等質(zhì)量的sp和PETase PCR產(chǎn)物，反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸2min；12個循環(huán)后72℃保溫10min，獲得目的條帶sp-PETase.

第三輪PCR以第二輪overlap產(chǎn)物為模板，擴增目的基因sp-PETase。反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30sec；53℃退火30sec；72℃延伸2min；22個循環(huán)后72℃保溫10min。將PCR產(chǎn)物跑膠驗證，回收目的條帶。

overlap PCR：加入等質(zhì)量的sp-PETase和βbarrel PCR產(chǎn)物，反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸3min；12個循環(huán)后72℃保溫10min，獲得目的條帶sp-PETase-βbarrel。

第三輪PCR以第二輪overlap產(chǎn)物為模板，擴增目的基因sp-PETase-βbarrel。反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30sec；53℃退火30sec；72℃延伸5min；22個循環(huán)后72℃保溫10min。將PCR產(chǎn)物跑膠驗證，回收目的條帶(BrkA基因的核苷酸序列和PETase基因的核苷酸序列連接后的融合序列)。

PCR純化產(chǎn)物經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收目的片段，再與經(jīng)過同樣酶切處理過的表達載體pET-22b連接構(gòu)建質(zhì)粒pET22bBP，4℃過夜。取10μL連接產(chǎn)物pET22BP轉(zhuǎn)化到100μlEscherichia coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含Amp的LB固體平板上，37℃溫箱培養(yǎng)13h，從轉(zhuǎn)化板上挑取幾株單菌落，接種于5ml含有100μg/mL氨芐抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃快速振蕩12h。取600μL菌液加入400μL甘油混勻凍存，并提取質(zhì)粒送Genewiz公司測序，從而獲得重組質(zhì)粒pET22bBP。

將測序正確的pET22bBP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到100μl大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布與含氨芐抗性的LB固體平板上，37℃溫箱培養(yǎng)13h，從轉(zhuǎn)化板上挑取單克隆菌落，從而獲得細(xì)胞表面展示PET分解酶的重組大腸桿菌BL21/pET22bBP，簡稱BL21/pET22bBP重組大腸菌株。

Western blot:

取BL21/pET22bBP重組大腸菌株，200μl，離心去上清，加20μl培養(yǎng)基重懸，加4μl 6×loading buffer。100℃加熱15min。

SDS-PAGE上樣后恒流跑膠

轉(zhuǎn)膜：順序為1層海綿2層濾紙蛋白膠硝酸纖維素膜2層濾紙，低溫100V，60min。

封閉：0.5g脫脂奶粉溶于10ml PBST(5％)，室溫孵育1h。PBST洗三次。

將2.5μl一抗溶于5ml脫脂牛奶中，4℃孵育過夜。PBST洗三次。

將2.5μl二抗溶于5ml PBST溶液中，室溫孵育1h，PBST洗三次。

顯色：等體積加入A液B液，均勻滴在膜上，曝光，見圖1-3。

免疫熒光：

載玻片的處理：將70％酒精、1％HCL溶液(933ml 75％酒精、27ml 37％HCL、40ml H2O)加入玻片架白盒子，浸泡1h。將新的載玻片放在玻片架白盒子內(nèi)，加入70％酒精、1％HCL溶液，泡1h。用ddH2O清洗浸泡過的載玻片。將玻片架拿出放在超凈臺內(nèi)風(fēng)干。載玻片上用疏水的筆在畫大小適宜的圈，在超凈臺內(nèi)操作。在圈圈里加入適量多聚賴氨酸(按1mg/1ml配制)。室溫下結(jié)合10min后吸走，將玻片放入另一款白盒子內(nèi)，室溫下放置一晚。

取OD＝1 1ml的BL21/pET22bBP重組大腸菌株，500g 5min 4℃離心，用1ml pH＝7.0的HEPS洗三次，后用900ul HEPS重懸，并加入100ul 37％福爾馬林，室溫固定1h。用1ml pH＝7.0的HEPS洗三次，后用1ml PBS洗一次，再用200ul PBS重懸后，取適量加入疏水圈，室溫結(jié)合15min后吸走。在疏水圈內(nèi)加入適量的3％BSA(0.3g BSA溶于10ml PBST溶液)，封閉30min。在疏水圈內(nèi)加入適量含有一抗(1:1000)的3％BSA(0.3g BSA溶于10ml PBST溶液)，在濕盒中加入適量水，將載玻片放入其中，4℃過夜。將玻片放在玻片架上，用PBST洗三次(靜置即可)，每次5min。在圈圈內(nèi)加入適量含有二抗的PBS溶液(1:200)，在濕盒中加入適量水，將載玻片放入其中，室溫1h。PBST洗三次后，封片，鏡檢，見圖2-3。

BL21/pET22bBP重組大腸菌株全細(xì)胞催化反應(yīng)

PET膜的處理：用打孔器將PET膜裁成直徑為2mm的圓片，選擇完好的放在一個EP管中。雙蒸水沖洗數(shù)次，加入Triton X 100加熱wash 1～2次，雙蒸水洗掉Triton X 100直到無泡，加入Na2CO3溶液加熱沖洗若干次，雙蒸水洗若干次，放在干凈的培養(yǎng)皿中60℃烘干。

取BL21/pET22bBP重組大腸菌株,以0.1％的體積比接種量接種于含100μg/mL氨芐抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃220rpm/min振蕩12h，然后將此活化的菌液再以0.1％體積比接種量接種到新鮮的LB誘導(dǎo)培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)4-6h，待菌體密度OD600在0.6-1.2范圍內(nèi)，加入終濃度0.1mMIPTG16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)24h左右。3500rpm離心5min,加入Glycine/NaOH pH＝9buffer重懸，3500rpm離心5min，重復(fù)上述操作。

加入Glycine/NaOH pH＝9buffer 100μL重懸，放入處理過的PET膜，開始反應(yīng)。

一段時間后終止反應(yīng)，4℃5000g離心10min，取上清，加入終止液，85℃滅活10min。測量240nm處產(chǎn)物MHET的吸收峰，見圖3。

實施例4：細(xì)胞表面展示PET分解酶的重組大腸桿菌(BL21/pET22bAP)的構(gòu)建及應(yīng)用

化學(xué)合成錨定蛋白如SEQ ID No.5所示的AIDA基因，化學(xué)合成如SEQ ID No.1所示的PETase基因；

以人工合成的AIDA基因序列和PETase基因序列為模板設(shè)計引物。

上游引物sp-F 5’GGAATTGCATATGAATAAGGCCTACAGTATCATTTGGAGC 3’(劃線部分為NdeI酶切位點)

下游引物sp-R 5’AGGATTGGTTTGCATGCAAATGCATTTCCG3’

上游引物PET-F 5’GGAAATGCATTTGCAATGCAAACCAATCCTTATG 3’

下游引物PET-R 5’ATGGTGATGGTGATGGTGGCTACAGTTGGCGGTAC3’

上游引物AIDA-F 5’CATCACCATCACCATGTGAATAACAATGGAAGC 3’

下游引物AIDA-R 5’CCCTCGAGTCAGAAGCTGTATTTAATCCCCAG 3’(劃線部分為XhoI酶切位點)

以人工合成的AIDA基因和PETase基因為模板進行PCR擴增獲得目的基因sp、PETase、βbarrel。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸3min；34個循環(huán)后72℃保溫10min。將PCR產(chǎn)物跑膠驗證，回收目的條帶sp、PETase、βbarrel。

overlap PCR：體系中加入等質(zhì)量的sp和PETase PCR產(chǎn)物，反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸2min；12個循環(huán)后72℃保溫10min，獲得目的條帶sp-PETase.

第三輪PCR以第二輪overlap產(chǎn)物為模板，擴增目的基因sp-PETase。反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30sec；53℃退火30sec；72℃延伸2min；22個循環(huán)后72℃保溫10min。將PCR產(chǎn)物跑膠驗證，回收目的條帶。

overlap PCR：加入等質(zhì)量的sp-PETase和βbarrel PCR產(chǎn)物，反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30sec；55℃退火30sec；72℃延伸3min；12個循環(huán)后72℃保溫10min，獲得目的條帶sp-PETase-βbarrel。

第三輪PCR以第二輪overlap產(chǎn)物為模板，擴增目的基因sp-PETase-βbarrel。反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min；然后94℃變性30sec；53℃退火30sec；72℃延伸5min；22個循環(huán)后72℃保溫10min。將PCR產(chǎn)物跑膠驗證，回收目的條帶(AIDA基因的核苷酸序列和PETase基因的核苷酸序列連接后的融合序列)。

PCR純化產(chǎn)物經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，回收目的片段，再與經(jīng)過同樣酶切處理過的表達載體pET-22b連接構(gòu)建質(zhì)粒pET22bBP，4℃過夜。取10μL連接產(chǎn)物pET22AP轉(zhuǎn)化到100μlEscherichia coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含Amp的LB固體平板上，37℃溫箱培養(yǎng)13h，從轉(zhuǎn)化板上挑取幾株單菌落，接種于5ml含有100μg/mL氨芐抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃快速振蕩12h。取600μL菌液加入400μL甘油混勻凍存，并提取質(zhì)粒送Genewiz公司測序，從而獲得重組質(zhì)粒pET22bAP。

將測序正確的pET22bAP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到100μl大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，涂布與含氨芐抗性的LB固體平板上，37℃溫箱培養(yǎng)13h，從轉(zhuǎn)化板上挑取單克隆菌落，從而獲得細(xì)胞表面展示PET分解酶的重組大腸桿菌BL21/pET22bAP，簡稱BL21/pET22bAP重組大腸菌株。

Western blot:

取BL21/pET22bAP重組大腸菌株200μl，離心去上清，加20μl培養(yǎng)基重懸，加4μl 6×loading buffer。100℃加熱15min。

SDS-PAGE上樣后恒流跑膠

轉(zhuǎn)膜：順序為1層海綿2層濾紙蛋白膠硝酸纖維素膜2層濾紙，低溫100V，60min。

封閉：0.5g脫脂奶粉溶于10ml PBST(5％)，室溫孵育1h。PBST洗三次。

將2.5μl一抗溶于5ml脫脂牛奶中，4℃孵育過夜。PBST洗三次。

將2.5μl二抗溶于5ml PBST溶液中，室溫孵育1h，PBST洗三次。

顯色：等體積加入A液B液，均勻滴在膜上，曝光，見圖1-4。

免疫熒光：

載玻片的處理：將70％酒精、1％HCL溶液(933ml 75％酒精、27ml 37％HCL、40ml H2O)加入玻片架白盒子，浸泡1h。將新的載玻片放在玻片架白盒子內(nèi)，加入70％酒精、1％HCL溶液，泡1h。用ddH2O清洗浸泡過的載玻片。將玻片架拿出放在超凈臺內(nèi)風(fēng)干。載玻片上用疏水的筆在畫大小適宜的圈，在超凈臺內(nèi)操作。在圈圈里加入適量多聚賴氨酸(按1mg/1ml配制)。室溫下結(jié)合10min后吸走，將玻片放入另一款白盒子內(nèi)，室溫下放置一晚。

取OD＝1 1ml的BL21/pET22bAP重組大腸菌株，500g 5min 4℃離心，用1ml pH＝7.0的HEPS洗三次，后用900ul HEPS重懸，并加入100ul 37％福爾馬林，室溫固定1h。用1ml pH＝7.0的HEPS洗三次，后用1ml PBS洗一次，再用200ul PBS重懸后，取適量加入疏水圈，室溫結(jié)合15min后吸走。在疏水圈內(nèi)加入適量的3％BSA(0.3g BSA溶于10ml PBST溶液)，封閉30min。在疏水圈內(nèi)加入適量含有一抗(1:1000)的3％BSA(0.3g BSA溶于10ml PBST溶液)，在濕盒中加入適量水，將載玻片放入其中，4℃過夜。將玻片放在玻片架上，用PBST洗三次(靜置即可)，每次5min。在圈圈內(nèi)加入適量含有二抗的PBS溶液(1:200)，在濕盒中加入適量水，將載玻片放入其中，室溫1h。PBST洗三次后，封片，鏡檢，見圖2-4。

BL21(DE3)/pET22bAP重組大腸菌株全細(xì)胞催化反應(yīng)

PET膜的處理：用打孔器將PET膜裁成直徑為2mm的圓片，選擇完好的放在一個EP管中。雙蒸水沖洗數(shù)次，加入Triton X 100加熱wash 1～2次，雙蒸水洗掉Triton X 100直到無泡，加入Na2CO3溶液加熱沖洗若干次，雙蒸水洗若干次，放在干凈的培養(yǎng)皿中60℃烘干。

取BL21/pET22bAP重組大腸菌株，以0.1％的體積比接種量接種于含100μg/mL氨芐抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃220rpm/min振蕩12h，然后將此活化的菌液再以0.1％體積比接種量接種到新鮮的LB誘導(dǎo)培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)4-6h，待菌體密度OD600在0.6-1.2范圍內(nèi)，加入終濃度0.1mMIPTG16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)24h左右。3500rpm離心5min,加入Glycine/NaOH pH＝9buffer重懸，3500rpm離心5min，重復(fù)上述操作。

加入Glycine/NaOH pH＝9buffer 100μL重懸，放入處理過的PET膜，開始反應(yīng)。

一段時間后終止反應(yīng)，4℃5000g離心10min，取上清，加入終止液，85℃滅活10min。測量240nm處產(chǎn)物MHET的吸收峰，見圖3。