專利名稱：：液體型纖維蛋白原(fib)檢測(cè)試劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及臨床診斷試劑，具體涉及一種液體型纖維蛋白原(FIB)檢測(cè)試劑的制備方法，該方法還包括液體型纖維蛋白原(FIB)檢測(cè)試劑的主要組成部分。
背景技術(shù)：
：纖維蛋白原(Fibrinogen,FIB)是肝臟合成的一種血漿球蛋白，是體內(nèi)重要的凝血因子，其主要的生理功能是作為凝血因子I參與體內(nèi)凝血過程。血漿中的纖維蛋白原在過量凝血酶的作用下，它會(huì)由可溶的蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇艿木酆衔?，從而形成纖維蛋白凝塊。血漿的凝血酶凝集時(shí)間和纖維蛋白原含量成反比，在凝血酶過量的情況下，測(cè)定血漿的凝集時(shí)間，通過纖維蛋白原標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算公式便可得到待測(cè)纖維蛋白原含量。近年來，大量臨床及流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)血漿纖維蛋白原(Fib)水平的變化與凝血障礙、出血性疾病、彌漫性血管凝血(DIC)以及炎癥反應(yīng)等有密切關(guān)系。健康成人正常纖維蛋白原含量范圍是200~400mg/dL，F(xiàn)IB含量增高主要見于糖尿病、酸中毒、動(dòng)脈粥樣硬化、急性傳染病、急性腎炎尿毒癥及輕度肝炎等病癥，F(xiàn)IB含量降低主要見于DIC、原發(fā)性纖溶癥、重度肝炎、肝硬化等病癥。隨著血栓與止血檢測(cè)在臨床上的廣泛應(yīng)用，纖維蛋白原(FIB)檢測(cè)已成為出血和血栓檢驗(yàn)的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，具有重要的臨床診斷意義。目前測(cè)定纖維蛋白的方法眾多，大體上分三大類，(l)可凝固蛋白質(zhì)，又稱功能法。(2)物理、化學(xué)測(cè)定法。(3)免疫學(xué)測(cè)定法。在正常情況下三者密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)證明在異常情況下，三者有明顯的差異。功能法測(cè)定是建立在Fib經(jīng)凝血酶作用后形成纖維蛋白凝塊基礎(chǔ)上的，最能直接反映Fib的凝血功能。物理化學(xué)法是根據(jù)蛋白質(zhì)的理化特性建立的，這種方法特異性差，影響因素多。免疫學(xué)方法目前多采用抗Fib多克隆抗體與Fib起免疫反應(yīng)，其所針對(duì)的抗原決定簇也存在于纖維蛋白質(zhì)單體，纖維蛋白原降解產(chǎn)物(FDP)和異常Fib中，因而特異性比較差?？藙谒狗?Vonclauss法)為功能法，是美國國家臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的方法，能直接反映纖維蛋白原的凝血功能。其測(cè)定原理是稀釋血漿中纖維蛋白原在過量凝血酶作用下形成穩(wěn)定纖維蛋白，以5%凝集為終點(diǎn)，測(cè)量稀釋血漿的凝固時(shí)間而定量纖維蛋白原含量。該法操作簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果與Jocdbsson法(WHO與NIBSC推薦的參考方法)相比相關(guān)性良好。近年來，隨著自動(dòng)血凝分析儀的廣泛使用，纖維蛋白原的測(cè)定趨于自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化。測(cè)定過程受多種因素的影響，其中試劑的質(zhì)量是最關(guān)鍵因素，由于目前國內(nèi)的纖維蛋白原檢測(cè)試劑普遍存在產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、敏感性差的問題，致使檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，不同的臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室之間測(cè)得的結(jié)果難以比較，盡管采用WHO標(biāo)準(zhǔn)參照品，但仍難以把誤差降低到可接受的水平，因此目前臨床實(shí)驗(yàn)室所使用的試劑絕大部分為進(jìn)口產(chǎn)品，價(jià)格昂貴。另一方面，由于液體制劑在使用的過程中不需復(fù)溶，不存在因所用水的質(zhì)量或體積差異給測(cè)定結(jié)果造成的誤差，有利于測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)現(xiàn)，因此成為凝血檢測(cè)試劑的發(fā)展方向。
發(fā)明內(nèi)容(一)發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種具有敏感性高、使用方便、實(shí)驗(yàn)誤差小、穩(wěn)定性強(qiáng)、兼容性好的液體FIB檢測(cè)試劑的制備方法，最終目的是將應(yīng)用該方法制成的檢測(cè)試劑在臨床檢驗(yàn)上廣泛應(yīng)用，使FIB檢驗(yàn)實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。(二)發(fā)明的優(yōu)勢(shì)本發(fā)明采用牛凝血酶為主要原料，使用Vonclauss法(NCCLS推薦)制備新型液體型纖維蛋白原(FIB)檢測(cè)試劑。液體試劑具有使用方便的優(yōu)點(diǎn)，不需復(fù)溶，避免各實(shí)驗(yàn)室使用蒸餾水不同、復(fù)溶體積不準(zhǔn)確而造成的測(cè)定偏差；試劑穩(wěn)定性強(qiáng)，開瓶后37'C能穩(wěn)定30天以上；同時(shí)，該試劑兼容性強(qiáng)，可滿足使用不同型號(hào)血凝儀的檢測(cè)需要。(三)
發(fā)明內(nèi)容詳述本發(fā)明的特征在于由牛凝血酶、纖維蛋白原標(biāo)準(zhǔn)品、緩沖液和穩(wěn)定劑制備而成。液體FIB檢測(cè)試劑中各試劑的終濃度依次為牛凝血酶(siOOU/mL)，纖維蛋白原標(biāo)準(zhǔn)品G000mg/dL)，20mMpH7.5Tris-HCI，0,5%聚乙二醇，0.25%牛血清白蛋白，3%甘油，0.1%羥基丁酸鹽甲苯，0.1%疊氮鈉，20mMpH7.5巴比妥鈉，150mM氯化鈉、0.1%明膠。具體實(shí)施例方式實(shí)施例一液體型纖維蛋白原(FIB)檢測(cè)試劑的制備液體纖維蛋白原FIB檢測(cè)試劑由牛凝血酶試劑、產(chǎn)品穩(wěn)定劑和FIB緩沖液所組成，其制備方法如下1.產(chǎn)品穩(wěn)定劑的制備依次稱取5g聚乙二醇、2.5g牛血清白蛋白、lg羥基丁酸鹽甲苯、lg疊氮鈉，溶解于20mMpH7.5Tris-HCI緩沖液中，加入30mL甘油，混合均勻至外觀為無色透明液體，定容至1L，4。C貯藏備用。2.牛凝血酶試劑的制備將牛凝血酶凍干粉(500U/mL,lmL/瓶)用產(chǎn)品穩(wěn)定劑按比例稀釋為終濃度^100U/mL，4'CIC藏備用。3.FIB緩沖液的制備稱取4.97g巴比妥鈉、8.77g氯化鈉加入蒸餾水適量使之溶解。另取lg明膠加入適量蒸餾水，加熱溶解后并入上述溶液中。然后用0.2mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至7.5，再用蒸餾水定容至1L，即得FIB緩沖液。制備液體FIB檢測(cè)試劑主要技術(shù)指標(biāo)如下1.外觀凝血酶試劑(液體)應(yīng)為無色液體，透明無異物；纖維蛋白原標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)為白色或淺黃色疏松固體，無融化；緩沖液為無色液體，透明無異物。2.試劑重復(fù)性同一瓶試劑重復(fù)測(cè)定同一血漿樣品，所測(cè)結(jié)果變異系數(shù)小于10%。3.試劑批間差不同瓶試劑測(cè)定同一血漿樣品，所測(cè)結(jié)果變異系數(shù)小于10%。4.試劑穩(wěn)定性在2'C8"存放不少于18個(gè)月。實(shí)施例二應(yīng)用液體型纖維蛋白原(FIB)檢測(cè)試劑的檢測(cè)方法1.纖維蛋白原標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將纖維蛋白原標(biāo)準(zhǔn)品(3000mg/dL)用FIB緩沖液依次按照比例1:5、1:10、1:15、1:20、1:30稀釋成終濃度分別為600mg/dL、300mg/dL、200mg/dL、150mg/dL、100mg/dL，取此不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿各200uL，37。C預(yù)溫3分鐘，然后分別加入凝血酶試劑100uL(不需預(yù)溫)，以CA530血凝儀(日本Sysmex公司產(chǎn)品)測(cè)定凝固時(shí)間。以不同濃度的纖維蛋白原標(biāo)準(zhǔn)品含量(mg/dL)為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的凝固時(shí)間為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)112^0.99。2.檢測(cè)方法將待測(cè)血漿用緩沖液作1:10稀釋，取待測(cè)血漿200uL，37。C預(yù)溫3分鐘，然后分別加入凝血酶試劑100uL(不需預(yù)溫)，以CA530血凝儀(日本Sysmex公司產(chǎn)品)測(cè)定凝固時(shí)間，從標(biāo)準(zhǔn)曲線求得待測(cè)血漿的纖維蛋白原濃度。檢測(cè)正常值范圍是200-400mg/dL。實(shí)施例三液體型纖維蛋白原(FIB)檢測(cè)試劑的穩(wěn)定性檢測(cè)本發(fā)明試劑的穩(wěn)定性檢測(cè)包括開封后2-8'C穩(wěn)定性、不開封2-8'C穩(wěn)定性、未開封37°C加速破壞試驗(yàn)、長(zhǎng)時(shí)穩(wěn)定性試驗(yàn)。開封后置于2-8'C貯藏條件下，30天之內(nèi)正常質(zhì)控血漿L-l測(cè)值在正常值范圍內(nèi)，且變化不大，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表l所示。表12-8°(:貯藏條件下本發(fā)明試劑的穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果正常質(zhì)控血漿L-l貯藏時(shí)間(天)檢測(cè)凝固時(shí)間(s)纖維蛋白原濃度檢測(cè)值正常質(zhì)控血漿L-l(mg/dL)標(biāo)示纖維蛋白原濃度(mg/dL)113.1288.128012.8290.82801013.5278.32801512.6285.22802013.6276.02802513.5278.12803012.72卯.2280在2-8'C條件下將該試劑貯存12個(gè)月，每隔一個(gè)月對(duì)該試劑做穩(wěn)定性檢測(cè)，檢測(cè)儀器為CA530血凝儀，用與儀器配套的市售的APTT試劑做對(duì)照，所用血漿為太平洋公司的正常質(zhì)控血漿L-1，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。表2本發(fā)明液體FIB與市售FIB試劑在2-8'C穩(wěn)定性比較貯存時(shí)間(月)正常質(zhì)控血漿L-1檢湯M凝固時(shí)間(s)市售進(jìn)口FIB本發(fā)明-F舊113.612.8213.813.1313.412.9413.912.6514.113.2613.913.0714.312.9813.812.9914.5in1013.913.21114.212.81213.713.037'C加速破壞條件下，正常質(zhì)控血漿測(cè)值在l個(gè)月保持基本穩(wěn)定，處于正常值范圍，檢測(cè)結(jié)果如表3所示。表337'C加速破壞實(shí)驗(yàn)本發(fā)明FIB檢測(cè)試劑穩(wěn)定性檢測(cè)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>綜上對(duì)以上各技術(shù)指標(biāo)的考察結(jié)果證明，本發(fā)明方法生產(chǎn)的試劑操作簡(jiǎn)單、使用方便、敏感性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，與國外FIB檢測(cè)試劑具有可比性，適合臨床應(yīng)用，可作為新一代標(biāo)準(zhǔn)化FIB試劑替代進(jìn)口試劑。權(quán)利要求1.一種液體型纖維蛋白原(FIB)檢測(cè)試劑的制備方法，其特征在于它是牛凝血酶、纖維蛋白原標(biāo)準(zhǔn)品、緩沖液和穩(wěn)定劑組成。2.按權(quán)利要求l所述方法，其特征在于牛凝血酶的活力單位^100U/mL。3.按權(quán)利要求1所述方法，其特征在于纖維蛋白原標(biāo)準(zhǔn)品的終濃度20003000mg/dL。4.按權(quán)利要求1所述方法，其特征在于緩沖液系由巴比妥鈉、氯化鈉和明膠組成。其中，巴比妥鈉濃度為20~40mM，氯化鈉60~200mM，明膠濃度0.05~0.2%，緩沖液pH7.4~pH8.0。5.按權(quán)利要求4所述方法，其特征在于巴比妥鈉緩沖液的最適濃度為20mM，最適pH為7.5，氯化鈉最適濃度為150mM，明膠最適濃度0.1%。6.按權(quán)利要求l所述方法，其特征在于穩(wěn)定劑由下述原料制成20~30mMpH7.5~8.0Tris-HCI，聚乙二醇0.4~1.0%，甘油2~5%，羥基丁酸鹽甲苯0.05~1.5%，疊氮鈉0.1~0.5%。7.按權(quán)利要求6所述方法，其特征在于穩(wěn)定劑以20mMpH7.5Tris-HCI緩沖液配制。8.按權(quán)利要求6所述方法，其特征在于穩(wěn)定劑中聚乙二醇的最適添加量是0.5%、甘油最適添加量為3%、羥基丁酸鹽甲苯最適添加量是0.1%、疊氮鈉最適添加量0.1%。全文摘要本發(fā)明涉及一種液體型纖維蛋白原(FIB)檢測(cè)試劑的制備方法。該試劑主要用于監(jiān)測(cè)凝血障礙、出血性疾病、彌漫性血管凝血(DIC)、糖尿病、酸中毒、動(dòng)脈粥樣硬化等病癥。隨著血栓與止血檢測(cè)在臨床上的廣泛應(yīng)用，纖維蛋白原(FIB)檢測(cè)已成為出血和血栓檢驗(yàn)的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，具有重要的臨床診斷意義。該方法采用牛凝血酶為主要原料，使用Vonclauss法(NCCLS推薦)制備新型液體型纖維蛋白原(FIB)檢測(cè)試劑。新穎的穩(wěn)定系統(tǒng)解決了液體狀態(tài)保持試劑穩(wěn)定性的難題，具有敏感性高、使用方便、實(shí)驗(yàn)誤差小、穩(wěn)定性強(qiáng)、兼容性好、成本低等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)G01N33/68GK101561441SQ20081009145公開日2009年10月21日申請(qǐng)日期2008年4月15日優(yōu)先權(quán)日2008年4月15日發(fā)明者肖國偉申請(qǐng)人:上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司