肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于，針對適于應(yīng)用基因重組技術(shù)與合成生物學(xué)方法的大腸桿菌等不具有內(nèi)源性肌肉肌醇生物合成通路的宿主微生物，賦予顯著得到改善的肌肉肌醇生產(chǎn)能力。在本發(fā)明中，使下述轉(zhuǎn)化體中的肌醇單磷酸酶活性增強(qiáng)，該轉(zhuǎn)化體是在不具有內(nèi)源性肌肉肌醇生物合成通路的宿主微生物內(nèi)導(dǎo)入肌肉肌醇生物合成通路而得到的。FERM BP-115122012.10.26FERM BP-115132012.10.26FERM BP-115142012.10.26FERM BP-115152012.10.26
【專利說明】肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物的制造方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因重組技術(shù)在肌肉肌醇的制造中的應(yīng)用。特別是涉及利用原核微生 物的轉(zhuǎn)化體的肌肉肌醇的工業(yè)制造方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及新穎的肌肉肌醇衍生物及其制 造方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 肌肉肌醇對于多數(shù)高等動物來說為必不可缺的物質(zhì)，因而其作為營養(yǎng)食品、飼料、 藥品等成分廣泛使用。例如，已知肌肉肌醇在脂肪和膽固醇類的代謝中發(fā)揮出重要的作用， 在高膽固醇血癥等的預(yù)防或治療中是特別有效的。因而，對于以工業(yè)規(guī)模制造肌肉肌醇的 制造工藝提出了多種改良方案。
[0003] 以往，肌肉肌醇是從米糠、玉米漿等直接提取的，但該提取方法中，肌肉肌醇的收 率低，并且大量生成雜質(zhì)，因而肌肉肌醇的精制困難，生產(chǎn)效率極低。因此，還有人提出了對 具有肌肉肌醇生產(chǎn)能力的面包酵母進(jìn)行培養(yǎng)，由該培養(yǎng)物中生成肌肉肌醇的方法，但該方 法的生產(chǎn)率仍然較低，在經(jīng)濟(jì)上不成立，因而未進(jìn)行工業(yè)實施。
[0004] 因而，對更加有效地生產(chǎn)肌醇的微生物進(jìn)行了檢索。專利文獻(xiàn)1公開了可向菌體 外分泌肌醇的假絲酵母屬酵母的表達(dá)及其利用。專利文獻(xiàn)2和3分別公開了在上述假絲酵 母屬酵母中導(dǎo)入可賦予針對葡萄糖代謝抵抗物質(zhì)和抗生素的耐性的突變的內(nèi)容。另外，在 專利文獻(xiàn)4、5和6中還分別公開了通過在具有肌醇生產(chǎn)能力的假絲酵母屬酵母中導(dǎo)入可賦 予針對叔胺、六氯環(huán)己烷和十六烷基三甲基銨鹽的耐性的突變來提高肌醇的收率的內(nèi)容。 專利文獻(xiàn)7中同樣公開了在具有肌醇生產(chǎn)能力的假絲酵母屬酵母中導(dǎo)入可賦予針對6-鹵 代-6-脫氧葡萄糖的耐性的突變的內(nèi)容。在專利文獻(xiàn)8中還公開了在具有肌醇生產(chǎn)能力的 假絲酵母屬酵母中導(dǎo)入可賦予針對鹵化乙酰甲酸的耐性的突變的內(nèi)容。
[0005] 進(jìn)一步地，現(xiàn)有技術(shù)還記載了利用基因重組進(jìn)行的酵母的轉(zhuǎn)化。在專利文獻(xiàn)9中 公開了下述內(nèi)容：在一系列的肌肉肌醇生物合成反應(yīng)中，肌醇-1-磷酸合成酶承擔(dān)控速反 應(yīng)，在這一恰當(dāng)推論下，通過單獨(dú)利用編碼上述肌醇-1-磷酸合成酶的DNA對不具有肌醇分 泌能力的假絲酵母屬酵母進(jìn)行轉(zhuǎn)化而對該酵母賦予肌醇生產(chǎn)能力。在專利文獻(xiàn)10中公開 了通過將置于甘油-3-磷酸脫氫酶基因啟動子的調(diào)節(jié)下的編碼肌醇-1-磷酸合成酶的DNA 單獨(dú)導(dǎo)入酵母，來提高該酵母的肌醇生產(chǎn)率的內(nèi)容。
[0006] 進(jìn)一步地，專利文獻(xiàn)11中還涉及甲醇利用性酵母畢赤酵母進(jìn)行肌醇生產(chǎn)的內(nèi)容， 其中公開了在該酵母中導(dǎo)入肌肉肌醇-1-磷酸合成酶基因并同時導(dǎo)入肌醇磷酸磷酸酯酶 基因的內(nèi)容，但未明確該追加的肌醇磷酸磷酸酯酶基因?qū)氲囊饬x和效果。
[0007] 因而，關(guān)于上述酵母的任一文獻(xiàn)均是以在一系列的肌肉肌醇生物合成反應(yīng)中肌 醇-1-磷酸合成酶承擔(dān)控速反應(yīng)為前提的，并未暗示存在于肌肉肌醇生物合成通路中的除 此以外的酶的重要性。
[0008] 另一方面，對于以大腸桿菌為代表的原核微生物，由于其旺盛的增殖能力及發(fā)酵 管理中的各種優(yōu)越性，與酵母相比，其為極富魅力的工業(yè)生產(chǎn)用生物。但是，具有內(nèi)源性肌 肉肌醇生物合成通路的原核微生物尚不為人所知。
[0009] 因而，為了利用原核微生物進(jìn)行肌肉肌醇的工業(yè)生產(chǎn)，在原核微生物宿主內(nèi)構(gòu)建 外來性的肌肉肌醇生物合成通路為不可缺的。
[0010] 具體地說，為了在原核微生物宿主內(nèi)構(gòu)建功能性肌肉肌醇生物合成通路，下述催 化劑活性為必要的：
[0011] 活性1 :由適當(dāng)?shù)奶荚瓷善咸烟?6-磷酸的活性；
[0012] 活性2 :將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)換為肌肉肌醇-1-磷酸的活性、即肌醇-1-磷酸合成 酶活性；和
[0013] 活性3 :以肌肉肌醇-1-磷酸為底物的磷酸酯酶活性。
[0014] 但是，由于作為活性1的生成物的葡萄糖-6-磷酸為原核微生物普遍產(chǎn)生的代謝 中間體，因而對原核微生物賦予該活性并非為必須的。此外，對于活性3來說，就本發(fā)明人 所知，大多數(shù)適于通過現(xiàn)有的基因重組方法進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)的原核微生物宿主細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源 性肌醇單磷酸酶、或者具有能夠以肌肉肌醇-1-磷酸為底物的通用單磷酸酶活性。此外，若 對活性2進(jìn)行觀察，則多為原核微生物不具有肌醇-1-磷酸合成酶基因的示例。并且，如上 所述，在肌肉肌醇生物合成反應(yīng)中，認(rèn)為肌醇-1-磷酸合成酶承擔(dān)控速反應(yīng)。因而，為了在 原核微生物宿主內(nèi)構(gòu)建功能性肌肉肌醇生物合成通路，認(rèn)為在該細(xì)胞中導(dǎo)入肌醇-1-磷酸 合成酶基因是充分必要的。
[0015] 實際上，非專利文獻(xiàn)1公開了肌肉肌醇在大腸桿菌轉(zhuǎn)化體內(nèi)的生產(chǎn)，但僅在該轉(zhuǎn) 化體中導(dǎo)入了肌醇-1-磷酸合成酶基因。
[0016] 專利文獻(xiàn)12中還公開了在大腸桿菌宿主細(xì)胞中僅導(dǎo)入肌醇-1-磷酸合成酶基因 來制作轉(zhuǎn)化體、由此在該轉(zhuǎn)化體內(nèi)構(gòu)建外來性肌肉肌醇生物合成通路的內(nèi)容。但是，該文獻(xiàn) 的最終目的生成物為D-葡糖二酸，肌肉肌醇是作為中間體生產(chǎn)的。特別要指出的是，該文 獻(xiàn)中還記載了下述內(nèi)容："還應(yīng)該注意到，本發(fā)明中的suhB基因或相同的磷酸酯酶并未過 剩表達(dá)。但是，在培養(yǎng)產(chǎn)物中未檢測出肌肉肌醇-1-磷酸，另一方面卻蓄積了肌肉肌醇。因 而發(fā)明人得出結(jié)論，磷酸酯酶活性并未限制通過通路的代謝流（flux)。"（第33頁、第2? 5行）。
[0017] 因而，現(xiàn)有技術(shù)并未公開或暗示肌醇單磷酸酶在通過重組微生物進(jìn)行肌肉肌醇生 產(chǎn)中的決定性作用。
[0018] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0019] 專利文獻(xiàn)
[0020] 專利文獻(xiàn)1 :日本特開平8-00258號公報
[0021] 專利文獻(xiàn)2 :日本特開平8-38188號公報
[0022] 專利文獻(xiàn)3 :日本特開平8-89262號公報
[0023] 專利文獻(xiàn)4 :日本特開平9-117295號公報
[0024] 專利文獻(xiàn)5 :日本特開平10-42860號公報
[0025] 專利文獻(xiàn)6 :日本特開平10-42882號公報
[0026] 專利文獻(xiàn)7 :日本特開平10-42883號公報
[0027] 專利文獻(xiàn)8 :日本特開2000-41689公報
[0028] 專利文獻(xiàn)9 :日本特開平9-220093號公報
[0029] 專利文獻(xiàn)10 :日本特開平10-271995號公報
[0030] 專利文獻(xiàn)11 :日本特開2011-55722號公報
[0031] 專利文獻(xiàn)12 :W02009/145838號小冊子
[0032] 非專利文獻(xiàn)
[0033] 非專利文獻(xiàn) 1 :J.Am.Chem.Soc. 1999,Vol. 121，3799-3800


【發(fā)明內(nèi)容】

[0034] 發(fā)明所要解決的課題
[0035] 對于不具有內(nèi)源性肌肉肌醇生物合成通路的微生物，通過使用與基因重組技術(shù)聯(lián) 合的合成生物學(xué)方法，其具有容易調(diào)節(jié)肌肉肌醇生產(chǎn)率的優(yōu)點(diǎn)。特別是大腸桿菌等原核微 生物宿主除了不具有內(nèi)源性肌肉肌醇生物合成通路以外，還不具有多數(shù)酵母所具有的肌醇 同化能力（分解能力），因而更容易應(yīng)用合成生物學(xué)的方法。此外，對于大腸桿菌來說，由于 其迅速的生長能力及發(fā)酵管理的容易性，從工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的方面考慮其是極富魅力的，同 時從應(yīng)用基因重組技術(shù)時的實際成績、確定的安全性的方面出發(fā)也具有優(yōu)點(diǎn)。
[0036] 因而，本發(fā)明所要解決的課題在于對不具有內(nèi)源性肌肉肌醇生物合成通路的宿主 微生物賦予顯著得到改善的肌肉肌醇和相關(guān)衍生物的生產(chǎn)能力。
[0037] 解決課題的手段
[0038] 如上所述，在迄今為止的任一研究中，均暗示了肌醇-1-磷酸合成酶在肌肉肌醇 生物合成反應(yīng)中承擔(dān)控速反應(yīng)的內(nèi)容。并且，在任一研究中均未對肌醇單磷酸酶活性予以 特別關(guān)注。
[0039] 但是，本發(fā)明人令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，在不具有內(nèi)源性肌肉肌醇生物合成通路的宿主 微生物內(nèi)導(dǎo)入肌肉肌醇生物合成通路而得到的轉(zhuǎn)化體中，肌醇單磷酸酶活性具有重大的作 用。出人預(yù)料地，通過增強(qiáng)肌醇單磷酸酶活性，這樣的轉(zhuǎn)化體的肌肉肌醇生產(chǎn)能力大幅提 高。本發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在這樣的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中表達(dá)出了新型的肌肉肌醇衍生物。
[0040] 因而，本發(fā)明的第1方面在于：
[0041] (1) 一種肌肉肌醇或肌肉肌醇衍生物的制造方法，其包括下述工序：
[0042] 1)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化體的工序，該轉(zhuǎn)化體為不表達(dá)內(nèi)源性肌醇-1-磷酸合成酶的微生物的 轉(zhuǎn)化體，其至少含有以能夠在該轉(zhuǎn)化體內(nèi)表達(dá)的方式導(dǎo)入的編碼肌醇-1-磷酸合成酶的外 來基因，并且具有對該轉(zhuǎn)化體內(nèi)的功能性肌醇單磷酸酶的過剩生產(chǎn)或肌醇單磷酸酶的活化 進(jìn)行誘導(dǎo)的基因重組或變異；以及
[0043] 2)在適于上述轉(zhuǎn)化體的生長和/或維持的條件下，使該轉(zhuǎn)化體與能夠由該轉(zhuǎn)化體 轉(zhuǎn)換為肌肉肌醇的碳源進(jìn)行接觸的工序。
[0044] 更特定地說，上述制造方法為使用下述轉(zhuǎn)化體的肌肉肌醇或肌肉肌醇衍生物的制 造方法，該轉(zhuǎn)化體為具有以能夠表達(dá)的方式導(dǎo)入到不表達(dá)內(nèi)源性肌醇-1-磷酸合成酶的微 生物內(nèi)的編碼肌醇-1-磷酸合成酶的外來基因的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，上述轉(zhuǎn)化體具有對 功能性肌醇單磷酸酶的過剩生產(chǎn)或肌醇單磷酸酶的活化進(jìn)行誘導(dǎo)的基因重組或變異。
[0045] 上述（1)的培養(yǎng)物中生產(chǎn)的肌肉肌醇衍生物為新穎的化合物，在該衍生物中，葡 萄糖與肌肉肌醇呈0 1 -4鍵合。因而，本發(fā)明的一個方式為：
[0046] (2)如上述（1)所述的制造方法，其中，上述肌肉肌醇衍生物為下述結(jié)構(gòu)式所表示 的化合物：
[0047] [化 1]
[0048]

【權(quán)利要求】
1. 一種肌肉肌醇或肌肉肌醇衍生物的制造方法，其包括下述工序： 1) 準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化體的工序，該轉(zhuǎn)化體為不表達(dá)內(nèi)源性肌醇-1-磷酸合成酶的微生物的轉(zhuǎn)化 體，其至少含有以能夠在該轉(zhuǎn)化體內(nèi)表達(dá)的方式導(dǎo)入的編碼肌醇-1-磷酸合成酶的外來基 因，并且具有對該轉(zhuǎn)化體內(nèi)的功能性肌醇單磷酸酶的過剩生產(chǎn)或肌醇單磷酸酶的活化進(jìn)行 誘導(dǎo)的基因重組或變異；以及 2) 在適于所述轉(zhuǎn)化體的生長和/或維持的條件下，使該轉(zhuǎn)化體與能夠由該轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)換 為肌肉肌醇的碳源進(jìn)行接觸的工序。
2. 如權(quán)利要求1所述的制造方法，其中，所述肌肉肌醇衍生物為下述結(jié)構(gòu)式所表示的 化合物： [化1]
3. 如權(quán)利要求1或2所述的制造方法，其中，所述不表達(dá)內(nèi)源性肌醇-1-磷酸合成酶的 微生物為原核生物。
4. 如權(quán)利要求1至3的任一項所述的制造方法，其中，所述不表達(dá)內(nèi)源性肌醇-1-磷酸 合成酶的微生物為具有內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的微生物。
5. 如權(quán)利要求1至4的任一項所述的制造方法，其中，所述不表達(dá)內(nèi)源性肌醇-1-磷酸 合成酶的微生物為選自由大腸桿菌、芽胞桿菌屬細(xì)菌、棒狀桿菌屬細(xì)菌、發(fā)酵單胞菌屬細(xì)菌 組成的組中的細(xì)菌。
6. 如權(quán)利要求5所述的制造方法，其中，所述細(xì)菌為大腸桿菌。
7. 如權(quán)利要求1至6的任一項所述的制造方法，其中，所述肌醇單磷酸酶的過剩生產(chǎn)是 通過對所述微生物進(jìn)行以下操作而誘導(dǎo)的： a) 導(dǎo)入外來肌醇單磷酸酶基因； b) 增加內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的拷貝數(shù)； c) 在內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的調(diào)節(jié)區(qū)域?qū)胱儺悾? d) 利用高表達(dá)誘導(dǎo)性外來調(diào)節(jié)區(qū)域來置換內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的調(diào)節(jié)區(qū)域；或 者 e) 使內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的調(diào)節(jié)區(qū)域缺失。
8. 如權(quán)利要求7所述的制造方法，其中，所述肌醇單磷酸酶的過剩生產(chǎn)是通過對所述 微生物導(dǎo)入外來肌醇單磷酸酶基因而誘導(dǎo)的。
9. 如權(quán)利要求1至6的任一項所述的制造方法，其中，所述肌醇單磷酸酶的活化是通過 對所述微生物進(jìn)行以下操作而誘導(dǎo)的： f) 在內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因中導(dǎo)入變異； g) 置換內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的一部分或全部； h) 使內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的一部分缺失； i) 使降低肌醇單磷酸酶活性的其它蛋白質(zhì)減少； j) 使降低肌醇單磷酸酶活性的化合物的生成減少。
10. 如權(quán)利要求1至9的任一項所述的制造方法，其中，所述碳源包含可在所述轉(zhuǎn)化體 內(nèi)轉(zhuǎn)換為葡萄糖-6-磷酸的化合物。
11. 如權(quán)利要求10所述的制造方法，其中，所述碳源為選自由D-葡萄糖、蔗糖、寡糖、多 糖、淀粉、纖維素、米糠、廢糖蜜以及含有D-葡萄糖的生物物質(zhì)組成的組中的1種以上。
12. 如權(quán)利要求1至11的任一項所述的制造方法，其中，該方法進(jìn)一步包括以下工序： 分離肌肉肌醇或肌肉肌醇衍生物的工序，該肌肉肌醇或肌肉肌醇衍生物是在與所述碳 源的接觸下進(jìn)行生長和/或維持的所述轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物中累積得到的。
13. -種轉(zhuǎn)化體，其為不表達(dá)內(nèi)源性肌醇-1-磷酸合成酶的微生物的轉(zhuǎn)化體，該轉(zhuǎn)化體 至少含有以能夠在該轉(zhuǎn)化體內(nèi)表達(dá)的方式導(dǎo)入的編碼肌醇-1-磷酸合成酶的外來基因，并 且具有對該轉(zhuǎn)化體內(nèi)的功能性肌醇單磷酸酶的過剩生產(chǎn)或肌醇單磷酸酶的活化進(jìn)行誘導(dǎo) 的基因重組或變異。
14. 如權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述不表達(dá)內(nèi)源性肌醇-1-磷酸合成酶的微生 物為原核生物。
15. 如權(quán)利要求13或14所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述不表達(dá)內(nèi)源性肌醇-1-磷酸合成酶 的微生物為具有內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的微生物。
16. 如權(quán)利要求13至15的任一項所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述不表達(dá)內(nèi)源性肌醇-1-磷 酸合成酶的微生物為選自由大腸桿菌、芽胞桿菌屬細(xì)菌、棒狀桿菌屬細(xì)菌、發(fā)酵單胞菌屬細(xì) 菌組成的組中的細(xì)菌。
17. 如權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述細(xì)菌為大腸桿菌。
18. 如權(quán)利要求13至17的任一項所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述肌醇單磷酸酶的過剩生產(chǎn) 是通過對所述微生物進(jìn)行以下操作而誘導(dǎo)的： a) 導(dǎo)入外來肌醇單磷酸酶基因； b) 增加內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的拷貝數(shù)； c) 在內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的調(diào)節(jié)區(qū)域?qū)胱儺悾? d) 利用高表達(dá)誘導(dǎo)性外來調(diào)節(jié)區(qū)域來置換內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的調(diào)節(jié)區(qū)域；或 者 e) 使內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的調(diào)節(jié)區(qū)域缺失。
19. 如權(quán)利要求18所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述肌醇單磷酸酶的過剩生產(chǎn)是通過對所述 微生物導(dǎo)入外來肌醇單磷酸酶基因而誘導(dǎo)的。
20. 如權(quán)利要求13至17的任一項所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述肌醇單磷酸酶的活化是通 過對所述微生物進(jìn)行以下操作而誘導(dǎo)的： f) 在內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因中導(dǎo)入變異； g) 置換內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的一部分或全部； h) 使內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的一部分缺失； i) 使降低肌醇單磷酸酶活性的其它蛋白質(zhì)減少； j) 使降低肌醇單磷酸酶活性的化合物的生成減少。
21. 下述結(jié)構(gòu)式所表示的化合物： [化2]
O
22. -種肌肉肌醇的制造方法，其特征在于，利用能夠催化β-糖苷鍵的水解反應(yīng)的酶 將權(quán)利要求21所述的肌肉肌醇衍生物分解，生成肌肉肌醇。
23. -種組合物，其含有權(quán)利要求21所述的肌肉肌醇衍生物。
【文檔編號】C12N1/21GK104271756SQ201280050798
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月14日
【發(fā)明者】小西一誠, 今津晉一, 佐藤真弓 申請人:旭化成化學(xué)株式會社