α-淀粉酶變體以及對其進(jìn)行編碼的多核苷酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明還涉及編碼這些變體的多核苷酸；包含這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體以及宿主細(xì)胞；以及使用這些變體的方法。
【專利說明】α-淀粉酶變體以及對其進(jìn)行編碼的多核苷酸
[000?] 序列表的引用
[0002]本申請含有呈計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，將該序列表通過引用結(jié)合在此。
[0003]發(fā)明背景
發(fā)明領(lǐng)域
[0004]本發(fā)明涉及α -淀粉酶變體、編碼這些變體的多核苷酸、產(chǎn)生這些變體的方法，以及使用這些變體的方法。
[0005]相關(guān)技術(shù)說明
[0006]α -淀粉酶(E.C.3.2.1.1)構(gòu)成催化淀粉、糖原以及相關(guān)多糖以及低聚糖的水解
的一組酶。
[0007]α-淀粉酶在商業(yè)上用于各種用途，如在淀粉加工(例如，液化)的初始階段中；在濕磨過程中；以及在從碳水化合物來源產(chǎn)生醇中。其還用作清洗劑或在洗滌劑基質(zhì)中的輔助物；在紡織工業(yè)中用于淀粉退漿；用于烘焙應(yīng)用中；用于飲料行業(yè)中；用于油田的鉆探過程中；在回收過程中例如用于使紙去墨；以及用于動物飼料中。
[0008]例如用于淀粉液化的一些商業(yè)α-淀粉酶來源于地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)或嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus)。已經(jīng)開發(fā)野生型酶的蛋白質(zhì)工程化變體來克服過程問題。然而，仍然需要具有改進(jìn)特性的新穎α-淀粉酶，如在低pH、低鈣以及高溫下的較高穩(wěn)定性。這類酶將允許淀粉液化過程在降低的pH下進(jìn)行，從而對于化學(xué)品節(jié)省具有積極影響。
[0009]本發(fā)明的目標(biāo)是提供在低pH下和/或在高溫下，尤其在低鈣濃度下具有增加穩(wěn)定性的新穎α-淀粉酶變體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包括在對應(yīng)于SEQ ID Ν0:1的位置1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、176、185、201、205、213、239、279、316、318、360、416、437 以及 450 中的任何位
置的一個或多個位置處的改變的α -淀粉酶變體在低PH下和/或在高溫下，尤其在低鈣濃度下，并且尤其在存在至少0.1%淀粉的情況下，例如，在存在0.9%或1%淀粉的情況下孵育時，具有增加的穩(wěn)定性。
[0011] 因此，本發(fā)明涉及包括在對應(yīng)于SEQ ID Ν0:1的位置1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、176、185、201、205、213、239、279、316、318、360、416、437 以及 450 中的任何位置的一個或多個位置處的改變的α -淀粉酶變體，其中該變體與以下具有至少60%并且小于 100% 的序列一致性:(i)SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13 或 14 中的任何一個的成熟多肽，或(ii) SEQ ID NO:1的氨基酸I至483、SEQ ID NO: 2的氨基酸I至483、SEQ ID NO: 3的氨基酸I至485、SEQ ID NO:4的氨基酸I至482、SEQ ID NO: 5的氨基酸I至 484、SEQ ID NO:6 的氨基酸 I 至 483、SEQ ID NO:7 的氨基酸 I 至 485、SEQ ID NO:8 的氨基酸I至485、SEQ ID NO:9的氨基酸I至485、SEQ ID NO: 10的氨基酸I至485、SEQ IDNO: 11的氨基酸I至485、SEQ ID NO: 12的氨基酸I至480、SEQ ID NO: 13的氨基酸I至483或SEQ ID NO: 14的氨基酸I至481，并且其中該變體具有α -淀粉酶活性。
[0012]本發(fā)明還涉及編碼這些變體的分離的多核苷酸，包含這些多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體以及宿主細(xì)胞；以及產(chǎn)生這些變體的方法。
[0013]本發(fā)明還涉及本發(fā)明的變體的用途并且涉及一種生產(chǎn)液化淀粉的方法以及一種生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法。
[0014]附圖簡要說明
[0015]圖1示出具有以下氨基酸序列的α -淀粉酶的比對:
[0016]SEQ ID NO:1是地衣芽孢桿菌α -淀粉酶。
[0017]SEQ ID Ν0:2是嗜熱脂肪芽孢桿菌α -淀粉酶。
[0018]SEQ ID NO: 3 是在應(yīng)用微生物學(xué)雜志(J.Appl.Microbiology)，1997，82:325-334(SffALL:q59222)中描述的芽孢桿菌α -淀粉酶TS-23。
[0019]SEQ ID NO:4 是在 W02005/001064 中描述的黃熱芽孢桿菌(Bacillusf Iavothermus ) α -淀粉酶 ΑΜΥ1048。
[0020]SEQ ID Ν0:5是在W004/113511中描述為SEQ ID NO: 21的芽孢桿菌α -淀粉酶TS-22。
[0021]SEQ ID NO:6 是解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens) α -淀粉酶。
[0022]SEQ ID NO: 7是在W095/26397中描述為SEQ ID NOl的芽孢桿菌堿性屬種SP690
淀粉酶。
[0023]SEQ ID NO:8 是在 W095/26397 中描述為 SEQ ID Ν02 的鹽敏芽孢桿菌(Bacillushalmapalus) α -淀粉酶。 [0024]SEQ ID NO:9是在W000/60060中描述為SEQ ID Ν04的芽孢桿菌堿性屬種ΑΑ560
淀粉酶。
[0025]SEQ ID NO: 10是在W0200210356中描述為SEQ ID Ν02的芽孢桿菌堿性屬種Α7-7
淀粉酶。
[0026]SEQ ID NO: 11是在冢本高(Tsukamoto)等人，1988，生物化學(xué)與生物物理研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.) 151:25-33)中描述的芽抱桿菌喊性屬種SP707淀粉酶。
[0027]SEQ ID NO: 12是在EP1022334中描述為SEQ ID N02的芽孢桿菌堿性屬種K-38淀粉酶。
[0028]SEQ ID NO: 13 是在李(Lee)等人，2006，生物化學(xué)雜志(J.Biochem)，139:997-1005中描述的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶。
[0029]SEQ ID NO: 14是以前在例如W02002/010355中披露的變體α -淀粉酶LE399。
[0030]定義
[0031]等位基因變體:術(shù)語“等位基因變體”意指占據(jù)同一染色體基因座的基因的兩種或更多種可替代形式中的任一種。等位基因變異是通過突變自然地引起，并且可能在群體內(nèi)導(dǎo)致多態(tài)現(xiàn)象?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中沒有變化)或者可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多肽。
[0032]α -淀粉酶:α -淀粉酶(E.C.3.2.1.1)是催化淀粉以及其他線性以及分支1，4糖苷鍵低聚糖以及多糖的水解的一組酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道如何確定α-淀粉酶活性。它可根據(jù)在實(shí)例中描述的程序例如通過PNP-G7測定來確定。在一方面，本發(fā)明的變體具有SEQ ID NO:1的成熟多肽的至少20%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少100%的α -淀粉酶活性。在另一方面，本申請的變體具有其親本的至少20%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少100%的α -淀粉酶活性。
[0033]cDNA:術(shù)語“cDNA”意指可以通過反轉(zhuǎn)錄從得自真核或原核細(xì)胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于對應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的、初級的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，它通過一系列的步驟加工，包括剪接，然后作為成熟的已剪接的mRNA出現(xiàn)。
[0034]編碼序列:術(shù)語“編碼序列”意指多核苷酸，它直接指定變體的氨基酸序列。編碼序列的邊界一般是通過以起始密碼子(例如ATG、GTG或TTG)開始并以終止密碼子(例如TAA、TAG或TGA)結(jié)束的一個開放閱讀框來決定。編碼序列可以是一個基因組DNA、cDNA、合成的DNA或其組合。
[0035]控制序列:術(shù)語“控制序列”意指對于表達(dá)編碼本發(fā)明的變體的多核苷酸所必需的核酸序列。每個控制序列針對編碼該變體的多核苷酸來說可以是原生的(即，來自相同基因)或者外源的(即，來自不同基因)，或者相對于彼此是原生的或外源的。這些控制序列包括(但不限于)前導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。至少，控制序列包括啟動子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號。出于引入有利于將這些控制序列與編碼一種變體的多核苷酸的編碼區(qū)連接的特異性限制酶切位點(diǎn)的目的，這些控制序列可以提供有多個接頭。
[0036]表達(dá):術(shù)語“表達(dá)”包括涉及到變體生產(chǎn)中的任何步驟，包括(但不局限于)轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾以及分泌。
[0037]表達(dá)載體:術(shù)語“表達(dá)載體”意指線性或環(huán)狀DNA分子，該分子包括編碼變體的多核苷酸并且該多核苷酸可操作地與提供`用于其表達(dá)的控制序列相連接。
[0038]片段:術(shù)語“片段”意指從成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一個或多個(例如，數(shù)個)氨基酸的多肽；其中該片段具有α-淀粉酶活性。在一方面，一個片段含有至少300個氨基酸殘基、至少350個氨基酸殘基、至少400個氨基酸殘基、至少450個氨基酸殘基、至少470個氨基酸殘基或至少480個氨基酸殘基。
[0039]宿主細(xì)胞:術(shù)語“宿主細(xì)胞”意指任何細(xì)胞類型，該細(xì)胞類型對于用包含本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的。術(shù)語“宿主細(xì)胞”涵蓋了由于在復(fù)制過程中存在的突變而與親本細(xì)胞不相同的親本細(xì)胞的任何子代。
[0040]分離的:術(shù)語“分離的”意指處于自然界中不出現(xiàn)的形式或環(huán)境中的物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限制實(shí)例包括(I)任何非天然存在的物質(zhì)；(2)至少部分地從在自然界中與其締合的一種或多種或全部天然存在的組分中除去的任何物質(zhì)，包括(但不局限于)任何酶、變體、核酸、蛋白質(zhì)、肽或輔因子；(3)相對于自然界中發(fā)現(xiàn)的那種物質(zhì)通過人工加以修飾的任何物質(zhì)；或者(4)通過相對于與其天然地締合的其他組分增加該物質(zhì)的量(例如，編碼該物質(zhì)的一個基因的多個拷貝；比與編碼該物質(zhì)的基因天然地締合的啟動子更強(qiáng)的啟動子的使用)而修飾的任何物質(zhì)。一種分離的物質(zhì)可以存在于發(fā)酵液樣品中。
[0041]成熟多肽:術(shù)語“成熟多肽”是指在翻譯以及任何翻譯后修飾，如N-末端處理、C-末端截斷、糖基化、磷酸化等之后的呈其最終形式的多肽。領(lǐng)域內(nèi)公知，宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生由相同多核苷酸表達(dá)的兩種或更多種不同成熟多肽(即，具有不同的C端和/或N端氨基酸)的混合物。成熟形式的一些α-淀粉酶例如一些細(xì)菌α-淀粉酶包括含有底物水解的活性位點(diǎn)的催化域以及用于結(jié)合碳水化合物底物(淀粉)的一個或多個碳水化合物結(jié)合模塊(CBM)以及任選地將CBM與催化域連接的多肽，后一類型的區(qū)域通常稱為“接頭”。
[0042]核酸構(gòu)建體:術(shù)語“核酸構(gòu)建體”意指單鏈亦或雙鏈的一種核酸分子，該核酸分子是從天然存在的基因中分離的，或者以一種否則將不存在于自然界中的方式被修飾成含有核酸的區(qū)段，或者是合成的，該核酸分子包含一個或多個控制序列。
[0043]可操作地連接:術(shù)語“可操作地連接”意指如下的配置，其中控制序列被放置在相對于多核苷酸的編碼序列的適當(dāng)位置處，使得控制序列指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。
[0044]親本或親本α-淀粉酶:術(shù)語“親本”或“親本α-淀粉酶”意指進(jìn)行變化以產(chǎn)生本發(fā)明的酶變體的α-淀粉酶。該親本可以是天然存在的(野生型)多肽或其變體或片段。
[0045]序列一致性:兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的關(guān)聯(lián)性通過參數(shù)“序列一致性”來說明。
[0046]出于本發(fā)明的目的，兩個氨基酸序列之間的序列一致性是使用如EMBOSS程序包(EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件(European Molecular Biology OpenSoftware Suite),賴斯(Rice)等人，2000,遺傳學(xué)趨勢(Trends Genet.) 16: 276-277)的尼德爾(Needle)程序(優(yōu)選地版本5.0.0或后來版本)中實(shí)施的內(nèi)德勒曼-文施(Needleman-Wunsch)算法(內(nèi)德勒曼(Needleman)和文施(Wunsch), 1970,分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)48:443-453)來確定。使用的參數(shù)是空位開放罰分10、空位擴(kuò)展罰分0.5以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。使用尼德爾(Needle)標(biāo)記為“最長一致性”的輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)被用作百分比一致性并且計(jì)算如下:
[0047](一致的殘基X 100)/(比對長度-比對中的空位總數(shù))
[0048]變體:術(shù)語“變體”意指在一個或多個(例如數(shù)個)位置處包括一種變化，即，一個取代、插入和/或缺失的具有α-淀粉酶活性的一種多肽。取代意指占據(jù)一個位置的氨基酸用不同氨基酸來置換；缺失意指除去占據(jù)一個位置的氨基酸；并且插入意指與占據(jù)一個位置的氨基酸相鄰來添加一個或多個(例如，數(shù)個)氨基酸，例如1-5個氨基酸。在一方面，本發(fā)明的變體具有SEQ ID NO:1的成熟多肽的至少20%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少100%的α -淀粉酶活性。在另一方面，本申請的變體具有其親本的至少20%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少100%的α -淀粉酶活性。α -淀粉酶活性可通過在實(shí)例中描述的PNP-G7測定來確定。
[0049]野生型α -淀粉酶:術(shù)語“野生型” α -淀粉酶意指由天然存在的微生物，如在自然界中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌、酵母或絲狀真菌來表達(dá)的α-淀粉酶。
[0050]用于變體命名的規(guī)則
[0051]出于本發(fā)明的目的，使用在SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽來確定另一種α -淀粉酶中的相應(yīng)氨基酸殘基。另一種α-淀粉酶的氨基酸序列與在SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽進(jìn)行比對，并且基于該比對，使用如EMBOSS程序包(EMBOSS:歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件(European Molecular Biology Open Software Suite),賴斯(Rice)等人，2000，遺傳學(xué)趨勢(Trends Genet.) 16:276-277)的尼德爾(Needle)程序(優(yōu)選地版本5.0.0或后來版本)中實(shí)施的內(nèi)德勒曼_文施(Needleman-Wunsch)算法(內(nèi)德勒曼(Needleman)和文施(Wunsch)，1970，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)48:443-453)來確定對應(yīng)于 SEQ ID NO:1 中披露的成熟多肽中的任何氨基酸殘基的氨基酸位置編號。使用的參數(shù)是空位開放罰分10、空位擴(kuò)展罰分0.5以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)取代矩陣。
[0052]另一個α-淀粉酶中的相應(yīng)氨基酸殘基的識別可通過使用若干計(jì)算機(jī)程序比對多個多肽序列來確定，這些程序包括但不限于，MUSCLE (通過對數(shù)預(yù)測來進(jìn)行多重序列比較；版本3.5或后來版本；埃德加(Edgar), 2004,核酸研究(Nucleic AcidsResearch) 32:1792-1797)，MAFFT (版本 6.857 或后來版本；加藤(Katoh)以及庫瑪(Kuma), 2002,核酸研究(Nucleic Acids Research) 30:3059-3066 ；加藤(Katoh)等人，2005,核酸研究(Nucleic Acids Research) 33:511-518 ；加藤(Katoh)以及都(Toh), 2007,生物信息學(xué)(Bioinformatics) 23:372-374 ;加藤(Katoh)等人，2009, Methods in MolecularBiologv537:39-64:加藤(Katoh)以及都(Toh)，2010，Bioinformatics26:1899-1900),以及使用 ClustalW 的 EMBOSS EMMAC 1.83 或后來版本；湯普森(Thompson)等人，1994,核酸研究(Nucleic Acids Research) 22:4673-4680),使用其相應(yīng)默認(rèn)參數(shù)。[0053]當(dāng)其他酶與SEQ ID NO:1的成熟多肽分歧，使得傳統(tǒng)基于序列的比較不能檢測其關(guān)系(林達(dá)爾(Lindahl)和埃洛弗松化1(^88011)，2000，分子生物學(xué)雜志(1.Mol.Biol.)295:613-615)時，可以使用其他成對序列比較算法。在基于序列的搜索中的更大靈敏度可以使用搜索程序來獲得，這些搜索程序利用多肽家族的概率表示(特征曲線)來搜索數(shù)據(jù)庫。例如，PS1-BLAST程序通過一個迭代數(shù)據(jù)庫搜索過程來產(chǎn)生多個特征曲線并且能夠檢測關(guān)系疏遠(yuǎn)的同源物(阿特休爾(Atschul)等人，1997,核酸研究(Nucleic Acids Res.)25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中具有一個或多個代表，則可以實(shí)現(xiàn)甚至更大的靈敏度。程序如GenTHREADER (瓊斯(Jones)，1999，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.) 287:797-815 ;麥高菲(McGuff in)和瓊斯(Jones)，2003，生物信息學(xué)(Bioinformatics) 19 =874-881)利用來自各種來源(PS1-BLAST、次級結(jié)構(gòu)預(yù)測、結(jié)構(gòu)比對輪廓以及溶劑化電位)的信息作為預(yù)測查詢序列的結(jié)構(gòu)折疊的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸入。類似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.) 313:903-919的方法可以用于將未知結(jié)構(gòu)的序列與存在于SCOP數(shù)據(jù)庫中的超家族模型比對。這些比對進(jìn)而可以用于產(chǎn)生多肽的同源性模型，并且使用出于該目的而開發(fā)的多種工具可以評定這類模型的準(zhǔn)確度。
[0054]對于已知結(jié)構(gòu)的蛋白，數(shù)種工具和資源可用于檢索并產(chǎn)生結(jié)構(gòu)比對。例如，蛋白的SCOP超家族已經(jīng)在結(jié)構(gòu)上進(jìn)行比對，并且那些比對是可訪問的并且可下載的。兩個或更多個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可以使用各種算法如距離比對矩陣(豪爾姆(Holm)和桑德(Sander), 1998,蛋白質(zhì)(Proteins) 33:88-96)或組合擴(kuò)展(辛德洛夫(Shindyalov)和伯恩(Bourne), 1998,蛋白質(zhì)工程(Protein Engineering) 11:739-747)來比對,并且這些算法的實(shí)施可以另外用于查詢具有所感興趣的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫以發(fā)現(xiàn)可能的結(jié)構(gòu)同源物(例如，豪爾姆(Holm)和派克(Park)，2000，生物信息學(xué)(Bioinformatics) 16:566-567)。
[0055]在描述本發(fā)明的變體中，以下所述的命名法適于引用方便。采用了已接受的IUPAC單個字母和三字母的氨基酸縮寫。[0056]取仕。對于一個氨基酸取代，使用了以下命名法:原始氨基酸、位置、取代的氨基酸。因此，在位置226上的蘇氨酸被丙氨酸取代被表示為“Thr226Ala”或者“T226A”。多個突變由加號(“ + ”)分開，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或者“G205R+S411F”，代表分別在位置205和位置411上甘氨酸(G)被精氨酸(R)并且絲氨酸(S)被苯丙氨酸(F)取代。在本申請的實(shí)例中，多個突變由空格分開，例如，G205R S411F代表G205R+S411F。
[0057]跡失。對于一個氨基酸缺失，使用了以下命名法:原始氨基酸、位置、*。因此，在位置195上的甘氨酸缺失被表示為“Glyl95*”或者“G195*”。多個缺失由加號(“ + ”)分開，例如，“Glyl95*+Ser411*，，或“G195*+S411*，，。
[0058]通入。對于一個氨基酸插入，使用了以下命名法:原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，在位置195上的甘氨酸之后插入賴氨酸被表示為“Glyl95GlyLys”或者“G195GK”。多個氨基酸的插入被表示為[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2 ;等]。例如，在位置195上的甘氨酸之后插入賴氨酸和丙氨酸被表示為 “Glyl95GlyLysAla” 或者 “G195GKA”。
[0059]在這類情況下，通過將小寫字母添加到在所插入的一個或多個氨基酸殘基之前的氨基酸殘基的位置編號中來對所插入的一個或多個氨基酸殘基進(jìn)行編號。在以上實(shí)例中，該序列因此將是:
[0060]
【權(quán)利要求】
1.一種α-淀粉酶變體，該變體包括在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置176的位置處的取代，尤其是取代K176L，并與在對應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、185、201、205、213、239、279、316、318、360、416、437 以及 450 中的任何位置的一個或多個位置處的改變相組合，這些改變尤其是選自下組的一個或多個改變，該組由以下各項(xiàng)組成:A1AH、A1AF、A1AY、A1AW、A1H、A1F、A1Y、A1W、N2NH、N2N2F、N2NY、N2NW、N2H、N2F、N2Y、N2W、H68F、H68Y、H68W、G71F、G71H、G71Y、G71W、N126F、N126H、N126Y、N126W、H133F、H133Y、H133W、H142F、H142Y、H142W、P144F、P144H、P144Y、P144W、Y156F、Y156H、Y156W、Y158F、Y158H、Y158W、E185P、I201F、I201Y、H205Y、K213T、S239A、S239Q、F279Y、F279W、H316F、H316Y、H316W、L318F、L318H、L318Y、L318W、Q360S、D416V、R437F、R437H、R437Y、R437W、H450F、H450Y以及H450W，優(yōu)選是選自下組的一個或多個改變，該組由以下各項(xiàng)組成:A1AH、A1AW、A1H、A1W、N2NH、N2NW、N2H、N2W、H68W、G71W、N126W、H133Y、H142W、P144W、Y156W、Y158W、E185P、I201Y、H205Y、K213T、S239A、S239Q、F279W、H316W、L318W、Q360S、D416V、R437W 以及H450W ;其中該變體與以下各項(xiàng)具有至少60%并且小于100%的序列一致性:(i)SEQ ID勵:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14中的任何一個的成熟多肽，或(ii)SEQ ID NO:1的氨基酸I至483、SEQ ID NO: 2的氨基酸I至483、SEQ ID NO: 3的氨基酸I至485、SEQ IDNO:4的氨基酸I至482、SEQ ID NO: 5的氨基酸I至484、SEQ ID NO:6的氨基酸I至483、SEQ ID NO: 7的氨基酸I至485、SEQ ID NO:8的氨基酸I至485、SEQ ID NO:9的氨基酸I至 485、SEQ ID NO: 10 的氨基酸 I 至 485、SEQ ID NO: 11 的氨基酸 I 至 485、SEQ ID NO: 12的氨基酸I至480、SEQ ID NO: 13的氨基酸I至483或SEQ ID NO: 14的氨基酸I至481，并且其中該變體具有α-淀粉酶活性。
2.如權(quán)利要求1所述的變體，該變體是一種分離的α-淀粉酶變體。
3.如權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的變體，該變體包括在對應(yīng)于位置68、185、201、205、213、360、416以及437中的任何位置的一個或多個位置處的取代，尤其是選自下組的一個或多個取代，該組由以下各項(xiàng)組成:H68W、E185P、I201Y、H205Y、K213T、Q360S、D416V以及 R437W。
4.如權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)`所`述的變體，該變體包括在對應(yīng)于位置2、68、133、142、156、158、279以及437中的任何位置的一個或多個位置處的取代，尤其是選自下組的一個或多個取代，該組由以下各項(xiàng)組成:N2H、H68W、H133Y、H142W、Y156W、Y158W、F279W以及R437W。
5.如權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的變體，該變體包括在對應(yīng)于位置1、2、68、71、126、`133、142、144、156、158、185、201、205、213、239、279、316、318、360、416、437 以及 450 中的任何位置的兩個或更多個位置處的改變，尤其是選自下組的兩個或更多個改變，該組由以下各項(xiàng)組成:A1AH、AIAF, AI AY, AlAff, A1H、A1F、A1Y、A1W、N2NH、N2N2F、N2NY、N2NW、N2H、N2F、N2Y、N2W、H68F、H68Y、H68W、G71F、G71H、G71Y、G71W、N126F、N126H、N126Y、N126W、H133F、H133Y、H133W、H142F、H142Y、H142W、P144F、P144H、P144Y、P144W、Y156F、Y156H、Y156W、Y158F、Y158H、Y158W、E185P、I201F、I201Y、H205Y、K213T、S239A、S239Q、F279Y、F279W、H316F、H316Y、H316W、L318F、L318H、L318Y、L318W、Q360S、D416V、R437F、R437H、R437Y、R437W、H450F、H450Y以及H450W，優(yōu)選是選自下組的兩個或更多個改變，該組由以下各項(xiàng)組成:A1AH、AlAff, A1H、A1W、N2NH、N2NW、N2H、N2W、H68W、G71W、N126W、H133Y、H142W、P144W、Y156W、Y158W、E185P、I201Y、H205Y、K213T、S239A、S239Q、F279W、H316W、L318W、Q360S、D416V、R437W 以及 H450W。
6.如權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的變體，該變體包括在對應(yīng)于位置68、185、201、205、213、360、416以及437中的任何位置的兩個或更多個位置處的取代，尤其是選自下組的兩個或更多個取代，該組由以下各項(xiàng)組成:H68W、E185P、I201Y、H205Y、K213T、Q360S、D416V 以及 R437W。
7.如權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的變體，該變體包括在對應(yīng)于位置2、68、133、142、156、158、279以及437中的任何位置的兩個或更多個位置處的取代，尤其是選自下組的兩個或更多個取代，該組由以下各項(xiàng)組成:N2H、H68W、H133Y、H142W、Y156W、Y158W、F279W以及R437W。
8.如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的變體，其中該變體與以下各項(xiàng)具有至少65%、例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%，但小于100%的序列一致性:(i) SEQ IDN0:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13 或 14 中的任何一個的成熟多肽，或(ii)SEQ ID NO:1的氨基酸I至483、SEQ ID NO: 2的氨基酸I至483、SEQ ID NO: 3的氨基酸I至485、SEQ IDNO:4的氨基酸I至482、SEQ ID NO: 5的氨基酸I至484、SEQ ID NO:6的氨基酸I至483、SEQ ID NO: 7的氨基酸I至485、SEQ ID NO:8的氨基酸I至485、SEQ ID NO:9的氨基酸I至 485、SEQ ID NO: 10 的氨基酸 I 至 485、SEQ ID NO: 11 的氨基酸 I 至 485、SEQ ID NO: 12的氨基酸I至480、SEQ ID NO: 13的氨基酸I至483、或SEQ ID NO: 14的氨基酸I至481。
9.如權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的變體，該變體是選自下組的一種親本α-淀粉酶的一種變體，該組由以下各項(xiàng)組成: (a)一種與以下項(xiàng)具有至少60%序列一致性的多肽:(i) SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14中 的任何一個的成熟多肽，或(ii)SEQ ID NO:1的氨基酸I至483、SEQ ID NO: 2的氨基酸I至483、SEQ ID NO: 3的氨基酸I至485、SEQ ID NO:4的氨基酸I至 482、SEQ ID NO:5 的氨基酸 I 至 484、SEQ ID NO:6 的氨基酸 I 至 483、SEQ ID NO:7 的氨基酸I至485、SEQ ID NO:8的氨基酸I至485、SEQ ID NO:9的氨基酸I至485、SEQ IDNO: 10的氨基酸I至485、SEQ ID NO: 11的氨基酸I至485、SEQ ID NO: 12的氨基酸I至480、SEQ ID NO: 13的氨基酸I至483、或SEQ ID NO: 14的氨基酸I至481 ;或 (b)SEQID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13 或 14 中的任何一個的成熟多肽的片段，該片段具有α-淀粉酶活性。
10.如權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的變體用于液化一種含淀粉的材料的用途。
11.一種編碼如權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的變體的分離的多核苷酸。
12.—種包含如權(quán)利要求11所述的多核苷酸的核酸構(gòu)建體。
13.—種包含如權(quán)利要求11所述的多核苷酸的表達(dá)載體。
14.一種包含如權(quán)利要求11所述的多核苷酸的宿主細(xì)胞。
15.—種生產(chǎn)一種α-淀粉酶變體的方法，包括: a.在適合于表達(dá)該變體的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求14所述的宿主細(xì)胞；并且 b.回收該變體。
16.一種用于獲得一種α-淀 粉酶變體的方法，該方法包括(a)向一種親本α-淀粉酶中引入在對應(yīng)于SEQ ID N0:1 的位置 1、2、68、71、126、133、142、144、156、158、176、185、201、·205、213、239、279、316、318、360、416、437以及450中的任何位置的一個或多個位置處的取代；并且(b)回 收該變體。
【文檔編號】C12N9/26GK103890170SQ201280050886
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年10月17日
【發(fā)明者】C.安德森, S.拉森, E.P.弗里斯, P.O.米歇爾森, A.維克索-尼爾森, R.迪恩哈默, X.沈 申請人:諾維信公司