專(zhuān)利名稱(chēng)：生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化木薯原生質(zhì)體的方法
遺傳修飾或轉(zhuǎn)化是向商業(yè)上感興趣的基因型或克隆中加入一種或幾種基因的技術(shù)。原則上，一個(gè)成功的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)需要一個(gè)從特定植物部分(莖、葉、節(jié)等)或從這些部分產(chǎn)生的原生質(zhì)體(無(wú)細(xì)胞壁的單個(gè)細(xì)胞)形成新植物的有效系統(tǒng)，一個(gè)將DNA分子轉(zhuǎn)移給植物部分或原生質(zhì)體的系統(tǒng)和一個(gè)選擇含有并表達(dá)導(dǎo)入基因的組織和植物的系統(tǒng)。
原則上，原生質(zhì)體是最理想的DNA傳遞系統(tǒng)。它們可作為單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，該單細(xì)胞產(chǎn)生多細(xì)胞集落，從該多細(xì)胞集落發(fā)育成植物。
原生質(zhì)體產(chǎn)生的植物在起源上一般是純系的。這給任意轉(zhuǎn)化系統(tǒng)提供了有用的工具，因?yàn)樗宿D(zhuǎn)基因植物中的嵌合狀態(tài)。
木薯極難進(jìn)行原生質(zhì)體的植物再生。從木薯原生質(zhì)體再生幼苗只有一例報(bào)道(Shahin和Shephard,1980)。他們使用充分伸展的葉片用于分離原生質(zhì)體。盡管付出了相當(dāng)大的努力，但此后未能重復(fù)從原生質(zhì)體(從葉，莖和根分離出)再生植物(Anonymus,1985；Nzoghe,1991；Anthony等，1995；Sofiary,1996)。一種邏輯探索是使用含胚發(fā)生細(xì)胞的組織，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞存在于頂端分生組織，幼葉或在補(bǔ)充了生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的體細(xì)胞胚中(Stamp和Henshaw,1987a；Raemakers等，1993a)。然而，從這些組織分離的原生質(zhì)體在最佳情況下產(chǎn)生綠色愈傷組織和不定根(Sofiari,1996)。最近，建立了一種新型的體細(xì)胞胚發(fā)生。其中，在體外系統(tǒng)中，胚發(fā)育不超過(guò)球形期(球形前期)，且胚發(fā)生愈傷組織具有高度脆性(Taylor等，1995)。將這種脆性胚發(fā)生愈傷組織(FEC)轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中產(chǎn)生懸浮樣培養(yǎng)物。在韭菜(Buitenveld和Ceemers,1994)，矮牽牛屬植物(Power等，1979)，水稻(Kyozuka等，1988)，甘蔗(Chen，等，1988)和小麥(Chang等，1991)中，該培養(yǎng)物是原生質(zhì)體再生的最佳來(lái)源。
我們現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)在木薯中，F(xiàn)EC是至今可分離出能再生成植物的原生質(zhì)體的唯一組織。
因此，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)木薯或近親物種的原生質(zhì)體的方法，該原生質(zhì)體可再生成植物，該方法包括從木薯或近親物種的外植體產(chǎn)生脆性胚發(fā)生愈傷組織并從所說(shuō)的脆性胚發(fā)生愈傷組織分離原生質(zhì)體。正如下文所述，似乎為了獲得合適的原生質(zhì)體，將FEC在溶液中培養(yǎng)是十分重要的。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)脆性胚發(fā)生愈傷組織的方法。
優(yōu)選經(jīng)過(guò)對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞壁的酶促分解來(lái)生產(chǎn)原生質(zhì)體。因此，本發(fā)明提供了一種使用諸如纖維素酶，果膠溶酶和/或離析酶等細(xì)胞壁降解酶的混合物生產(chǎn)原生質(zhì)體的方法。
還可見(jiàn)當(dāng)獲取外植體的植物被預(yù)處理時(shí)根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生最佳效果。因此，本發(fā)明提供了一種如下所述用生長(zhǎng)素預(yù)處理獲取外植體的植物的方法。
優(yōu)選在外植體上誘導(dǎo)的胚發(fā)生產(chǎn)生了本發(fā)明的方法，以該方法從魚(yú)雷形初生或成熟胚產(chǎn)生脆性胚發(fā)生愈傷組織。其原因在詳細(xì)描述中解釋。以上面公開(kāi)的方法獲得的原生質(zhì)體也是本發(fā)明的一個(gè)部分。
需要能再生成植物的原生質(zhì)體的一個(gè)重要原因當(dāng)然是原生質(zhì)體容易被轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)或以任何其它合適的方法提供額外的遺傳信息。因此，人們現(xiàn)在能夠提供帶有感興趣的遺傳物質(zhì)的木薯植物或近親物種。因此，本發(fā)明還提供了一種經(jīng)過(guò)用含有所說(shuō)的額外遺傳信息的細(xì)菌，如根癌土壤桿菌來(lái)感染，經(jīng)過(guò)電穿孔或化學(xué)穿孔提供含有所說(shuō)的額外遺傳信息的載體或經(jīng)過(guò)用包被有額外遺傳信息的顆粒進(jìn)行粒子轟擊給所說(shuō)的原生質(zhì)體提供額外的遺傳信息來(lái)轉(zhuǎn)化(定義為以任何合適的方式提供)木薯或近親物種的原生質(zhì)體的方法，以此轉(zhuǎn)化從脆性胚發(fā)生愈傷組織獲得的原生質(zhì)體。本發(fā)明還包含以該方法獲得的轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體。
下面對(duì)轉(zhuǎn)化植物，如木薯的用途提供了一個(gè)簡(jiǎn)短的說(shuō)明。
植物基因技術(shù)的應(yīng)用包括從分離有用基因，其鑒定和操作到向植物再導(dǎo)入修飾的構(gòu)建體的多種不同的技術(shù)(Lonsdale,1987)。植物基因技術(shù)可加快植物育種的進(jìn)程，這可用一些轉(zhuǎn)基因莊稼的例子，如水稻(Chen等，1987；Shimamoto等，1989)，玉米(Gordon-kamn等，1990；Vain等，1993)，小麥(Marks等，1989)，和土豆(DeBlock,1988；Visser等，1989)來(lái)舉例說(shuō)明?；蚣夹g(shù)的迅速進(jìn)展使得能洞悉植物病理識(shí)別的復(fù)雜分子機(jī)制和宿主植物的天然防御策略。該技術(shù)也可用于控制和有效鑒定所需基因型，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了傳統(tǒng)育種的可能性。
例如，對(duì)懸浮培養(yǎng)物產(chǎn)生的原生質(zhì)體進(jìn)行電穿孔導(dǎo)致轉(zhuǎn)化玉米(Rhodes，等，1988)，水稻(Torigama等，1988)和鴨茅(Horn等，1988)。
已成功地嘗試了增強(qiáng)對(duì)致病病毒，如煙草中的煙草花葉病毒組(Powel Abel等，1986)，馬鈴薯(Hoekema等，1989)和番木瓜(Fitch等，1993)中的馬鈴薯X病毒組的抗性。在上面例子中，導(dǎo)入的性狀以表達(dá)編碼包膜蛋白的單個(gè)基因?yàn)榛A(chǔ)。在木薯中，經(jīng)過(guò)包膜蛋白介導(dǎo)的抗性技術(shù)可控制非洲木薯花葉病毒(ACMV)和木薯普通花葉病毒(CCMV)(Fauquet等，1992)。已克隆了編碼生氰作用關(guān)鍵酶的基因(Hughes等，1994)，這使得使用反義方法以遺傳信息控制木薯生氰作用成為可能。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是控制木薯塊莖中的淀粉。
因此，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體，其中額外的遺傳信息包括一種反義構(gòu)建體，特別是能抑制直鏈淀粉合成途徑的反義構(gòu)建體。
原生質(zhì)體不能在野外生長(zhǎng)，也不能收獲。盡管原生質(zhì)體對(duì)于轉(zhuǎn)化是必需的，但必須能從所說(shuō)的原生質(zhì)體再生成胚和/或植株。這是本發(fā)明的一個(gè)非常重要的實(shí)施方案，因?yàn)橐驯砻髂臼黼y以從原生質(zhì)體再生。詳細(xì)描述部分解釋了如何完成這一方案。至于進(jìn)一步的信息，參考E.Sofiari寫(xiě)作的題為《木薯(Manihot esculenta Crantz)的再生和轉(zhuǎn)化》的論文，其復(fù)印件隨本申請(qǐng)一同提交，該論文尚未出版，本文引用作為參考。因此，本發(fā)明提供了以原生體再生植物的方法，其中誘導(dǎo)本發(fā)明的原生質(zhì)體產(chǎn)生胚，隨后誘導(dǎo)該胚產(chǎn)生植物。
以所說(shuō)的方法獲得的植物也是本發(fā)明的一個(gè)部分，特別是塊莖中基本上不含直鏈淀粉的植物。
詳細(xì)描述fec的發(fā)生獲得FEC的方法在

圖1中列出。它從初生胚的誘導(dǎo)開(kāi)始。初生胚以?xún)刹匠绦蛐纬伞Ｔ诘谝徊街?，在補(bǔ)充了鹽和維生素(優(yōu)選Murashige和Skoog(1962))，糖源(例如20g/l蔗糖)和生長(zhǎng)素(例如，1-8mg/l毒莠定或麥草畏或2,4-D)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)外植體用于發(fā)生胚。在該第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)10至15天后，形成兩極魚(yú)雷形胚。魚(yú)雷形胚具有清楚的下胚軸和子葉原基。將帶有魚(yú)雷形胚的外植體轉(zhuǎn)移到第二步培養(yǎng)基(與第一步的培養(yǎng)基相同但不含生長(zhǎng)素)中后，魚(yú)雷形胚生長(zhǎng)成熟。成熟的胚具有較大的綠色子葉。可使用合子胚(Stamp和Henshaw 1982；Konan等，1994)，幼葉外植體或頂端分生組織(Stamp和Henshow,1987a；Szabados等，1982；Mroginsky和Scocchi,1993；Ralmakers 1993a；Narayanaswamy等,1995)和葉組織(Mukherjee 1995)獲得初生胚。以這種方式評(píng)價(jià)許多不同基因型形成初生胚的能力。以這種方法僅在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后形成初生體細(xì)胞胚且在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后不形成。而且，如果使用生長(zhǎng)素毒莠定，麥草畏或2,4-D且不用IAA,IBA或NAA僅觀察到體細(xì)胞胚(初生)。
在目前使用的方法中，每個(gè)培養(yǎng)的外植體形成的許多成熟胚中有基因型變異。基因型M.Coll505,M.Col22和Gading每個(gè)培養(yǎng)的葉外植體產(chǎn)生最高數(shù)目的成熟胚(ME/CLE)。然而，形成的成熟胚數(shù)目較低。在M.Col22中，從體外生長(zhǎng)的植物分離的且在含4mg/l 2,4-D的步驟1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的葉外植體中最多有22％形成ME，且最大數(shù)值為0.8ME/CLE。在含8mg/l 2,4-D的步驟1培養(yǎng)基中，最多49％的葉外植體形成ME，且最大值為3.5ME/CLE。更高的2,4-D濃度不能進(jìn)一步提高外植體的胚發(fā)生能力。
在提高葉外植體產(chǎn)生初生體細(xì)胞胚能力的嘗試中，供體植物在不同條件下生長(zhǎng)。供體植物在不同光照方案(8,12,16或24小時(shí))下的體外生長(zhǎng)對(duì)胚發(fā)生反應(yīng)無(wú)影響。然而，光強(qiáng)度的減少具有正影響。用從在8μEm-2S-1下生長(zhǎng)的供體植物分離的且在步驟1培養(yǎng)基上培養(yǎng)的葉外植體獲得最佳結(jié)果。其他的研究者已顯示在某些基因型中，在誘導(dǎo)初生胚發(fā)生時(shí)，麥草畏(1-66mg/l)和毒莠定(1-12mg/l)優(yōu)于2,4D(Ng 1992；Sudarmonowati和Henshaw,1993；Taylor和Henshaw,1993)。Mathews等(1993)經(jīng)過(guò)在步驟1培養(yǎng)基中培養(yǎng)15天后將外植體轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充了0.5％活性炭的無(wú)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中提高了基因型M.Coll505的初生胚發(fā)生效率。在該培養(yǎng)基中促進(jìn)了成熟，結(jié)果成熟胚的數(shù)量從對(duì)照的0.4增加到3.4ME/CLE。
如果用諸如2,4-D或毒莠定或麥草畏的生長(zhǎng)素預(yù)處理供體植物可獲得最佳結(jié)果。為此，在生長(zhǎng)12天后，植物在補(bǔ)充了生長(zhǎng)素(終濃度為8mg/l)的液體MS20培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。2天后從供體植物分離葉外植體并在含有8mg/l 2,4-D，毒莠定或麥草畏的步驟1培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在克隆M.Col22中，這產(chǎn)生9.4ME/CLE的產(chǎn)率。它比用于處理的對(duì)照植物明顯要高，后者產(chǎn)生3.5ME/CLE(表3)。
對(duì)一些不同的基因型試驗(yàn)了生長(zhǎng)素預(yù)處理的一般適用性。供體植物未作預(yù)處理時(shí)，兩種基因型形成ME但頻率較低。預(yù)處理供體植物后，幾乎所有的基因型的葉外植體均形成ME。
最終我們從22種試驗(yàn)的基因型中的18種(表1，除了TMS30221,TMS30001,TMS30572和SaoPaolo)獲得了成熟的初生體細(xì)胞胚。
從合子胚和葉產(chǎn)生的初生體細(xì)胞胚用作產(chǎn)生次生胚的外植體(Stamp和Henshaw,1987b；Szabados等，1987；Mathews等，1993；Raemaker等，1993bc；Luong等，1995)。在補(bǔ)充了生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)體細(xì)胞胚產(chǎn)生體細(xì)胞胚發(fā)生的循環(huán)系統(tǒng)。為導(dǎo)致次生胚發(fā)生而傳代培養(yǎng)體細(xì)胞胚的方式似乎影響胚發(fā)生組織的形態(tài)。每月在含2,4D的固體培養(yǎng)基中于黑暗中再培養(yǎng)的體細(xì)胞胚團(tuán)發(fā)育成在舊胚頂端形成的指狀胚原始體。該胚不經(jīng)過(guò)魚(yú)雷形階段。如果將具有胚的細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到光照下的第2步培養(yǎng)基(Szabados 1987)中則出現(xiàn)進(jìn)一步發(fā)育。正常情況下，成熟體細(xì)胞胚在光照下的步驟1培養(yǎng)基中培養(yǎng)，20天后，將外植體轉(zhuǎn)移到步驟2的培養(yǎng)基中用于成熟。
在該系統(tǒng)中胚發(fā)育至成熟且具有大型綠色子葉的成熟胚用于起動(dòng)新的胚發(fā)生循環(huán)，而在其它系統(tǒng)中，魚(yú)雷形胚用于起動(dòng)次生體細(xì)胞胚發(fā)生的新循環(huán)。
在表1所述基因型的14個(gè)中試驗(yàn)了成熟胚繁殖的這一系統(tǒng)。盡管事實(shí)是大多數(shù)基因型中只獲得了幾個(gè)成熟的初生胚，但除了一個(gè)外，所有的基因型在補(bǔ)充了2,4-D的培養(yǎng)基上培養(yǎng)后比觀察的初生體細(xì)胞胚發(fā)生以更高的頻率產(chǎn)生新的成熟胚。經(jīng)過(guò)對(duì)成熟胚定期傳代培養(yǎng)1年以上可保持胚形成力(Szabados等，1987；Mathews等，1993；Raemakers,1993)。在液體和固體培養(yǎng)基中均形成新的體細(xì)胞胚。在所有基因型中，觀察到在液體培養(yǎng)基中比在固態(tài)培養(yǎng)基中形成更多的胚，且在開(kāi)始新一輪次生體細(xì)胞胚發(fā)生前將胚分成多部分比完整的胚增加了產(chǎn)量。例如，在M.Col22中，在固態(tài)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的完整胚每個(gè)培養(yǎng)胚產(chǎn)生8個(gè)胚，而在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的分成小部分的胚每個(gè)培養(yǎng)胚產(chǎn)生32個(gè)胚(Raemakers等，1993c)。不僅2,4-D，毒莠定和麥草畏，而且NAA均具有誘導(dǎo)次生胚發(fā)生的能力。IBA和IAA不能誘導(dǎo)次生胚發(fā)生。NAA已成功地用于Adira 1,Adira 4,Gading,Linell,M.Col22,M.Coll505,TMS90853和Gading。一般來(lái)說(shuō)，在補(bǔ)充了NAA的培養(yǎng)基中比在補(bǔ)充了2,4-D，毒莠定或麥草畏的培養(yǎng)基中產(chǎn)生更多的成熟胚。而且，用NAA誘導(dǎo)的胚的發(fā)育比用2,4-D，麥草畏或毒莠定誘導(dǎo)的更快?？s短培養(yǎng)期間具有有益的效果，特別是當(dāng)大規(guī)模操作時(shí)。
在組織學(xué)上，以2,4-D新誘導(dǎo)的次生胚垂直附著于外植體上，而以NAA新誘導(dǎo)的次生胚水平附著。
在獲得木薯的胚發(fā)生培養(yǎng)物時(shí)還存在一個(gè)問(wèn)題(Mroginski和Scocchi,1992；Taylor等，1992；Narayanaswamy等，1995；Sudarmonowati和Bachtiar,1995)。主要問(wèn)題不是從原代外植體獲得胚發(fā)生組織，而是以次生胚發(fā)生大規(guī)模繁殖該組織。為此目的，可使用由魚(yú)雷形胚組成的組織或成熟胚的任意一種。魚(yú)雷形胚的繁殖具有高度基因型依賴(lài)性，而成熟胚的繁殖極大地獨(dú)立于基因型(Raemakers,1993)。初生和次生體細(xì)胞胚發(fā)生的特征均在于形成具有兩極結(jié)構(gòu)的繁殖體。這些兩極魚(yú)雷形胚在補(bǔ)充了生長(zhǎng)素的步驟1培養(yǎng)基中已形成。因此，Taylor等，(1995)建議使用術(shù)語(yǔ)組織化的胚發(fā)生。組織化的細(xì)胞定義為一組活躍分裂的細(xì)胞，具有組織和器官，形成一個(gè)特征性統(tǒng)一的整體(Walker,1989)。
Taylor等(1995)開(kāi)發(fā)了組織化程度較低類(lèi)型的體細(xì)胞發(fā)生。用連續(xù)選擇，在補(bǔ)充有鹽和維生素及10mg/l毒莠定(GD2)的Gressoff和Doy(1972)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的組織化的胚發(fā)生組織逐漸轉(zhuǎn)變成組織化程度較低的組織。該組織由(前期)球形胚的愈傷組織樣團(tuán)塊組成。它具有極大的脆性。因此，這些組織稱(chēng)為脆性胚發(fā)生愈傷組織(FEC)。FEC中的細(xì)胞在一定階段是連續(xù)的，然后它們從組控制中分離出來(lái)，因?yàn)樗鼈儧](méi)有組織化形成統(tǒng)一的結(jié)構(gòu)。在由Gresshoff和Doy(1972)維生素和鹽，7g/l Daichin瓊脂，20g/l蔗糖和10mg/l毒莠定組成的培養(yǎng)基(固體GD2)上維持FEC。每隔3周將脆性胚在上述培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。為了進(jìn)行液態(tài)懸浮培養(yǎng)，將0.5g脆性胚轉(zhuǎn)移進(jìn)含有50ml補(bǔ)充了Schenk和Hildebrandt(1972)鹽和維生素，60g/l蔗糖和10mg/l毒莠定的液態(tài)培養(yǎng)基(液體SH6)的200ml瓶中。每隔2天更新一次培養(yǎng)基，14天后，將每瓶中的培養(yǎng)物分配進(jìn)5個(gè)新瓶中。高壓滅菌前將PH調(diào)成5.7。生長(zhǎng)室的溫度為30℃，光周期12小時(shí)且輻照度為40μmolm-2s-1。經(jīng)過(guò)在補(bǔ)充有6％(w/v)蔗糖和10mg/l毒莠定的Schenk和Hildebrandt(1972)培養(yǎng)基(SH6)中培養(yǎng)FEC產(chǎn)生懸浮培養(yǎng)物。每隔2-3天更換該培養(yǎng)基。
為了保持培養(yǎng)物的高度脆性狀態(tài)，必須每隔2月將FEC篩選一次。實(shí)踐中將通過(guò)具有1mm2網(wǎng)眼的篩子的FEC部分用于傳代培養(yǎng)。
FEC在GD2或SH6培養(yǎng)基中幾乎不形成魚(yú)雷形胚。如果FEC在成熟培養(yǎng)基上培養(yǎng)則形成魚(yú)雷形和隨后的成熟胚。成熟培養(yǎng)基由Murashige和Skoog(1962)鹽和維生素，0.1g/l肌醇，20g/l蔗糖，18.2g/l甘露醇，0.48g/l MES,0.1g/l酪蛋白水解產(chǎn)物，0.08g/l腺嘌呤硫酸鹽，0.5mg/l d-泛酸鈣，0.1mg/l氯化膽堿，0.5mg/l抗壞血酸，2mg/l尼克酸，1mg/l鹽酸吡哆醇，10mg/l硫胺素HCl,0.5mg/l葉酸，0.05mg/l生物素，0.5mg/l甘氨酸，0.1mg/l L-半胱氨酸，0.25mg/l核黃素和1mg/l毒莠定組成。該成熟培養(yǎng)基每3周更新一次。
經(jīng)過(guò)在補(bǔ)充了2,4-D，毒莠定，麥草畏或NAA的MS20培養(yǎng)基上培養(yǎng)可將成熟胚誘導(dǎo)成次生體細(xì)胞胚發(fā)生。在范圍較寬的基因型(見(jiàn)表1)中相當(dāng)容易建立初生和次生體細(xì)胞胚形成，而FEC現(xiàn)仍局限于少數(shù)基因型。FEC用于體細(xì)胞胚發(fā)生和遺傳轉(zhuǎn)化的新系統(tǒng)的前景是有希望的，盡管還需要進(jìn)一步的研究使該系統(tǒng)適用于更多的基因型。為該方法所必需的是提供高質(zhì)量組織化的組織和該組織轉(zhuǎn)變成FEC的能力。Taylor等(1995)使用“組織化的組織”，它在魚(yú)雷形期繁殖以起動(dòng)FEC。在這種情況下，2個(gè)步驟(起動(dòng)組織化的組織和轉(zhuǎn)變成未組織化的組織)對(duì)于成功起動(dòng)FEC是決定性的。兩個(gè)步驟是基因型依賴(lài)性的。如果組織化的組織在Raemakers(1993)所述的成熟期中繁殖，那么只有該組織轉(zhuǎn)變成FEC的能力是起動(dòng)FEC的決定性步驟。需要研究的是組織化的組織是否可用作起始材料。如果組織化的組織不能使用，那么該組織應(yīng)在其可用于起動(dòng)FEC前首先在未成熟期繁殖。經(jīng)過(guò)以高密度培養(yǎng)外植體或經(jīng)過(guò)減少循環(huán)時(shí)間容易實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。
從原生質(zhì)體再生植物原生質(zhì)體的分離為了分離原生質(zhì)體，可使用在固態(tài)GD2或液體SH6中培養(yǎng)的FEC。然而，從在液態(tài)SH6中培養(yǎng)了1至3周的FEC獲得最高產(chǎn)量的原生質(zhì)體。
將2克FEC放入含10ml細(xì)胞壁消化溶液的培養(yǎng)皿(φ9cm)中。細(xì)胞壁消化溶液由細(xì)胞壁降解酶的混合物10mg/l溶果膠酶，10g/l纖維素酶，200mg/l離析酶；生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(NAA 1mg/l,2,4-D 1mg/l，玉米素1mg/l)；主要鹽(368mg/l CaCl2；34mg/l KH2PO4；740mg/lKNO3；493mg/l MgSO4.7H2O)和滲壓劑(91g/l D-甘露糖)和0.5g/lMES組成。細(xì)胞壁降解酶纖維素酶(1-10g/l)加離析酶(200mg/l)成功地用于原生質(zhì)體分離。額外添加溶果膠酶(0.001-0.01g/l)和/或Driselase(0.02g/l)增加了原生質(zhì)體的產(chǎn)率。培養(yǎng)18小時(shí)后，向溶液中加入10ml洗滌培養(yǎng)基。摩爾滲透壓濃度為0.530m Osm/kg的洗滌培養(yǎng)基由主要鹽(見(jiàn)細(xì)胞壁消化溶液)，45.5g/l甘露醇和7.3g/l NaCl組成。消化組織通過(guò)73μM孔經(jīng)濾器(PA55134 Nybolt-Switzerland)過(guò)濾進(jìn)250ml燒杯中。過(guò)濾物平均分配進(jìn)2個(gè)12ml的圓錐形螺蓋管中，并在600rpm下離心3分鐘(Mistral 2000)。去掉上清后重復(fù)一次洗滌程序。經(jīng)過(guò)漂浮在9.5ml含主要和微量鹽(見(jiàn)細(xì)胞壁消化溶液)及105g/l蔗糖的溶液中重懸原生質(zhì)體溶液。PH為5.8，摩爾滲透壓濃度為0.650mOsm。在頂部輕輕加入0.5ml洗滌培養(yǎng)基前使含原生質(zhì)體的溶液平衡5分鐘。在700rpm下離心15分鐘(Mistral 2000)后，原生質(zhì)體濃縮在蔗糖和洗滌培養(yǎng)基之間的帶中。用吸管收獲原生質(zhì)體層且在標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器室中計(jì)數(shù)產(chǎn)量。
原生質(zhì)體培養(yǎng)在用瓊脂糖0.2％w/v固化的培養(yǎng)基(Dons en Bouwer,1986)中在含10ml相同液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)原生質(zhì)體。下列培養(yǎng)基導(dǎo)致形成小愈傷組織
-僅補(bǔ)充了生長(zhǎng)素(0.1-10mg/l NAA或0.1-10mg/l毒莠定，或0.1-10mg/l IAA，或0.1-10mg/l 2,4-D，或0.1-10mg/l麥草畏，或0.1-10mg/l，或0.1-10mg/l)或補(bǔ)充了生長(zhǎng)素加細(xì)胞分裂素(0.01-1mg/l玉米素，0.01-1mg/l 2-ip,0.01-1mg/l BA,0.01-1mg/l TDZ,0.01-1mg/l細(xì)胞分裂素)的TM2G培養(yǎng)基(Wolters等，1991)。
-僅補(bǔ)充了生長(zhǎng)素(0.1-10mg/l NAA或0.1-10mg/l毒莠定，或0.1-10mg/l IAA，或0.1-10mg/l 2,4-D)，或補(bǔ)充了0.1-10mg/l麥草畏加細(xì)胞分裂素(0.01-10mg/l玉米素，0.01-10mg/l 2-ip,0.01-1mg/lBA,0.01-1mg/l TDZ,0.01-1mg/l細(xì)胞分裂素)的培養(yǎng)基A(Murashige和Skoog(1962)鹽和維生素，4.5g/l肌醇，4.55g/l甘露醇，3.8g/l木糖醇，4.55g/l山梨糖醇，0.098g/lMES,40mg/l硫酸腺嘌呤和150mg/l酪蛋白水解產(chǎn)物，0.5mg/l d-泛酸鈣，0.1mg/l氯化膽堿，0.5mg/l抗壞血酸，2.5mg/l尼克酸，1mg/鹽酸吡哆醇，10mg/l硫胺素鹽酸，0.5mg/l葉酸，0.05mg/l生物素，0.5mg/l甘氨酸，0.1mg/l L-半胱氨酸和0.25mg/l核黃素及59.40g/l葡萄糖。
經(jīng)過(guò)用新鮮培養(yǎng)基更換9ml培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)每隔10天更新一次培養(yǎng)基。在第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)2個(gè)月后，選擇高質(zhì)量的FEC并培養(yǎng)以便進(jìn)一步增生或使其成熟。為了增生，將FEC轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充了40g/l蔗糖，7g/l Daichin瓊脂和2mg/l毒莠定的Gresshoff和Doy(1974)培養(yǎng)基(GD4)中。3周后，將FEC轉(zhuǎn)移進(jìn)補(bǔ)充了20g/l蔗糖，7g/l瓊脂和10mg/l毒莠定的Gresshoff和Doy培養(yǎng)基(GD2)中。經(jīng)過(guò)將1.0g FEC轉(zhuǎn)移進(jìn)補(bǔ)充了10mg/l毒莠定的液體SH6％培養(yǎng)基中起動(dòng)懸浮培養(yǎng)物。2周后，將懸浮液分配到具有1.0ml原始細(xì)胞疊集體積的新瓶中。
培養(yǎng)2個(gè)月后，在補(bǔ)充了0.5mg/l NAA和1mg/l玉米素的TM2G中以105/ml的密度培養(yǎng)的104個(gè)原生質(zhì)體產(chǎn)生了1058個(gè)小愈傷組織而以106/ml的密度培養(yǎng)的104個(gè)原生質(zhì)體僅產(chǎn)生了64個(gè)小愈傷組織。
以培養(yǎng)基A代替TM2G培養(yǎng)基明顯降低了小愈傷組織的密度和數(shù)目。此階段至少可分辨3種類(lèi)型的愈傷組織。一種類(lèi)型由球形胚組成，在以106密度培養(yǎng)的原生質(zhì)體中觀察到的最多。其中的一些發(fā)育成亮綠色的子葉狀結(jié)構(gòu)。然而，這些胚不能正常發(fā)芽。另一類(lèi)型是快速生長(zhǎng)胚且由大型致密愈傷組織組成，它們?cè)趦煞N密度的原生質(zhì)體培養(yǎng)物中都能觀察到。這種愈傷組織不會(huì)發(fā)育成胚。第3種類(lèi)型是高脆性愈傷組織，它在兩種密度中都觀察到。在2-5×105的密度下(培養(yǎng)基TM2G)，大約60％的愈傷組織是脆性的且具有胚形成能力。將FEC進(jìn)行傳代培養(yǎng)用于進(jìn)一步繁殖或使其成熟。
原生質(zhì)體產(chǎn)生的FEC的增生選擇FEC后，將其0.1g在GD4加2mg/l毒莠定中培養(yǎng)3周使其增加到0.7g組織。超過(guò)95％的組織由高質(zhì)量FEC組成。隨后，經(jīng)過(guò)在補(bǔ)充了10mg/l毒莠定的GD2培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)3周維持該組織。為了起動(dòng)懸浮培養(yǎng)，將FEC轉(zhuǎn)移進(jìn)液體培養(yǎng)基中。該材料細(xì)胞疊集體積(PCV)的增加略高于原始材料(數(shù)據(jù)未顯示)。
原生質(zhì)體產(chǎn)生的FEC的成熟在嘗試誘導(dǎo)胚成熟時(shí)，將在GM2G中培養(yǎng)2個(gè)月后分離的FEC在成熟培養(yǎng)基上培養(yǎng)。成熟培養(yǎng)基由Murashige和Skoog(1962)鹽和維生素，0.1g/l肌醇，20g/l蔗糖，18.2g/l甘露醇，0.48g/l MES,0.1g/l酪蛋白水解產(chǎn)物，0.08g/l腺嘌呤硫酸，0.5mg/l d-泛酸鈣，0.1mg/l氯化膽堿，0.5mg/l抗壞血酸，2mg/l尼克酸，1mg/l鹽酸吡哆醇，10mg/l硫胺素鹽酸，0.5mg/l葉酸，0.05mg/l生物素，0.5mg/l甘氨酸，0.1mg/lL-半胱氨酸；0.25mg/l核黃素和1mg/l毒莠定組成。該成熟培養(yǎng)基每隔3周更新一次。
在該培養(yǎng)基中逐漸從增生轉(zhuǎn)變成成熟。結(jié)果在液體成熟培養(yǎng)中培養(yǎng)2周后用因子4增加細(xì)胞疊集體積。轉(zhuǎn)移到固態(tài)成熟培養(yǎng)基中后還有增生。在固態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周后，大部分胚胎達(dá)到球形，且只有少數(shù)一些球形胚進(jìn)一步發(fā)育。在固態(tài)成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)1個(gè)月后，可見(jiàn)第一魚(yú)雷形胚。成熟和魚(yú)雷形胚的數(shù)目與涂布效率不相關(guān)但與起始培養(yǎng)的原生質(zhì)體密度相關(guān)。如果原生質(zhì)體在無(wú)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的TM2G上培養(yǎng)則不能獲得這種胚。從在補(bǔ)充了0.5mg/l NAA和1mg/l玉米素的TM2G上培養(yǎng)的原生質(zhì)體形成的成熟和魚(yú)雷形胚的數(shù)目最高。如果用毒莠定代替NAA，那么魚(yú)雷形和成熟胚的數(shù)目明顯更低(表2)。對(duì)于試驗(yàn)的毒莠定，2mg/l的濃度產(chǎn)生最佳結(jié)果。培養(yǎng)3個(gè)月后，每滴瓊脂糖分離出60至200個(gè)魚(yú)雷形成熟胚。魚(yú)雷形胚如果在新鮮的成熟培養(yǎng)基或在MS2加0.1mg/l BAP上培養(yǎng)則以高頻率變成熟。
次生體細(xì)胞胚形成和原生質(zhì)體產(chǎn)生的成熟胚的萌發(fā)如果在補(bǔ)充了10mg/l NAA或8mg/l 2,4-D的液態(tài)或固態(tài)MS2培養(yǎng)基上培養(yǎng)則只有少數(shù)魚(yú)雷形胚形成次生胚(數(shù)據(jù)未顯示)。對(duì)于次生胚發(fā)生，成熟胚是較好的外植體。在液態(tài)和固態(tài)培養(yǎng)基中，對(duì)于誘導(dǎo)次生胚發(fā)生，2,4-D優(yōu)于NAA。如果成熟胚首先在2,4-D中培養(yǎng)，然后在液態(tài)NAA中培養(yǎng)則反應(yīng)相當(dāng)于在單獨(dú)的2,4-D中培養(yǎng)。首先在含2,4-D的培養(yǎng)基中進(jìn)行了一輪次生體細(xì)胞胚發(fā)生的胚在補(bǔ)充了10mg/l NAA的MS20中產(chǎn)生高效的次生胚。
比較了生長(zhǎng)素2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)或萘乙酸(NAA)在液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)循環(huán)或次生體細(xì)胞胚的萌發(fā)。然而，為了獲得高萌發(fā)率，干燥胚需要補(bǔ)充諸如芐氨基嘌呤(BAP)的細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基。產(chǎn)生的籽苗形態(tài)學(xué)依賴(lài)于BAP的濃度，用1mg/l BAP形成具有粗而短的直根和具有短節(jié)間的分枝枝條的植物。用0.1mg/l BAP時(shí)，直根細(xì)而長(zhǎng)且枝條僅具有1個(gè)或2個(gè)頂端分生組織。如果胚的干燥達(dá)到最適度以下，比胚干燥達(dá)最適度時(shí)需要更高濃度的BAP以刺激萌發(fā)。在黑暗中培養(yǎng)的干燥胚也需要低濃度的BAP，而且，這些胚比在光照下培養(yǎng)的胚萌發(fā)更快。開(kāi)始體細(xì)胞胚誘導(dǎo)4周后獲得完整的植物。2,4-D誘導(dǎo)的胚顯示出不同的反應(yīng)。僅在一種基因型中，干燥增強(qiáng)2,4-D誘導(dǎo)的胚萌發(fā)，而在3種其它基因型中不增強(qiáng)。在所有基因型中，干燥刺激根形成。在黑暗中培養(yǎng)的胚主要形成不定根，而在光照下培養(yǎng)的胚主要形成直根。
4.0基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)在過(guò)去幾年中，已形成了一些對(duì)植物原生質(zhì)體的DNA轉(zhuǎn)移技術(shù)，如硅纖維(Kaeppler等，1990)，顯微注射(Deleat和Bleas,1987)和電泳(Griesbach和Hammond,1993)。最常用且有效適用的技術(shù)是土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，微粒/粒子轟擊和原生質(zhì)體電穿孔。
根癌土壤桿菌DNA傳遞系統(tǒng)是最常用的技術(shù)。它可能涉及以該方法在植物中進(jìn)行DNA傳遞的第一個(gè)發(fā)明。起初它局限于伽藍(lán)菜屬和茄科，特別是煙草?，F(xiàn)今，土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的使用有了顯著的變化，它可轉(zhuǎn)化除在單子葉植物中受限制外的大范圍的植物(Wordragen和Dons,1992的綜述)。盡管木薯是土壤桿菌屬的宿主，但已證實(shí)對(duì)其并非極易操作。
原則上原生質(zhì)體是DNA傳遞最理想的外植體。它們可以單細(xì)胞的形式培養(yǎng)以產(chǎn)生多細(xì)胞集落，然后發(fā)育成植物。從原生質(zhì)體產(chǎn)生的植物在起源上一般是純系的，這給任意轉(zhuǎn)化系統(tǒng)提供了有用的工具，因?yàn)樗宿D(zhuǎn)基因植物中的嵌合狀態(tài)。然而，使用原生質(zhì)體受具有高度物種依賴(lài)性的再生系統(tǒng)的牽制。為進(jìn)行轉(zhuǎn)化，可聯(lián)合使用原生質(zhì)體與PEG以改變質(zhì)膜，它引起可逆性通透，使DNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，正如在例如Lolium multiform(Potryk以等，1985)和Triticummonococcum(Lorz等，1985)中所證實(shí)的。增加質(zhì)膜甚至細(xì)胞壁對(duì)DNA的通透性的另一技術(shù)是用電穿孔(見(jiàn)Jones等，1987的綜述)，在該方法中電脈沖使DNA能進(jìn)入細(xì)胞。水稻是從原生質(zhì)體電穿孔產(chǎn)生可育轉(zhuǎn)基因植物的第一種莊稼(Shimamoto等，1989)。
使用粒子轟擊或biolistics傳遞外源DNA提供了在木薯轉(zhuǎn)化中的一個(gè)可供選擇的方法。使用該方法獲得的第一種轉(zhuǎn)基因植物是煙草(Klein等，1989)。在這一成功的轉(zhuǎn)化方法后，粒子轟擊廣泛用于對(duì)土壤桿菌感染不易操作的植物中，特別是單子葉植物。加速粒子(微粒)的一些DNA傳遞裝置的改進(jìn)產(chǎn)生了最近的型號(hào)BiolisticTM PDS-1000(Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室，Richmond,Ca)。這些裝置可以商業(yè)上買(mǎi)到，然而，目前的價(jià)格相當(dāng)高。用DNA包裹的鎢或金顆粒通常用作將DNA傳遞給靶組織的微粒(見(jiàn)Songstad等，1995的最近綜述)。
5．選擇和報(bào)道基因用于遺傳修飾為了能鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，將感興趣的基因與選擇標(biāo)記基因偶聯(lián)。該標(biāo)記基因?qū)τ谶x擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞是必需的。選擇可根據(jù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞/組織的視覺(jué)特征來(lái)進(jìn)行。一個(gè)例子是從螢火蟲(chóng)分離的螢光素酶基因。表達(dá)該基因且提供了底物(螢光素)的植物細(xì)胞會(huì)發(fā)光，可用特殊儀器檢測(cè)(Ow等，1986)。選擇轉(zhuǎn)化的組織的另一種方法是導(dǎo)入編碼對(duì)抗生素或除草劑有抗性的基因(Thompson等，1987；Gordon-Kamm等，1990)。
許多抗生素和除草劑已用作植物轉(zhuǎn)化的選擇劑。在禾谷類(lèi)中，選擇對(duì)除草劑膦絲菌素(PPT)的抗性來(lái)選擇轉(zhuǎn)基因植物(Cao等，1990)。在番木瓜(Fitch等，1994)，葡萄(Nakano等，1994；Scorza等，1995)，玉米(Rhodes等，1998)和水稻(Chen等，1987)中，賦予對(duì)卡那霉素和有關(guān)抗生素抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTⅡ)基因用作選擇標(biāo)記。
在木薯中，可使用所有上述的選擇系統(tǒng)，然而以PPT為基礎(chǔ)的選擇具有優(yōu)勢(shì)，它增強(qiáng)了FEC形成成熟胚的能力且以這種方式增強(qiáng)了植物的再生。
對(duì)圖1的說(shuō)明圖1在木薯中體細(xì)胞胚發(fā)生的示意圖，包括初生，次生體細(xì)胞胚發(fā)生，脆性胚發(fā)生愈傷組織的選擇，成熟和干燥，接著是萌發(fā)。
gd2=補(bǔ)充了Gresshoff和Doy鹽(1974)和維生素加20g/l蔗糖的培養(yǎng)基。
gd4=補(bǔ)充了Gresshoff和Doy鹽(1974)和維生素加40g/l蔗糖的培養(yǎng)基。
ms2=補(bǔ)充了Murashige和Skoog鹽和維生素加20g/l蔗糖的培養(yǎng)基。
pic=10mg/l毒莠定，NAA=10mg/l萘乙酸，2。4-D=8mg/l 2,4-二氯苯氧乙酸，sh6=補(bǔ)充了Shenk和Hildebrandt(1972)鹽和維生素加60g/l蔗糖的培養(yǎng)基。
表1用于體細(xì)胞胚發(fā)生的木薯基因型Indonesia Nigeria TMS90853 M.Col22,Adira1TMS50395TMS30555 ZimbabweTjurugTMS60444TMS30211 Line11Adira4TMS90059TMS30395 VenuzuelaMangi4TMS30572TMS30001 M.Ven77GadingTMS4(2)1244 Columbia BrasilFarokaTMS60506M.Col1505 Sao Paolo表2供體植物體外生長(zhǎng)期間光強(qiáng)度對(duì)相應(yīng)于成熟胚形成的葉外植體數(shù)和每個(gè)培養(yǎng)的葉外植體成熟胚數(shù)(#ME/CLE)的影響光強(qiáng)度 外植體數(shù)相應(yīng)的外植體a產(chǎn)量(μEm-2s-1) (#ME/CLEb)40 48 18b 1.7b28 48 26ab 4.9ab848 31a 6.6aa,b具有相同字母的平均值分別用卡方檢驗(yàn)(p＜0.1)和用LSD檢驗(yàn)(p＜0.1)無(wú)顯著的差異。
表3 2,4-D預(yù)處理對(duì)11種尼日利亞木薯基因型和M.Col22中初生成熟胚的產(chǎn)量(每個(gè)從體外植物分離的培養(yǎng)的葉外植體的成熟胚數(shù))及隨后由次生體細(xì)胞胚發(fā)生的成熟胚繁殖的影響胚發(fā)生 初生a)次生b)2,4-D預(yù)處理無(wú) 有M.Col223.59.413.5TMS 30555 0 0.76.2TMS 50395 0 ＜0.1 5.3TMS 60506 0 ＜0.1 0TMS 90059 0 ＜0.1 7.2TMS 30211 0 0 -TMS 60444 0 1.19.9TMS 30395 0 0.16.7TMS 90853 ＜0.1 0.28.2TMS 4(2)1244 ＜0.1 0 5.4TMS 30001 0 0 -TMS 30572 0 0 -a)三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值(總共48-74個(gè)葉外植體)，b)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值(總共24-48個(gè)ME外植體)。
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權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)木薯或近親物種的原生質(zhì)體的方法，該原生質(zhì)體能再生成植株，該方法包括從木薯或近親物種的外植體產(chǎn)生脆性胚發(fā)生愈傷組織并從所說(shuō)的脆性胚發(fā)生愈傷組織分離原生質(zhì)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)脆性胚發(fā)生愈傷組織。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中使用諸如纖維素酶，果膠溶酶和/或離析酶的細(xì)胞壁降解酶混合物產(chǎn)生原生質(zhì)體。
4.根據(jù)上述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的方法，其中獲得外植體的植物用生長(zhǎng)素預(yù)處理。
5.根據(jù)上述權(quán)利要求任意一項(xiàng)的方法，其中脆性胚發(fā)生愈傷組織從魚(yú)雷形初生或成熟胚產(chǎn)生。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中胚在初生外植體上誘導(dǎo)。
7.由根據(jù)上述權(quán)利要求的任意一項(xiàng)的方法獲得的原生質(zhì)體。
8.一種轉(zhuǎn)化木薯或近親物種原生質(zhì)體以給所說(shuō)的原生質(zhì)體提供額外的遺傳信息的方法，其是通過(guò)用包含所說(shuō)的額外遺傳信息的細(xì)菌如根癌土壤桿菌感染，經(jīng)過(guò)電穿孔或化學(xué)穿孔提供包含所說(shuō)的額外遺傳信息的載體或經(jīng)過(guò)用額外的遺傳信息包裹的粒子進(jìn)行粒子轟擊而進(jìn)行，其中根據(jù)權(quán)利要求7的原生質(zhì)體被轉(zhuǎn)化。
9.以權(quán)利要求8的方法獲得的轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體，其中額外的遺傳信息包括感興趣的基因。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體，其中額外的遺傳信息包括反義構(gòu)建體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體，其中反義構(gòu)建體能抑制直鏈淀粉合成途徑。
13.從原生質(zhì)體再生植物的方法，其中誘導(dǎo)根據(jù)權(quán)利要求7或9-12的任意一項(xiàng)的原生質(zhì)體產(chǎn)生胚，隨后誘導(dǎo)該胚產(chǎn)生植物。
14.從權(quán)利要求13的方法獲得的木薯植物或其近親物種。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的植物，其得自權(quán)利要求12的原生質(zhì)體并且其塊莖基本上不含直鏈淀粉。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了生產(chǎn)木薯或近親物種的原生質(zhì)體的方法,其中該原生質(zhì)體能再生成植物。該方法包括從木薯或近親物種的外植體生產(chǎn)脆性胚發(fā)生愈傷組織并從所說(shuō)的脆性胚發(fā)生愈傷組織分離原生質(zhì)體。還公開(kāi)了轉(zhuǎn)化木薯或近親物種的該原生質(zhì)體的方法和由此獲得的轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體。公開(kāi)了從這些原生質(zhì)體再生植物的方法,和由此獲得的木薯植物或近親物種。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1219202SQ97194813
公開(kāi)日1999年6月9日 申請(qǐng)日期1997年5月20日 優(yōu)先權(quán)日1996年5月20日
發(fā)明者理查德·赫拉爾杜斯·弗朗西斯庫(kù)斯·菲瑟, 克里斯蒂安·約瑟夫·約翰內(nèi)斯·拉馬克斯, 埃弗特·雅各布松, 約翰娜·伊麗莎白·瑪麗亞·貝格沃特－范迪倫 申請(qǐng)人:馬鈴薯及衍生產(chǎn)品合作銷(xiāo)售生產(chǎn)阿韋貝公司