轉(zhuǎn)化水稻的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)化水稻的方法，包括：采用所述誘導(dǎo)水稻愈傷組織的方法或所述大量擴(kuò)增水稻愈傷組織的方法獲得的愈傷組織；農(nóng)桿菌侵染所述愈傷組織。本發(fā)明轉(zhuǎn)化水稻的方法能夠使一些不易于遺傳轉(zhuǎn)化的秈稻品種獲得胚性愈傷，并采用固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)初生愈傷后再通過液體培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，可大量擴(kuò)增出質(zhì)量好、生長快的水稻胚性愈傷以提供農(nóng)桿菌進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化頻率可達(dá)10%以上，顯著降低了對秈稻外植體供應(yīng)的壓力，大大減小了秈稻組織培養(yǎng)的時間和人力消耗。
【專利說明】轉(zhuǎn)化水稻的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物轉(zhuǎn)化的方法，特別是涉及一種轉(zhuǎn)化水稻組織的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻(Oryza sativa)是世界主要的糧食作物之一，也是我國的第一大糧食作物。然而，伴隨著人口增加和社會發(fā)展，可耕作的土地面積卻越來越小，并且水稻產(chǎn)量的年增長率已下降至不足1%，作物品種的產(chǎn)量已經(jīng)快達(dá)到了生產(chǎn)極限，依靠傳統(tǒng)的育種技術(shù)已經(jīng)很難有較大的突破，作物基因工程技術(shù)的進(jìn)步是選育高產(chǎn)作物品種的希望所在。
[0003]水稻的遺傳轉(zhuǎn)化方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍轟擊法、電擊法、PEG法和花粉管通道法等，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法為目前水稻常用的轉(zhuǎn)基因方法。近年來粳稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)?shù)某墒旌头€(wěn)定，而秈稻作為我國稻區(qū)的主栽品種(特別是長江中下游和南方稻區(qū))，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化過程中存在難以逾越的技術(shù)瓶頸:
[0004](I)基因型依賴性強:一些大面積推廣應(yīng)用的優(yōu)良品種和一些超級雜交稻的親本材料都不能進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。
[0005](2)受體材料有限:在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的秈稻遺傳轉(zhuǎn)化過程中，農(nóng)桿菌侵染所依賴的受體材料-愈傷，都是經(jīng)過固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)出來的初生愈傷，然后再通過固體培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)所獲得的；這一傳統(tǒng)的方法固然能得到適于轉(zhuǎn)化的胚性愈傷，但是獲得的胚性愈傷數(shù)量有限。
[0006](3)外植體需求量大:如果為研究基因組學(xué)而導(dǎo)入大量的外源基因或是對一些優(yōu)良品種進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，需要大量供應(yīng)水稻外植體以便大規(guī)模起始的水稻愈傷誘導(dǎo)和繼代工作。
[0007](4)轉(zhuǎn)化頻率低:農(nóng)桿菌介導(dǎo)的秈稻遺傳轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化效率很大程度上取決于胚性愈傷的感受狀態(tài)；常規(guī)的秈稻遺傳轉(zhuǎn)化方法由于轉(zhuǎn)化頻率低，需要大量的外植體和人力才能獲得足夠數(shù)量的可供轉(zhuǎn)化的愈傷，并且轉(zhuǎn)化過程也需要花費大量的時間。
[0008](5)轉(zhuǎn)化周期長、精細(xì)度高:農(nóng)桿菌介導(dǎo)的秈稻遺傳轉(zhuǎn)化過程需要大量的手工操作，這就大大增加了培養(yǎng)基污染的概率；同時對實驗員操作的精細(xì)度、操作時間和強度要求較高，而操作時間跨度越長對整個研發(fā)周期會產(chǎn)生不良的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)化水稻的方法，有效克服現(xiàn)有技術(shù)基因型依賴性強、受體材料有限、外植體需求量大、轉(zhuǎn)化效率低和轉(zhuǎn)化周期長、精細(xì)度高等技術(shù)缺陷。
[0010]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)水稻愈傷組織的方法，包括:
[0011]將水稻種子接種于固體的誘導(dǎo)培養(yǎng)基以誘導(dǎo)初生愈傷；
[0012]將所述初生愈傷通過液體的懸浮培養(yǎng)以獲得愈傷組織。
[0013]為實現(xiàn)上述目的， 本發(fā)明還提供了一種大量擴(kuò)增水稻愈傷組織的方法，包括:
[0014]將水稻種子接種于固體的誘導(dǎo)培養(yǎng)基以誘導(dǎo)初生愈傷；[0015]將所述初生愈傷接種于液體的懸浮培養(yǎng)基以獲得胚性愈傷；
[0016]所述胚性愈傷通過懸浮培養(yǎng)繼代以獲得愈傷組織。
[0017]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種節(jié)省水稻外植體的方法，包括:
[0018]將水稻種子接種于固體的誘導(dǎo)培養(yǎng)基以誘導(dǎo)初生愈傷；
[0019]將所述初生愈傷接種于液體的懸浮培養(yǎng)基以獲得胚性愈傷；
[0020]所述胚性愈傷通過懸浮培養(yǎng)繼代以獲得愈傷組織。
[0021]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)化水稻的方法，包括:
[0022]采用所述誘導(dǎo)水 稻愈傷組織的方法或所述大量擴(kuò)增水稻愈傷組織的方法獲得的愈傷組織；
[0023]農(nóng)桿菌侵染所述愈傷組織。
[0024]進(jìn)一步地，所述侵染步驟之前的步驟為將所述愈傷組織進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。
[0025]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的水稻植物的方法，包括:
[0026]采用所述誘導(dǎo)水稻愈傷組織的方法或所述大量擴(kuò)增水稻愈傷組織的方法獲得的愈傷組織；
[0027]農(nóng)桿菌侵染所述愈傷組織；
[0028]侵染后的愈傷組織與所述農(nóng)桿菌共培養(yǎng)；
[0029]在含有選擇劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇轉(zhuǎn)化的抗性愈傷組織；
[0030]轉(zhuǎn)化的抗性愈傷組織再生為水稻植物。
[0031]進(jìn)一步地，所述侵染步驟之前的步驟為將所述愈傷組織進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。
[0032]更進(jìn)一步地，所述共培養(yǎng)步驟之前的步驟為將侵染后的愈傷組織進(jìn)行干燥處理。所述選擇步驟之前的步驟為將共培養(yǎng)后的愈傷組織進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。
[0033]優(yōu)選地，所述選擇劑是潮霉素、甘露糖或草丁膦。
[0034]本發(fā)明中的克隆基因、表達(dá)盒、載體(例如質(zhì)粒)、蛋白和蛋白片段、以及轉(zhuǎn)化的細(xì)胞核植物均可使用標(biāo)準(zhǔn)方法生產(chǎn)。
[0035]本發(fā)明可用于在水稻植物中表達(dá)任何目的基因。目的基因可以是耐除草劑基因、抗病基因或抗蟲基因，或者是選擇或評價標(biāo)記，并含有植物可操作的啟動子、編碼區(qū)和終止子區(qū)。耐除草劑基因包括對咪唑啉酮或磺酰脲除草劑耐受的AHAS基因、對草丁膦除草劑耐受的PAT或bar基因、對草甘膦除草劑耐受的EPSPS基因等?？共』虬股睾铣擅富颍缦踹量┚睾铣擅富?，植物來源的抗性基因等。抗蟲基因包括蘇云金芽孢桿菌殺蟲基因。目的基因也可以編碼與生物化學(xué)途徑有關(guān)的酶，該酶的表達(dá)可改變食物、飼料、營養(yǎng)藥和/或藥物生產(chǎn)中重要的性狀。目的基因可以位于質(zhì)粒上。適合本發(fā)明使用的質(zhì)粒可以含有一個以上目的基因和/或農(nóng)桿菌可含有帶有不同目的基因的不同質(zhì)粒。
[0036]本發(fā)明中所述“水稻”是指Oryza sativa，所述方法是以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的目的基因傳輸?shù)剿炯?xì)胞，之后再生為轉(zhuǎn)化的水稻植物為基礎(chǔ)的。本發(fā)明的方法獨立于栽培品種。
[0037]在選擇劑存在的情況下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的水稻細(xì)胞。優(yōu)選地，用潮霉素磷酸異構(gòu)酶(HPT)基因轉(zhuǎn)化，并且轉(zhuǎn)化的基因在潮霉素存在的情況下培養(yǎng)。在含有潮霉素為選擇劑的培養(yǎng)基中，HPT基因轉(zhuǎn)化的水稻細(xì)胞選擇性生長。
[0038]含有異源核酸(即含有按照本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織)的轉(zhuǎn)基因植物以及通過該轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子和后代是本發(fā)明所涉及的。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)成有用栽培品種的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。植物組織體外培養(yǎng)技術(shù)和整個植株再生技術(shù)也是公知的。相應(yīng)的，所述“種子”包括這些轉(zhuǎn)化植物的種子以及轉(zhuǎn)化植物后代產(chǎn)生的種子。所述“植物”不僅包括轉(zhuǎn)化和再生的植物，還包括通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化和再生植物的后代。
[0039]可以從本發(fā)明的方法產(chǎn)生的植物中篩選成功的轉(zhuǎn)化植物。為了開發(fā)改良的植物和種子品系，可以持續(xù)地篩選和選擇本發(fā)明再生植物的種子和子代植物以使轉(zhuǎn)基因和整合的核酸序列持續(xù)存在。因此，可以將所需要的轉(zhuǎn)基因核酸序列移入(即漸滲或交配)其它的遺傳品系如某些原種或商業(yè)上有用的品系或品種中。漸滲目的基因進(jìn)入遺傳植物品系的方法可通過本領(lǐng)域公知的多種技術(shù)來實現(xiàn)，包括通過傳統(tǒng)的育種、原生質(zhì)體融合、細(xì)胞核轉(zhuǎn)移以及染色體轉(zhuǎn)移。 育種方法和技術(shù)也是本領(lǐng)域公知的。根據(jù)本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因植物和自交系可用于生產(chǎn)商業(yè)上有價值的雜交植物和農(nóng)作物。
[0040]本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)化水稻的方法，具有以下優(yōu)點:
[0041]1、減小基因型的依賴性。本發(fā)明轉(zhuǎn)化水稻的方法能夠使一些不易于遺傳轉(zhuǎn)化的秈稻品種獲得胚性愈傷。
[0042]2、提供大量愈傷組織。本發(fā)明轉(zhuǎn)化水稻的方法采用固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)初生愈傷后再通過液體培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)， 能夠大量擴(kuò)增出質(zhì)量好、生長快的水稻胚性愈傷以提供農(nóng)桿菌進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)化。
[0043]3、降低外植體供應(yīng)壓力。由于本發(fā)明轉(zhuǎn)化水稻的方法可以提供大量優(yōu)良的水稻胚性愈傷，所以顯著降低了對秈稻外植體供應(yīng)的壓力。
[0044]4、轉(zhuǎn)化效率高。本發(fā)明轉(zhuǎn)化水稻的方法的轉(zhuǎn)化頻率可達(dá)10%以上。
[0045]5、轉(zhuǎn)化成本低。由于本發(fā)明轉(zhuǎn)化水稻的方法可以提供大量優(yōu)良的水稻胚性愈傷，所以大大減小了秈稻組織培養(yǎng)的時間和人力消耗。
[0046]下面通過附圖和實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0047]圖1為本發(fā)明轉(zhuǎn)化水稻的方法的重組克隆載體DBNOl-T構(gòu)建流程圖；
[0048]圖2為本發(fā)明轉(zhuǎn)化水稻的方法的重組表達(dá)載體DBN100001構(gòu)建流程圖；
[0049]圖3為本發(fā)明轉(zhuǎn)化水稻的方法的轉(zhuǎn)化水稻組織的效果圖。
【具體實施方式】
[0050]下面通過具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明轉(zhuǎn)化水稻的方法的技術(shù)方案。
[0051]第一實施例、重組表達(dá)載體的構(gòu)建及重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0052]1、構(gòu)建含有目的基因的重組克隆載體
[0053]將HPT 核苷酸序列連入克隆載體 pGEM-T (Promega，Madison，USA，CAT:A3600)上，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM_T載體說明書進(jìn)行，得到重組克隆載體DBN01-T，其構(gòu)建流程如圖1所示(其中，Amp表示氨芐青霉素抗性基因；fl表示噬菌體fl的復(fù)制起點；LacZ為LacZ起始密碼子；SP6為SP6RNA聚合酶啟動子；T7為T7RNA聚合酶啟動子；ΗΡΤ為潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因核苷酸序列(SEQ ID N0:1) ;MCS為多克隆位點)。
[0054]然后將重組克隆載體DBNOl-T用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞(Transgen, Beijing, China, CAT:CD501)，其熱激條件為:50 μ I大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞、10μ I質(zhì)粒DNA (重組克隆載體DBN01Ab-T)，42°C水浴30秒；37°C振蕩培養(yǎng)I小時(200rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)，在表面涂有IPTG (異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X_gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷)的氨芐青霉素(100mg/L)的LB平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L,瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨芐青霉素100mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒:將菌液在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心lmin，去上清液，沉淀菌體用100 μ I冰預(yù)冷的溶液I (25mMTris-HCl, IOmM EDTA (乙二胺四乙酸)，50mM葡萄糖，pH8.0)懸??；加入200 μ I新配制的溶液II (0.2Μ NaOH, 1%SDS (十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3_5min ;加Λ 150 μ I冰冷的溶液III (3Μ醋酸鉀，5Μ醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5_10min ;于溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無水乙醇，混勻后室溫放置5min ;于溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min,棄上清液,沉淀用濃度(V/V)為70%的乙醇洗滌后晾干；加入 30μ I 含 RNase (20μ g/ml)的 TE (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA,PH8.0)溶解沉淀；于溫度37°C下水浴30min，消化RNA ;于溫度_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0055]提取的質(zhì)粒經(jīng)ApaI和EcoRV酶切鑒定后，對陽性克隆進(jìn)行測序驗證，結(jié)果表明重組克隆載體DBN01-T中插入的HPT基因序列為序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
[0056]2、構(gòu)建含有目的基因的重組表達(dá)載體
[0057]用限制性內(nèi)切酶HindIII和KasI分別酶切重組克隆載體DBN01-T和表達(dá)載體DBNBC-01 (載體骨架:pCAMBIA2301 (CAMBIA機構(gòu)可以提供))，將切下的HPT基因序列插到表達(dá)載體DBNBC-01的HindIII和KasI位點之間，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，構(gòu)建成重組表達(dá)載體DBN100001，其構(gòu)建流程如圖2所示(Kan:卡那霉素基因；RB:右邊界；Ub1:玉米Ubiquitin(泛素)基因啟動子(SEQ ID N0:2)；HPT:潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因核苷酸序列(SEQ ID NO: l)；Nos:胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQ ID N0:3)；LB:左邊界)。
[0058]將重組表達(dá)載體DBN100001用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞，其熱激條件為:50μ I大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞、10 μ I質(zhì)粒DNA (重組表達(dá)載體DBN100001 )，42°C水浴30秒；37°C振蕩培養(yǎng)I小時(200rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動)；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固體平板(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L, NaCl 10g/L,瓊脂15g/L,用NaOH調(diào)pH至7.5)上于溫度37°C條件下培養(yǎng)12小時，挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L,卡那霉素50mg/L，用NaOH調(diào)pH至7.5 )中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過夜。堿法提取其質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶HindIII和KasI酶切后鑒定，并將陽性克隆進(jìn)行測序鑒定，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN100001在HindIII和KasI位點間的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，即HPT核苷酸序列。
[0059]3、重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0060]對己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體DBN100001用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌ΕΗΑ105α中，其轉(zhuǎn)化條件為:100 μ L農(nóng)桿菌ΕΗΑ105 α、3 μ L質(zhì)粒DNA (重組表達(dá)載體);置于液氮中10分鐘，37°C溫水浴10分鐘；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌EHA105 α接種于LB試管中于溫度28°C、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶ApaLI和EcoRV酶切后進(jìn)行酶切驗證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN100001結(jié)構(gòu)完
全正確。
[0061]第二實施例、轉(zhuǎn)基因水稻植株的獲得
[0062]成熟種子滅菌:取成熟的水稻種子(明恢63)若干，脫殼后挑選顆粒飽滿、胚完好的糙米置于三角瓶中，用75% (v/v)的酒精滅菌lmin,以除去糙米表面的米糠等雜質(zhì),將液體濾去，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%的次氯酸鈉(含吐溫20 (I滴/30mL))，并不斷地?fù)u晃振蕩20-40分鐘，用無菌水沖洗4-5次以去除殘留的次氯酸鈉。
[0063]愈傷誘導(dǎo):將上述處理后的糙米略微干燥后接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基大量鹽、B5培養(yǎng)基微量鹽、 B5培養(yǎng)基有機質(zhì)、蔗糖30g/L、干酪素500mg/L、谷氨酰胺500mg/L、脯氨酸500mg/L、2-嗎啉乙磺酸(MES) 500mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D) l_3mg/L、植物凝膠2.5-3.5g/L，pH5.8)上，每皿10-14粒胚，28_30°C暗培養(yǎng)I周左右，直至成熟胚的盾片處誘導(dǎo)產(chǎn)生直徑大約2-4mm的初生愈傷(顏色鮮黃、質(zhì)地堅硬、胚性狀態(tài)好)。
[0064]初生愈傷懸浮培養(yǎng):從上述成熟胚的盾片處小心地剝離所述初生愈傷，并將其轉(zhuǎn)移到裝有愈傷擴(kuò)增懸浮培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基大量鹽、B5培養(yǎng)基微量鹽、B5培養(yǎng)基有機質(zhì)、蔗糖30g/L、干酪素500mg/L、谷氨酰胺500mg/L、脯氨酸500mg/L、2_嗎啉乙磺酸(MES)500mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) l-3mg/L，pH5.8)的三角瓶中，每個三角瓶中接種4_5粒初生愈傷，在28-30°C暗培養(yǎng)條件下，將三角瓶置于轉(zhuǎn)速100-150r/min機械搖床上震蕩培養(yǎng)，直至擴(kuò)增出大量水稻愈傷組織顆粒。
[0065]愈傷懸浮培養(yǎng)繼代:所述初生愈傷懸浮培養(yǎng)10-25天后，挑選所述懸浮培養(yǎng)基中生長旺盛、質(zhì)地堅硬、色澤鮮黃的所述愈傷組織顆粒(胚性愈傷)(6粒)，轉(zhuǎn)移至另一裝有所述懸浮培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行繼代懸浮培養(yǎng)，每個三角瓶接種5-15粒所述愈傷組織顆粒，在28-30°C暗培養(yǎng)條件下，將三角瓶置于轉(zhuǎn)速100-150r/min機械搖床上震蕩培養(yǎng)，以便獲得大量的愈傷組織(35粒)留存?zhèn)溆?。每?0-20天可繼代一次，胚性狀態(tài)好的愈傷組織能無限繼代下去。
[0066]預(yù)培養(yǎng):愈傷組織的在轉(zhuǎn)化前3-10天，將活力旺盛、生長良好的所述愈傷組織轉(zhuǎn)移到預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基大量鹽、B5培養(yǎng)基微量鹽、B5培養(yǎng)基有機質(zhì)、蔗糖30g/L、干酪素500mg/L、谷氨酰胺500mg/L、脯氨酸500mg/L、2_嗎啉乙磺酸(MES)500mg/L、2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) l_3mg/L、植物凝膠2.5-3.5g/L，pH5.8)上，繼續(xù)在28-30°C條件下暗培養(yǎng)。
[0067]農(nóng)桿菌菌液的制備:用槍頭挑取含有DBN100001的農(nóng)桿菌單菌落，接入到含有25mg/L利福平(Rifampicin)和50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物 5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素 50mg/L，用 NaOH 調(diào) pH 至 7.5)中，28°C黑暗條件下振蕩(200rpm)培養(yǎng)16_18h。再取200ml的新鮮菌液，加入到20ml所述LB液體培養(yǎng)基中，并于上述相同條件下再培養(yǎng)12h。菌液在4000rpm條件下離心lOmin，之后棄去LB培養(yǎng)基上清液；加入0.1M MgS04溶液20ml重新懸浮農(nóng)桿菌；菌液于4000rpm條件下離心lOmin，隨后棄去含有抗生素的MgS04上清液；用5ml侵染培養(yǎng)液(N6培養(yǎng)基大量鹽、B5培養(yǎng)基微量鹽、B5培養(yǎng)基有機質(zhì)、干酪素500mg/L、蔗糖30g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS) 100-200uM、谷氨酰胺 500mg/L、脯氨酸 500mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D) l_3mg/L，pH5.4);中重新懸浮(用移液槍輕輕吹打)農(nóng)桿菌，再加入適量的侵染培養(yǎng)液，將其濃度調(diào)整為 OD600=0.1-0.6。[0068]農(nóng)桿菌侵染水稻愈傷:將農(nóng)桿菌菌液(20_30ml)與預(yù)培養(yǎng)后的水稻愈傷組織(200個，浸沒在菌液中)一起放置5-20分鐘；侵染結(jié)束后將農(nóng)桿菌菌液吸出，并用濾紙將附著在水稻愈傷組織上的農(nóng)桿菌菌液徹底吸干。
[0069]農(nóng)桿菌與水稻愈傷組織共培養(yǎng):將吸干農(nóng)桿菌菌液的愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基大量鹽、B5培養(yǎng)基微量鹽、B5培養(yǎng)基有機質(zhì)、干酪素500mg/L、蔗糖30g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS) 100-200uM、谷氨酰胺500mg/L、脯氨酸500mg/L、2_嗎啉乙磺酸(MES) 500mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D) l_3mg/L、植物凝膠 3_6g/L，pH5.8)上，愈傷組織與農(nóng)桿菌在20-28°C條件下暗培養(yǎng)至少48小時。
[0070]水稻愈傷組織的恢復(fù):將共培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基大量鹽、B5培養(yǎng)基微量鹽、B5培養(yǎng)基有機質(zhì)、干酪素500mg/L、蔗糖30g/L、谷氨酰胺500mg/L、脯氨酸500mg/L、2-嗎啉乙磺酸(MES) 500mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D) l_3mg/L、植物凝膠2.5-3.5g/L、頭孢霉素500mg/L，pH5.8)上，在28_30°C條件下暗培養(yǎng)2_7天，以消除農(nóng)桿菌并為侵染細(xì)胞提供恢復(fù)期。
[0071]水稻愈傷組織的篩選:恢復(fù)期結(jié)束后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基大量鹽、B5培養(yǎng)基微量鹽、B5培養(yǎng)基有機質(zhì)、干酪素500mg/L、蔗糖30g/L、谷氨酰胺500mg/L、脯氨酸 500mg/L、2-嗎啉乙磺酸(MES) 500mg/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4_D) l_3mg/L、植物凝膠 2.5-3.5g/L、頭孢霉素 500mg/L、潮霉素(Hygromycine)50mg/L，pH5.8)上，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選擇性生長，在28-30°C條件下暗培養(yǎng)3-6周，獲得抗性愈傷組織(50個)。
[0072]水稻抗性愈傷組織再生成植物:將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基大量鹽、B5培養(yǎng)基微量鹽、B5培養(yǎng)基有機質(zhì)、干酪素500mg/L、蔗糖30g/L、2_嗎啉乙磺酸(MES)500mg/L、激動素(KT)l-3mg/L、6-芐氨基腺嘌呤 0-2mg/L、奈乙酸(NAA)0.2-lmg/L、植物凝膠 2-4g/L、頭孢霉素 0-200mg/L、潮霉素(Hygromycine) 20mg/L，pH5.8)上，在 25_30°C的光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)分化3-5周；分化出來的小苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基大量鹽、MS培養(yǎng)基微量鹽、N6培養(yǎng)基有機質(zhì)、干酪素500mg/L、蔗糖15g/L、奈乙酸(NAA)O-0.5mg/L、植物凝膠2.5-3.5g/L，pH5.8)上，25_30°C下光照培養(yǎng)至約IOcm高，移至30°C條件下的溫室培養(yǎng)可以獲得轉(zhuǎn)基因植株。
[0073]第三實施例、用TaqMan驗證轉(zhuǎn)基因的水稻植株
[0074]取轉(zhuǎn)基因水稻植株的葉片約IOOmg作為樣品，用Qiagen的DNeasy Plant MaxiKit提取其基因組DNA，通過Taqman探針熒光定量PCR方法檢測HPT基因的拷貝數(shù)。同時以野生型水稻植株作為對照，按照上述方法進(jìn)行檢測分析。實驗設(shè)3次重復(fù)，取平均值。
[0075]檢測HPT基因拷貝數(shù)的具體方法如下:
[0076]步驟11、取轉(zhuǎn)基因水稻植株和野生型水稻植株的葉片各lOOmg，分別在研缽中用液氮研成勻漿，每個樣品取3個重復(fù)；
[0077]步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA,具體方法參考其產(chǎn)品說明書；
[0078]步驟13、用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific)測定上述樣品的基因組DNA濃度；
[0079]步驟14、 調(diào)整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為80_100ng/μ I ；[0080]步驟15、采用Taqman探針熒光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數(shù)，以經(jīng)過鑒定已知拷貝數(shù)的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，以野生型水稻植株的樣品作為對照，每個樣品3個重復(fù)，取其平均值；熒光定量PCR引物和探針序列分別是:
[0081]以下引物和探針用來檢測HPT基因:
[0082]引物I (PFl):GCATAACAGCGGTCATTGACTG 如序列表中 SEQ ID N0:4 所示；
[0083]引物2 (PRl):AGAAGATGTTGGCGACCTCG 如序列表中 SEQ ID N0:5 所示；
[0084]探針I(yè) (PPl):AGCGAGGCGATGTTCGGGGATTC 如序列表中 SEQ ID NO:6 所示；
[0085]PCR反應(yīng)體系為:
[0086]JumpStart?Taq ReadyMix? (Sigma)10 μ I
[0087]50 X弓丨物/探針混合物I μ I
[0088]基因組DNA3μ I
[0089]水(ddH20)6μ I
[0090]所述50Χ引物/探針混合物包含ImM濃度的每種引物各45 μ 1，100 μ M濃度的探針50μ I和860 μ IlXTE緩沖液，并且在4°C，貯藏在琥珀試管中。
[0091]PCR反應(yīng)條件為:
[0092]
步驟溫度時間
2195 0C5 分鐘
2295 0C30 秒
2360'OI 分鐘
24回到步驟22，重復(fù)40次
[0093]利用SDS2.3 軟件(Applied Biosystems)分析數(shù)據(jù)。
[0094]上述實驗結(jié)果表明，愈傷組織顆粒經(jīng)過懸浮培養(yǎng)繼代后獲得了大量的愈傷組織，擴(kuò)增效率可達(dá)5倍以上；HPT基因均已整合到所檢測的水稻植株的染色體組中的陽性植株為30株,轉(zhuǎn)化效率可達(dá)10%以上,如表1、表2和圖3所示。
[0095]表1、水稻愈傷懸浮培養(yǎng)的實驗結(jié)果
[0096]
【權(quán)利要求】
1.一種誘導(dǎo)水稻愈傷組織的方法，其特征在于，包括: 將水稻種子接種于固體的誘導(dǎo)培養(yǎng)基以誘導(dǎo)初生愈傷； 將所述初生愈傷通過液體的懸浮培養(yǎng)以獲得愈傷組織。
2.一種大量擴(kuò)增水稻愈傷組織的方法，其特征在于，包括: 將水稻種子接種于固體的誘導(dǎo)培養(yǎng)基以誘導(dǎo)初生愈傷； 將所述初生愈傷接種于液體的懸浮培養(yǎng)基以獲得胚性愈傷； 所述胚性愈傷通過懸浮培養(yǎng)繼代以獲得愈傷組織。
3.一種節(jié)省水稻外植體的方法，其特征在于，包括: 將水稻種子接種于固體的誘導(dǎo)培養(yǎng)基以誘導(dǎo)初生愈傷； 將所述初生愈傷接種于液體的懸浮培養(yǎng)基以獲得胚性愈傷； 所述胚性愈傷通過懸浮培養(yǎng)繼代以獲得愈傷組織。
4.一種轉(zhuǎn)化水稻的方法，其特征在于，包括: 采用權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)水稻愈傷組織的方法或權(quán)利要求2所述大量擴(kuò)增水稻愈傷組織的方法獲得的愈傷組織； 農(nóng)桿菌侵染所述愈傷組織。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述轉(zhuǎn)化水稻的方法，其特征在于，所述侵染步驟之前的步驟為將所述愈傷組織進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。
6.一種生產(chǎn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的水稻植物的方法，其特征在于，包括: 采用權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)水稻愈傷組織的方法或權(quán)利要求2所述大量擴(kuò)增水稻愈傷組織的方法獲得的愈傷組織； 農(nóng)桿菌侵染所述愈傷組織； 侵染后的愈傷組織與所述農(nóng)桿菌共培養(yǎng)； 在含有選擇劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇轉(zhuǎn)化的抗性愈傷組織； 轉(zhuǎn)化的抗性愈傷組織再生為水稻植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述生產(chǎn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的水稻植物的方法，其特征在于，所述侵染步驟之前的步驟為將所述愈傷組織進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述生產(chǎn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的水稻植物的方法，其特征在于，所述共培養(yǎng)步驟之前的步驟為將侵染后的愈傷組織進(jìn)行干燥處理。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8任一項所述生產(chǎn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的水稻植物的方法，其特征在于，所述選擇步驟之前的步驟為將共培養(yǎng)后的愈傷組織進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述生產(chǎn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的水稻植物的方法，其特征在于，所述選擇劑是潮霉素、甘露糖或草丁膦。
【文檔編號】A01H4/00GK103740635SQ201310722080
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】金許成 申請人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司生物技術(shù)中心