專利名稱：高熱穩(wěn)定性β-半乳糖苷酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種耐SDS的高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶的編碼基因，用此基因或其部分克隆半乳糖苷酶基因的方法，及生產(chǎn)用于例如食品工業(yè)和制糖業(yè)的這種酶的基因工程方法。
已在動(dòng)物、植物和微生物中發(fā)現(xiàn)了β—半乳糖苷酶，它是一種能夠分解β—半乳糖苷的酶。已知該酶特別存在于細(xì)菌如大腸桿菌、乳鏈球菌枯草桿菌、嗜熱鏈球菌和Solfataricus硫化葉菌中。利用其水解乳糖成為半乳糖和葡萄糖的能力。這種β—半乳糖苷酶用于生產(chǎn)低乳糖奶。它還用于從在奶酪的生產(chǎn)工藝中形成的大量奶清中所含乳糖生產(chǎn)半乳糖或葡萄糖。
因此，為了將β—半乳糖苷酶應(yīng)用于食品加工，要求開發(fā)一種能經(jīng)受高溫使用的酶，高溫一方面是為了防止在加工過(guò)程的微生物污染，另一方面是為了提高作為底物的乳糖的溶解度。
另外，近年來(lái)利用β—半乳糖苷酶糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)進(jìn)行各種糖化合物的生產(chǎn)(日本專利公開NO.25275/1994和14774/1994)。因此，需要開發(fā)高熱穩(wěn)定性的酶。
例如源自Sulfolobus Solfataricus的β—半乳糖苷酶[EuropeanJournal of Biochemistry，187，321—328(1990)]是一種耐熱酶，其在90℃時(shí)有活性。但在85℃處理180分鐘后，其活性減至約50％。
在例如European Journal of Biochemistry，213，305—312(1993)中描述了產(chǎn)自高嗜熱細(xì)菌Pyrococcus furiosus的β—半乳糖苷酶在高溫下有活性，從而保證了高熱穩(wěn)定性。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了一種高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶，在90℃處理120分鐘后，其殘余活性比為約80％，并成功地分離了三類β—半乳糖苷酶(歐洲專利會(huì)開NO.0592158 A2)。
這三類β—半乳糖苷酶都是高熱穩(wěn)定性的，其中一類β—半乳糖苷酶極其穩(wěn)定，甚至在1％十二烷基硫酸鈉(SDS)存在下顯示活性。
如上所述，在高溫下進(jìn)行的食品加工和糖化合物生產(chǎn)中要求耐熱和熱穩(wěn)定性酶。另外，如果甚至在強(qiáng)表面活性劑SDS存在下酶具有活性，其應(yīng)用范圍就更廣。
本發(fā)明的目的是分離具有改進(jìn)的耐熱性，良好的熱穩(wěn)定性和耐受表面活性劑的β—半乳糖苷酶的編碼基因，及用上述基因生產(chǎn)高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶的工業(yè)方法。
概括起來(lái)講，本發(fā)明的第一方面涉及源自Pyrococcus furiosus的分離的耐SDS高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶基因。本發(fā)明的第二方面涉及根據(jù)本發(fā)明第一方面的基因，它編碼具有如SEQ ID NO1中所示的氨基酸序列或其部分并具有高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶活性的片段。本發(fā)明的第三方面涉及根據(jù)本發(fā)明第一方面的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO2中所示。本發(fā)明的第四方面涉及一種耐SDS的高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶基因，它能與根據(jù)本發(fā)明第二方面的基因雜交。本發(fā)明的第五方面涉及一種克隆高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶基因的方法，它包括根據(jù)本發(fā)明第1—4方面之一的基因或其部分用作探針或引物。本發(fā)明的第六方面涉及高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶的生產(chǎn)方法，它包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子中已導(dǎo)入了含有根據(jù)本發(fā)明第一方面的高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶基因的重組質(zhì)粒，然后從培養(yǎng)物中收獲高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶。
含本發(fā)明中的編碼高耐熱β—半乳糖苷酶的分離DNA的高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶基因，可通過(guò)使用粘性質(zhì)粒載體的表達(dá)克隆方法篩選得到。表達(dá)克隆是一種可被用于在無(wú)靶酶一級(jí)結(jié)構(gòu)的任何信息的情況下克隆某些酶的編碼基因的方法。例如，用表達(dá)克隆方法克隆了Pyrococcus Woesei的支鏈淀粉酶基因(WO 92/02614)。但該方法不能應(yīng)用于所有類型的酶，因?yàn)樵谫|(zhì)粒載體用于該方法時(shí)，需要非常適當(dāng)?shù)南拗泼?；它必須將靶基因切得足夠小以插入質(zhì)粒載體中，而又不在靶基因的內(nèi)部切割。另外，因?yàn)樾枰獛状慰寺。@種方法很復(fù)雜。
因此，本發(fā)明者試圖通過(guò)用Pyrococcus furiosus基因組DNA構(gòu)建的粘性質(zhì)粒文庫(kù)中篩選β—半乳糖苷酶活性，來(lái)分離β—半乳糖苷酶基因，該粘性質(zhì)粒載體中插入的DNA片斷(35—50kbp)要比質(zhì)粒載體中的大。通過(guò)使用粘性質(zhì)粒載體，用限制酶切在編碼酶的靶基因內(nèi)部的危險(xiǎn)性降低，并且需測(cè)試的克隆數(shù)減少。相反，產(chǎn)生了檢測(cè)不到酶活性的危險(xiǎn)，這是因?yàn)檎承再|(zhì)粒載體在宿主生物中的考貝數(shù)比質(zhì)粒載體的少，因而酶的表達(dá)水平低。
本發(fā)明者的目標(biāo)是熱穩(wěn)定性極高的靶酶，并使制備僅含熱穩(wěn)定蛋白的溶胞產(chǎn)物的方法和個(gè)別培養(yǎng)粘性質(zhì)粒文庫(kù)中的轉(zhuǎn)化子的方法結(jié)合起來(lái)。將這組溶胞產(chǎn)物稱為“粘性質(zhì)粒蛋白文庫(kù)”。使用該文庫(kù)檢測(cè)酶活性，比使用轉(zhuǎn)化子的菌落檢測(cè)敏感性提高，可消除如宿主蛋白或酶活性抑制的本底不良影響。
本發(fā)明者研究了源自Pyrococcus furiosus的粘性質(zhì)粒蛋白文庫(kù)，并得到一個(gè)在1％SDS存在下具有β—半乳糖苷酶活性(盡管弱)的粘性質(zhì)?？寺?。
更進(jìn)一步，本發(fā)明者充分利用各種基因工程技術(shù)從插入上述分離的克隆中的DNA片斷中分離了編碼高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶的基因，并測(cè)定了該基因的DNA序列。另外，本發(fā)明者還用該基因成功地表達(dá)了高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶，這樣完成了本發(fā)明。
順便講，這里描述的使用粘性質(zhì)粒載體的表達(dá)克隆方法不能應(yīng)用于所有熱穩(wěn)定性酶，結(jié)果由靶酶的性質(zhì)決定。例如，本發(fā)明者試圖分離Pyrococcus furiosus的編碼α—葡糖苷酶的基因[Journal ofBacteriology，172，3654—3660(1990)]，但沒有分離到該基因。
現(xiàn)在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述。
對(duì)用于本發(fā)明的微生物沒有特別限制，只要它能產(chǎn)生高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶基因。例如，屬于Pyrococcus屬的菌株，即高熱穩(wěn)定性細(xì)菌，如Pyrococcus furiocus DSM3638和Pyrococcus woesei DSM3773適用于此，這兩種菌株都可從Deutsche Sammalung vor Mikroor-ganismen und Zellkulturen GmbH得到。
例如，可按下述方式制備Pyrococcus furiosus基因的粘性質(zhì)粒文庫(kù)。首先，Pyrococcus furiosus DSM 3638的基因組基因用適當(dāng)?shù)南拗泼溉鏢au 3AI(由Takara Shuzo公司生產(chǎn))部分消化。按35—50Kbp的大小分離后，所得每個(gè)DNA片斷與適當(dāng)?shù)恼承再|(zhì)粒載體如TripleHelix粘性質(zhì)粒載體(由Stratagene生產(chǎn))連結(jié)。通過(guò)體外包裝方法先將Pyrococcus furiosus基因組DNA片段包裝在λ-噬菌體顆粒中，然后用所得噬菌體溶液轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌株如大腸桿菌DH5αMCR(由BRL生產(chǎn))，從而得到目標(biāo)粘性質(zhì)粒文庫(kù)。然后從轉(zhuǎn)化子的幾個(gè)菌落制備了粘性質(zhì)粒DNA，這樣證實(shí)了35—50Kbp的基因組DNA片段在轉(zhuǎn)化子中的插入。一般地講，可培養(yǎng)300—700個(gè)菌落。
每個(gè)菌落培養(yǎng)后，收集培養(yǎng)后的細(xì)胞。通過(guò)在100℃處理10分鐘、超聲、及在100℃再處理10分鐘，將這些細(xì)胞加工成粘性質(zhì)粒蛋白文庫(kù)。然后在1％SDS存在下測(cè)定所得溶胞產(chǎn)物中的β—半乳糖苷酶活性，從而篩選到了在上述處理后還保持穩(wěn)定的高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶的表達(dá)菌落。例如用鄰硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷或乳糖(均由Nacalai Tesque制造)作為底物在如95℃的反應(yīng)溫度下測(cè)定β—半乳糖苷酶活性。然后，分析顯示活性的轉(zhuǎn)化子的插入粘性質(zhì)粒DNA中的片段。
由本發(fā)明者制備的500個(gè)轉(zhuǎn)化子中一個(gè)轉(zhuǎn)化子顯示活性，插入其粘性質(zhì)粒DNA中的片斷用各種限制性酶裂解，將形成的片斷插入適當(dāng)?shù)妮d體中。例如，從上述粘性質(zhì)?？寺≈频玫恼承再|(zhì)粒DNA用Hind III(由Takara Shuzo公司生產(chǎn))消化，將所得DNA片斷插入質(zhì)粒載體pUC18(由Takara Shuzo公司生產(chǎn))的Hind III位點(diǎn)。這樣可得到重組質(zhì)粒。
然后，將此重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM 109(由Takara Shuzo公司生產(chǎn))中，從而得到轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)并收獲轉(zhuǎn)化子。檢測(cè)β—半乳糖苷酶(細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白)的活性。對(duì)細(xì)胞及在100℃進(jìn)行熱處理10分鐘兩次所得溶胞產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，用鄰硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷作為底物在1％SDS存在下進(jìn)行。在95℃下反應(yīng)進(jìn)行30分鐘，來(lái)測(cè)定活性。
發(fā)現(xiàn)上述轉(zhuǎn)化子的溶胞產(chǎn)物無(wú)活性。然后，用限制酶AccI、BglII、Eco RV、PstI和Hinc II(均由Takara Shuzo公司生產(chǎn))中的每一種以相同方法進(jìn)行活性研究，但沒發(fā)現(xiàn)活性。
使用能夠產(chǎn)生比使用上述限制酶更長(zhǎng)的DNA片段的限制酶進(jìn)行相同的研究，例如Cla I(由Takara shuzo公司生產(chǎn))。但發(fā)現(xiàn)在向質(zhì)粒插入階段插入片段中有缺失，并發(fā)現(xiàn)無(wú)活性。后來(lái)用SmaI(由Takara Shzo公司生產(chǎn))以相同方法進(jìn)行研究。結(jié)果，在其中插入了約4Kbp的DNA片段的質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)了活性。本發(fā)明者稱此質(zhì)粒為質(zhì)粒pTG2S—112。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM 109，可得到本發(fā)明者稱為大腸桿菌JM 109/pTG2S—112的轉(zhuǎn)化子。培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)后收集細(xì)胞。在這些細(xì)胞中表達(dá)的β—半乳糖苷酶在1％SDS存在下100℃下10分鐘處理兩次，仍保持穩(wěn)定。因此，其中已表達(dá)了靶酶高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶。
質(zhì)粒pTG2S—112進(jìn)一步用各種限制酶消化，將形成的片斷插入適當(dāng)載體中。將形成的重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109中，培養(yǎng)并收獲所得轉(zhuǎn)化子。檢測(cè)β—半乳糖苷酶(細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白)的活性。這樣可找出表達(dá)高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶的質(zhì)粒。
例如，質(zhì)粒pTG2S—112用限制酶Eco 81I(由Takara Shuzo公司生產(chǎn))和SmaI消化。純化所形成的約2.0Kbp的Eco 81I—SmaI DNA斷片，并插入pUC18中，從而得到重組質(zhì)粒。
另外，利用pTG2S—112的載體(pUC18)區(qū)的多克隆位點(diǎn)，用限制酶Eco81I和KpnI(由Takara Shuzo公司生產(chǎn))消化。純化形成的約4.7Kbp的Eco 81I—KpnI DNA片斷，將末端鈍化并自身連結(jié)。這樣可得到含上述Eco 81I—SmaI DNA片斷的重組質(zhì)粒。
將此質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌JM109中，檢測(cè)所形成菌落的高熱穩(wěn)定β—半乳糖苷酶活性。從顯示活性的菌落制備了一質(zhì)粒，該質(zhì)粒稱為質(zhì)粒pTG2ES—105。因此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌JM109稱為大腸桿菌JM109/pTG2ES—105。該菌株已于1994年4月20日保藏在Nation-al Institute of Bioscience和Human—Technology Agency of IndustrialScience and Technology L(1—3，Higashi 1 Chome Tsukuba—shi Ibaraki—ken 305，JAPAN)，保藏號(hào)為FERM BP—5023，質(zhì)粒pTG2ES—105的限制性酶切圖譜示于

圖1中，其中粗實(shí)線代表插入質(zhì)粒pUC18中的片斷。
本申請(qǐng)的基因(DNA)可由第三者從已知的公開的商業(yè)上可得到的微生物菌株P(guān)yrococcus furiosus和Pyrococcus woesei(請(qǐng)見1993年的DSM目錄，特別是DSM3638和DSM3773)開始，并按照本申請(qǐng)說(shuō)明書中所解釋的步驟得到。因此，本發(fā)明的基因沒有必要保藏。但為保全起見，申請(qǐng)人已于1995年6月7日將大腸桿菌JM109/pTG2ES—105保藏在中國(guó)典型微生物保藏中心(CCTCC)，保藏號(hào)為CCTCC—M95030。
圖2表示源自Pyrococcus furiosus并插入質(zhì)粒pTG2ES—105中的DNA片斷的限制性酶切圖。即圖2表示按照本發(fā)明所得高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶基因形式之一的限制性酶切圖。通過(guò)培養(yǎng)稱為大腸桿菌JM109/pTG2ES—105的轉(zhuǎn)化子然后收集所得細(xì)胞，其中表達(dá)的β—半乳糖苷酶在1％SDS存在下100℃10分鐘進(jìn)行兩次熱處理后仍穩(wěn)定。因此，其中已表達(dá)了靶酶高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶。
通過(guò)培養(yǎng)已導(dǎo)入了含高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶基因的重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，如大腸桿菌JM109/pTG2S—112或大腸桿菌JM109/pTG2ES—105，積累高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶。高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶從培養(yǎng)物中的純化可這樣進(jìn)行，如超聲破碎所收集細(xì)胞，離心溶胞產(chǎn)物，并將形成的上清液進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、疏水層析等。
當(dāng)在本發(fā)明中欲純化高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶時(shí)，在超聲處理之前或之后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熱處理有利，因?yàn)檫@樣可使污染蛋白變性，從而可容易地進(jìn)行純化。
通過(guò)表達(dá)本發(fā)明的基因如整合在質(zhì)粒pTG2ES—105中的基因，所得到的高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶具有如下理化性質(zhì)。(1)作用它具有水解乳糖成為半乳糖和葡萄糖的作用。另外，它具有水解鄰硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷為鄰硝基苯酚和半乳糖的作用。
更進(jìn)一步，它在含1％SDS的50mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中具有水解鄰硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷為鄰硝基苯酚和半乳糖的作用。(2)測(cè)定酶活性的方法[(2)—a]在酶活性測(cè)定中，可通過(guò)分光光度法檢測(cè)水解所形成的鄰硝基苯酚來(lái)測(cè)定酶的鄰硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷水解活性。即，將5μl本發(fā)明的酶溶液加到含112mM 2—巰基乙醇、1mM氯化鎂和1％SDS的199μl100mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中。然后向其中加入含0.4M鄰硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷的1μl二甲基亞砜溶液。在95℃反應(yīng)進(jìn)行30分鐘后，加入100μl0.1M碳酸鈉終止反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)混合物在410nm處的吸光度，從而確定所形成的鄰硝基苯酚的量。按照本發(fā)明所得高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶的一個(gè)單位表示在95℃1分鐘內(nèi)可使410nm處的吸光度增加1.0的酶量。本發(fā)明中所得酶在pH 7.0、95℃下，1％SDS存在下具有分解鄰硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷的活性。[(2)-b]β—半乳糖苷酶的鄰硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷水解活性還可按下述方法測(cè)定。將含1M鄰硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷的15μl二甲亞砜溶液加到分光光度計(jì)的石英小池中的含酶的1485μlMcIlvaine緩沖液(pH 5.0)中開始反應(yīng)，使鄰硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷的終濃度達(dá)10mM。在分光光度計(jì)上監(jiān)視410nm處的吸光度對(duì)時(shí)間的變化來(lái)檢測(cè)反應(yīng)。基于每分鐘410nm處吸光度的變化，用前述測(cè)定的吸光系數(shù)計(jì)算每分鐘所釋放的鄰硝基苯酚。一單位酶活性定義為每分鐘催化釋放1μmol鄰硝基苯酚所要求的量。
用蛋白檢測(cè)試劑盒(由Bio—Rad Laboratories制造)進(jìn)行酶蛋白檢測(cè)。(3)熱穩(wěn)定性用與[(2)—b]中所述方法相符的下列步驟測(cè)定了熱穩(wěn)定性。將含酶的1.5ml McIlvaine緩沖液(pH5.0)在90℃加熱一段給定時(shí)間，從中取出1485μl所形成的溶液的樣品。將此樣品在分光光度計(jì)小池中于90℃加熱5分鐘，向其中加入15μl含1M鄰硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷的二甲亞砜溶液，以開始反應(yīng)。通過(guò)計(jì)算每分鐘410nm處吸光度的變化并用上述所測(cè)鄰硝基苯酚的消光系數(shù)確定每分鐘所釋放的鄰硝基苯酚的量，以跟蹤該反應(yīng)。甚至在90℃熱處理180分鐘后，本發(fā)明酶的殘余活性比為約100％，如圖3所示。即圖3顯示酶的穩(wěn)定性，縱軸表示殘余活性比(％)，橫軸表示酶在90℃下處理的時(shí)間。(4)最佳pH按照[(2)-b]中所述方法測(cè)定最佳pH。將測(cè)定了給定范圍內(nèi)pH值(pH4—8)的、含10mM鄰硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷的2990μl McIlvaine緩沖液，在小池中90℃下培養(yǎng)，向小池中加入10μl含酶(150單位/ml)的McIlvaine緩沖液(pH 5.0)開始反應(yīng)。在分光光度計(jì)上監(jiān)視410nm處吸光度對(duì)時(shí)間的變化來(lái)檢測(cè)反應(yīng)。測(cè)定每分鐘410mm吸光度的變化，基于此變化用每一pH條件下測(cè)定的吸光系數(shù)計(jì)算出每分鐘釋放的鄰硝基苯酚。一單位酶活性定義為一分鐘內(nèi)催化釋放1μmol鄰硝基苯酚所要求的酚量。如圖4所示，在pH4.5—5.5范圍內(nèi)，本發(fā)明的酶顯示其最大活性。圖4是顯示酶的最佳pH的曲線，其中縱坐標(biāo)為比活性(單位/mg蛋白)，橫坐標(biāo)表示pH值。(5)最佳溫度按照[(2)-b]中所述方法測(cè)定最佳溫度。將2990μl含10mM鄰硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷的McIlvaine緩沖液，在指定溫度下(45℃—90℃)在小池中培養(yǎng)，加入10μl酶(150單位/ml)開始反應(yīng)。在分光光度計(jì)上監(jiān)視410nm處吸光度對(duì)時(shí)間的變化來(lái)檢測(cè)反應(yīng)。測(cè)定每分鐘410mm吸光度的變化，基于此值，用在每一溫度下測(cè)得的吸光系數(shù)計(jì)算出每分鐘所釋放的鄰硝基苯酚。一單位酶活性定義為每分鐘催化釋放1μmol鄰硝基苯酚所要求的酶量。如圖5所示，本發(fā)明的酶在95℃以上顯示其最大活性。圖5為顯示酶的最佳溫度的圖，其中縱座標(biāo)為比活性(單位/mg蛋白)，橫坐標(biāo)為處理溫度(℃)。(6)pH穩(wěn)定性按[(2)-b]中所述方法測(cè)定pH穩(wěn)定性。將含150單位/ml酶的McIlvaine緩沖液(pH 3.0—8.0)和含150單位/ml酶的甘氨酸緩沖液(pH 8.0—11.0)在90℃孵育10分鐘。為起動(dòng)反應(yīng)，向含10mM鄰硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷并在90℃預(yù)培養(yǎng)的2990μl McIl-vaine緩沖液(pH5.0)中，加入10μl酶溶液。
在分光光度計(jì)上監(jiān)視410nm處吸光度的變化來(lái)檢測(cè)反應(yīng)。測(cè)定410nm處吸光度每分鐘內(nèi)的變化，基于此值，用前述測(cè)定的吸光系數(shù)計(jì)算出每分鐘所釋放的鄰硝基酚。一單位酶活性定義為每分鐘內(nèi)釋放1μmol鄰硝基苯酚所要求的酶量。如圖6所示，本發(fā)明的酶甚至在pH范圍5.0—10.0范圍內(nèi)90℃下處理10分鐘后仍保持其活性。圖6為顯示酶的pH穩(wěn)定性的圖，其中縱座標(biāo)為殘余活性比(％)，橫座標(biāo)為處理pH。(7)各種表面活性劑的影響與[(2)-b]中所述方法相符，按下述步驟測(cè)定了各種表面活性劑存在下酶的熱穩(wěn)定性，十二烷基硫酸鈉[由Nacalai Tesue生產(chǎn)]用作陰離子表面活性劑，溴化十六烷基三甲基銨(Nacalai Tesque生產(chǎn))用作陽(yáng)離子表面活性劑，聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯(由Wako Pure Chemical Industries Ltd生產(chǎn))作為非離子表面活性劑，膽酸鈉(由Nacalai Tesque生產(chǎn))用作兩性表面活性劑。
將反應(yīng)溶液中上述表面活性劑的濃度調(diào)至1％。將1.5ml含酶的50mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)在90℃加熱一定時(shí)間，從中取出1485ml形成的溶液作為樣品。樣品在分光光度計(jì)小池中90℃下加熱5分鐘，向其中加入15μl含1M鄰硝基苯基—β—D—吡喃半孔糖苷的二甲亞砜溶液，開始反應(yīng)。通過(guò)計(jì)算每分鐘410nm吸光度的變化并從前述測(cè)得的鄰硝基苯酚的消光系數(shù)確定每分鐘所釋放的鄰硝基苯酚的量，以跟蹤該反應(yīng)。如圖7所示，除溴化十六烷基三甲基銨外，在表面活性劑存在下于90℃熱處理120分鐘后，本發(fā)明的酶的殘余活性比為約80％。特別是，在十二烷基硫酸鈉(常用于使蛋白質(zhì)變性)存在下，于90℃熱處理120分鐘后，本發(fā)明的酶的殘余活性比為約90％。圖7是顯示在每一表面活性劑存在下酶的熱穩(wěn)定性的圖，其中縱軸表示殘余活性比(％)，橫軸表示在90℃處理酶的時(shí)間。
圖7中，空方塊表示溴化十六烷基三甲基銨，實(shí)方塊表示十二烷基硫酸鈉，空圈表示聚氧乙烯(20)脫水山梨醇單月桂酸酯，實(shí)圈表示膽酸鈉。(8)底物特異性底物特異性可以用表1中所示的對(duì)硝基苯酚衍生物測(cè)定。方法如下所示將1485μl含酶的150mM檸檬酸鈉緩沖液(pH5.0)加入分光光度計(jì)的石英小池中。將15μl表1所示0.1M底物溶液加入酶溶液中并混合。在分光光度計(jì)上馬上監(jiān)視410nm處吸光度對(duì)時(shí)間的變化，檢測(cè)反應(yīng)。用不含酶的1485μl150mM檸檬酸鈉緩沖液(pH5.0)作為空白對(duì)照，如上所述進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)時(shí)，反應(yīng)在90℃下進(jìn)行。一單位酶活性定義為每分鐘催化釋放1μl對(duì)硝基苯酚所需酶量。
按照上述方法，測(cè)定了對(duì)于對(duì)硝基苯基—β—D—吡喃葡糖苷(Glcp—βNp)、對(duì)硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷(GalpβNp)、對(duì)硝基苯基—β—D—吡喃甘露糖苷(ManpβNp)、對(duì)硝基苯基—β—D—吡喃木糖苷(XylpβNp)、對(duì)硝基苯基—β—D—吡喃果糖苷(FucpβNp)、對(duì)硝基苯基—α—D—吡喃半乳糖苷(GalpαNp)(均由Nacalai Tesque生產(chǎn))的水解活性。
結(jié)果示于表1中。表1表示對(duì)上述底物的比活性(單位/mg蛋白)和相對(duì)活性性(％)。
表1酶的比活性底物 比活性 相對(duì)活性(單位/mg)(％)GalpβNp192 100GlcpβNp512 267ManpβNp12.8 6.7XylpβNp51.2 26.7FucpβNp 0 0GalpαNp 0 0另外，用下列天然底物測(cè)試了酶的酶解活性。具體地講，乳糖、纖維二糖和麥芽糖(均由Nacalai Tesque生產(chǎn))的每一種作為底物溶解在1ml150mM檸檬酸鈉緩沖液(pH5.0)中，終濃度為50mM。將羧甲基纖維素(Wako Paro Chemical Industries，Ltd.)、微晶纖維素Avicel(由Funakoshi Pharmaceutical co；Ltd制造)和昆布多糖(由Nacalai Tesque生產(chǎn))的每一種溶解在此緩沖液中，終濃度為17g/l。將上述每種底物溶液加熱至90℃，向其中加入15μl(約45mu)的含酶磷酸鹽緩沖液，在90℃進(jìn)行反應(yīng)30分鐘。用冰冷卻終止反應(yīng)。用Glucose B Test Wako(Wako Pure Chemical Industries，Ltd生產(chǎn))測(cè)定反應(yīng)液中所釋放的葡萄糖的量。表2顯示當(dāng)以乳糖水解活性作為100％時(shí)所測(cè)的其它底物的相對(duì)活性(％)。
表2酶的府物特異性底物 相對(duì)活性(％)乳糖 100纖維二糖 136甲基—β—D—葡糖苷 10.2水楊苷69.6熊果苷6.1蔗糖 1.9麥芽糖1.9羧甲基纖維素 0微晶纖維素Avicel 0昆布多糖 1.3(9)氨基酸序列特征對(duì)于質(zhì)粒pTG2ES—105的β—半乳糖苷酶基因編碼的氨基酸序列(SEQ ID NO1)，用DNASIS的NBRF)PIR(由Hitachi Software Engi-neering制造)對(duì)氨基酸序列同源性進(jìn)行研究。
將本發(fā)明酶和Pyrococcus furiosus產(chǎn)生的其它高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶的氨基酸序列(SEQ ID NO3)與Sulfolobus Solfataricus中存在的兩類熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶的序列(SEQ ID NO4和SEQID NO5)進(jìn)行了對(duì)比，令人驚異地是第一次清楚顯示此兩類熱穩(wěn)定性酶之間的某些同源序列保留在此高熱穩(wěn)定性酶中。圖8和圖9是示于SEQ ID NO1中的氨基酸序列與ESQ ID NO3到SEQ IDNO5的序列的對(duì)比圖。如圖8和圖9中所示的十個(gè)不同的序列，本發(fā)明者均稱之為“盒序列”(盒NO.1到盒NO.10)，為上述的保留序列。基于上述這些序列可以克隆其它高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶基因，例如，使用從盒NO.7，8和10的氨基酸序列制備的引物或探針，其中氨基酸序列分別由SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8所定義。
圖8和圖9中的四排氨基酸序列，從上到下分別相當(dāng)于SEQ IDNO3(第一排)、SEQ ID NO1(第二排)、SEQ ID NO4(第三排)和SEQ ID NO5(第四排)。
如上的詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明提供編碼高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶的基因，和用所述基因生產(chǎn)高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶的基因工程方法。該酶具有高熱穩(wěn)定性，并耐SDS，特別在高溫下食品加工和制糖中有用。
另外，按照本發(fā)明分離的基因或其部分可用作篩選探針或引物。與本發(fā)明酶類似的所有酶的基因，將通過(guò)用所得基因作為探針在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交而得到，這些酶的序列與本發(fā)明的酶稍有不同，但預(yù)期具有相似的酶活性。此外所用術(shù)語(yǔ)“在嚴(yán)格條件下”指探針和其上固定了DNA的尼龍膜的雜交在含6×SSC(1×SSC為8.76g氯化鈉和4.41g檸檬酸鈉溶解在1升水中的溶液)、1％SDS、100μg/ml鮭魚精子DNA和5×Denhardt′s(含牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和ficoll，均為0.1％)的溶液中，于65℃進(jìn)行20小時(shí)。
其序列與本發(fā)明酶的序列稍有不同但預(yù)期具有相似酶活性的、與本發(fā)明酶相似的所有酶的基因，還可用以上所得基因作為引物進(jìn)行擴(kuò)增而得到。
另外，可用具有編碼上述氨基酸序列—由熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶和高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶共同保留的氨基酸序列—的核苷酸序列的寡聚物作為探針進(jìn)行篩選。即，通過(guò)在具有如上所述的相同組成的雜交溶液中在低于Tm值5℃的溫度下進(jìn)行雜交，每個(gè)寡聚物在溫度下與靶DNA形成互補(bǔ)鏈，可分別從嗜熱和高嗜熱細(xì)菌得到任何預(yù)期具有本發(fā)明酶相同的酶活性的與本發(fā)明酶類似的酶的熱穩(wěn)定性和高熱穩(wěn)定性基因。另一方面，可通過(guò)用上述寡聚物作為引物進(jìn)行基因擴(kuò)增來(lái)進(jìn)行篩選。
可用下述方法確定上述篩選所得基團(tuán)是否預(yù)期具有與本發(fā)明酶相同的酶活性的類似于本發(fā)明酶的酶。按常規(guī)步驟將所得基因連結(jié)在確保在適當(dāng)宿主中表達(dá)的表達(dá)載體上，并導(dǎo)入宿主中，從而得到轉(zhuǎn)化子。培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化子，用本文所述方法測(cè)定培養(yǎng)物或其無(wú)細(xì)胞提取物的β—半乳糖苷酶活性。這樣，可確定該基因是否預(yù)期具有與本發(fā)明酶相同的酶活性的類似于本發(fā)明酶的酶的基因，本發(fā)明酶的酶活性指在SDS存在下90℃處理120分鐘后，殘余活性比為約90％。
經(jīng)本發(fā)明的高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶基因的表達(dá)所得高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶，可通過(guò)在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)Pyrococcus屬的菌株如Pyrococcus furiosus DSM3638或Pyrococcus woesei DSM3773，并從細(xì)胞或培養(yǎng)液中純化靶酶而得到。為了培養(yǎng)Pyrococcus屬的細(xì)菌，可用通常用于培養(yǎng)高熱穩(wěn)定性細(xì)菌的方法?？上蚺囵B(yǎng)基中加入所用菌株可利用的任何營(yíng)養(yǎng)物。例如，淀粉可用碳源，胰胨和蛋白胨可用作氮源。其它營(yíng)養(yǎng)物，可使用醇母膏等。此培養(yǎng)基可含有金屬鹽如鎂鹽、鈉鹽或作為微量元素的鐵鹽。使用人工海水制備此培養(yǎng)基是有利的。此培養(yǎng)基優(yōu)選為不含固體硫元素的透明培養(yǎng)基，因?yàn)檫@樣的培養(yǎng)基易于通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)物的光密度來(lái)監(jiān)視細(xì)胞的生長(zhǎng)?？蛇M(jìn)行靜止培養(yǎng)或攪拌下培養(yǎng)。例如，可進(jìn)行通氣培養(yǎng)[WO 90/11352]或透析培養(yǎng)[Applied and Environmental Microbiology，55，2086—2088(1992)]。一般培養(yǎng)溫度優(yōu)選為95℃左右。通常在約16小時(shí)內(nèi)培養(yǎng)物中集累相當(dāng)大量的高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶。當(dāng)然應(yīng)根據(jù)所選菌株和培養(yǎng)基組成確定培養(yǎng)條件，以取得最大產(chǎn)率的高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶。
可通過(guò)例如離心或過(guò)濾從培養(yǎng)液中收集細(xì)胞、然后破碎細(xì)胞來(lái)收獲本發(fā)明的高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶?？赏ㄟ^(guò)例如超聲破碎、珠破碎或溶菌酶處理進(jìn)行細(xì)胞破碎。使用這些技術(shù)，可從細(xì)胞中提取高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶。根據(jù)所選用的細(xì)菌，使用能夠產(chǎn)生最好的提取效果的方法提取此酶，這樣得到了粗酶溶液。結(jié)合純化酶的通用技術(shù)，例如用硫酸銨鹽析、離子交換層析、疏水層析和凝膠過(guò)濾層析，可從所得粗酶溶液中分離高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶。
例如，從Pyrococcus furiosus DSM 3638的培養(yǎng)細(xì)胞制備的粗酶溶液用DEAE Toyopearl M650離子交換劑層析，從中流脫出活性流份。將所得活性流份傾入HIC—Cartridge柱(由Bio—Rad Laboratories生產(chǎn))從中流脫出活性流份。將所得活性流分傾入羥磷灰石柱(由Bio—Rad Laboratories生產(chǎn))，從中洗出活性流份。這樣就得到了高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶。顯示質(zhì)粒pTG2ES—105的限制性酶切圖譜。顯示本發(fā)明的高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶基因一種形式的限制性酶切圖譜。為顯示酶的熱穩(wěn)定性的圖。為顯示酶的最佳pH的圖。為顯示酶的最佳溫度的圖。為顯示酶的pH穩(wěn)定性的圖。為顯示酶在表面活性劑存在下的熱穩(wěn)定性的圖。為對(duì)比β—半乳糖苷酶的氨基酸序列的部分視圖(前半部分)。為對(duì)比β—半乳糖苷酶的氨基酸序列的部分視圖(后半部分)。
下列實(shí)施例將進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不構(gòu)成任何限制。實(shí)施例1[1]Pyrococcus furiosus基因組DNA的制備按下列方式培養(yǎng)Pyrococcus furiosus DSM3638。
將包括1％胰胨、0.5％酵母膏、1％可溶性淀粉、3.5％JamarinSSolid(由Jamarin Laboratory生產(chǎn))、0.5％Jamarin S Liquid(由Ja-marin Laboratory生產(chǎn))、0.003％MgSO4、0.001％NaCl、0.0001％FeS-4·7H2O、0.0001％CoSO4、0.0001％CaCl2·7H2O、0.0001ZnSO4、0.1ppm CuSO4·5H2O、0.1ppmKAl(SO4)2、0.1ppmH3BO3、0.1ppmNa2MoO4·2H2O和0.25ppmNiCl2·6H2O的2升培養(yǎng)基裝入2升培養(yǎng)基瓶中，120℃消毒20分鐘。吹入氮?dú)庀芙庋跻院?，將上述菌株接種在此培養(yǎng)基中，在95℃靜止溫育16小時(shí)。溫育后，離心收集細(xì)胞。
然后將所收集細(xì)胞懸浮在4ml含25％蔗糖的0.05M Tris—HCl(pH，8.0)中。向所得懸液中加入0.8ml溶菌酶[5mg/ml，0.25MTris—HCl(pH8.0)]和2ml0.2M EDTA。在20℃保持1小時(shí)后，加入24ml SET溶液[150mM NaCl，1mM EDTA、20mM Tris—HCl(pH8.0)]。再向其中加入4ml5％SDS和400μl蛋白激酶K(10mg/ml)，在37℃反應(yīng)1小時(shí)。反應(yīng)完成后，用氯仿/苯酚萃取反應(yīng)混合物，用乙醇沉淀。這樣制得了約3.2mg基因組DNA。(2)粘性質(zhì)粒蛋白文庫(kù)的制備將400μg Pyrococcus furiosus DSM 3638基因組DNA在Sau 3AI的緩沖液[5mM Tris—HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、1mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol DTT)，100mM NaCl]中，用Sau 3AI部分消化，通過(guò)梯度離心按大小分級(jí)分離。將1μg Triple Helix粘性質(zhì)粒載體用Bam HI裂解，與140μg上述分級(jí)分離所得35—50kbp的基因組DNA片段混合。用連結(jié)試劑合Ligation kit(由Takara Shuzo公司生產(chǎn))連結(jié)后，用Gigapack II Gold(Stratagene生產(chǎn))按體外包裝方法將Pyro-coccus基因組DNA片段包裝在λ-噬菌體顆粒中。用部分所得噬體溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5αMCR，從而形成粘性質(zhì)粒文庫(kù)。
從幾個(gè)所得菌落制備了粘性質(zhì)粒DNA，并證實(shí)它們都具有適當(dāng)大小的插入片段。然后，將500個(gè)菌落懸浮在2ml含0.01％氨芐基霉素的L-液體培養(yǎng)基中，于37℃搖動(dòng)培養(yǎng)16小時(shí)。離心培養(yǎng)物，收集沉淀的細(xì)胞。將這些細(xì)胞懸浮在20mM Tris—HCl(pH 8.0)中，于100℃熱處理10分鐘。然后，將其超聲處理，再于100℃熱處理10分鐘。離心后，收集上清液，稱為粗酶溶液。這樣制備了500個(gè)粘性質(zhì)粒蛋白文庫(kù)。(3)含β—半乳糖苷酶基因的粘性質(zhì)粒的選擇測(cè)定實(shí)施例1—(2)中所得到的500個(gè)粘性質(zhì)粒蛋白文庫(kù)的粗酶溶液的β—半乳糖苷酶活性。具體講，將10μl粗酶溶液加到含112mM 2-巰基乙醇、1mM氯化鎂和1％SDS的99.5μl 100mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中。然后加入含0.4M鄰硝基苯基—β—D—吡喃半乳糖苷的0.5μl二甲亞砜溶液于95℃反應(yīng)30分鐘、加入0.1M碳酸鈉終止反應(yīng)。測(cè)定410nm處的吸光度，從而確定鄰硝基苯酚的形成量。
從500個(gè)粘性質(zhì)粒蛋白文庫(kù)中選出了一個(gè)具有β—半乳糖苷酶活性的粘性質(zhì)粒蛋白，相應(yīng)地鑒別了一個(gè)粘性質(zhì)粒DNA。(4)質(zhì)粒pTG2S—112的制備和熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶的生產(chǎn)將實(shí)施例1—(3)中所得一個(gè)粘性質(zhì)粒DNA用限制酶Sma I完全消化。另外，將載體pUC18在其Sma I位點(diǎn)裂解，然后未端脫磷酸化。用連結(jié)試劑盒將上述Sma I消化的DNA片段與載體質(zhì)粒連結(jié)。用所形成的反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。將轉(zhuǎn)化子懸浮在含0.01％氨芐青霉素的L-液體培養(yǎng)基中，于37℃搖動(dòng)培養(yǎng)16小時(shí)。離心所形成的培養(yǎng)物，回收的細(xì)胞懸浮在含1mM EDTA的50mM磷酸鹽緩沖液中。將此懸液于100℃加熱10分鐘，超聲處理，于100℃再加熱10分鐘，離心得到上清液作為粗酶溶液。用實(shí)施例1—(3)中相同的活性檢測(cè)方法檢測(cè)β—半乳糖苷酶活性，只是使用5.1該粗酶溶液。發(fā)現(xiàn)此粗酶溶液顯示耐100℃20分鐘的熱處理的高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶活性。
將相應(yīng)于該粗酶溶液的質(zhì)粒稱為質(zhì)粒pTG2S—112。將質(zhì)粒pTG2S—112轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM 109中，得到一轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子稱為大腸桿菌JM109/pTG2S—112。(5)質(zhì)粒pTG2ES—105的制備實(shí)施例1—(4)中所得到的含約4kbp的Sma I DNA片斷的質(zhì)粒pTG2S—112，用限制酶Eco81I和KpnI完全消化。純化形成的約4.7kbp的Eco81I—Kpn I DNA片斷，鈍化未端并自連結(jié)。
所得質(zhì)粒稱為pTG2ES—105，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM 109中，得到一轉(zhuǎn)化子。該轉(zhuǎn)化子稱為大腸桿菌JM109/pTG2ES—105。該菌株已于1994年4月20日保藏在National Institute of Bioscienceand Human—Technology Agency of Industrial Science and Technology(1—3，Higashi 1 Chome Tsukuba—Shi Ibaraki—ken 305，JAPAN)，保藏號(hào)為FERM BP-5023。
圖1顯示質(zhì)粒pTG2ES-105的限制性酶切圖譜，圖2顯示按本發(fā)明從Pyrococcus furiosus得到的插入質(zhì)粒pTG2ES—105中的約2.0kbp的高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶基因的限制性酶切圖譜。實(shí)施例2(高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶基因的核苷酸序列的測(cè)定)
用Deletion Kit for Kilo Sequence試劑盒(由Takara Shuzo公司生產(chǎn))，從上述含高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶基因的插入質(zhì)粒pTG2ES—105中的約2.0kbp片段，制備了缺失突變體，測(cè)定了所形成片段的核苷酸序列。
用雙脫氧方法進(jìn)行核苷酸序列的測(cè)定，其中使用了Bca BastDidexy Sequencing Kit試劑盒(由Takara Shuzo公司生產(chǎn))。
SEQ ID NO2顯示含高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶基因并插入質(zhì)粒pTG2ES—105的DNA片段的核苷酸序列。SEQ ID NO1顯示由上述核苷酸序列編碼的高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶的氨基酸序列。實(shí)施例3(1)高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶的生產(chǎn)實(shí)施例1中所得大腸桿菌JM109/pTG2ES—105(FERM MP-—5023)，其中已導(dǎo)入了含本發(fā)明的高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶基因的質(zhì)粒pTG2ES—105，將其懸浮在含0.01％氨芐青霉素的5ml L—液體培養(yǎng)基中，于37℃搖動(dòng)培養(yǎng)16小時(shí)。將培養(yǎng)物懸浮在1.21相同組成的培養(yǎng)基中，于37℃搖動(dòng)培養(yǎng)16小時(shí)。離心所形成的培養(yǎng)物，將回收的細(xì)胞懸浮在含1mM EDTA的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中。將懸浮液于100℃加熱10分鐘，超聲處理，再于100℃加熱10分鐘，離心得到上清液作為粗酶溶液。
pH5.0和90℃下，此粗酶溶液中的β—半乳糖苷酶的比活性為約740單位/mg。
利用本發(fā)明的高熱穩(wěn)定β—半乳糖苷酶基因可在商用規(guī)模有利地生產(chǎn)耐SDS的高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶。
另外，利用本發(fā)明的高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶基因或其部分作為探針或引物，可得到各種生物衍生物的高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶基因。序列表SEQ I N NO1長(zhǎng)度491類型氨基酸鏈型單鏈形態(tài)線性分子類型肽序列描述SEQ ID NO1Met Lys Phe Pro Lys Asn Phe Met Phe Gly Tyr Ser Trp Ser Gly1 5 l0 15Phe Gln Phe Glu Met Gly Leu Pro Gly Ser Glu Val Glu Ser Asp20 25 30Trp Trp Val Trp Val His Asp Lys Glu Asn Ile Ala Ser Gly Leu35 40 45Val Ser Gly Asp Leu Pro Glu Asn Gly Pro Ala Tyr Trp His Leu50 55 60Tyr Lys Gin Asp His Asp Ile Ala Glu Lys Leu Gly Met Asp Cys65 70 75Ile Arg Gly Gly Ile Glu Trp Ala Arg Ile Phe Pro Lys Pro Thr80 85 90Phe Asp Val Lys Val Asp Val Glu Lys Asp Glu Glu Gly Asn Ile95 100 105Ile Ser Val Asp Val Pro Glu Ser Thr Ile Lys Glu Leu Glu Lys110 115 120Ile Ala Asn Met Glu Ala Leu Glu His Tyr Arg Lys Ile Tyr Ser125 130 135Asp Trp Lys Glu Arg Gly Lys Thr Phe Ile Leu Asn Leu Tyr His140 145 150Trp Pro Leu Pro Leu Trp Ile His Asp Pro Ile Ala Val Arg Lys155 160 165Leu Gly Pro Asp Arg Ala Pro Ala Gly Trp Leu Asp Glu Lys Thr170 175 180Val Val Glu Phe Val Lys Phe Ala Ala Phe Val Ala Tyr His Leu185 190 195Asp Asp Leu Val Asp Met Trp Ser Thr Met Asn Glu Pro Asn Val200 205 210Val Tyr Asn Gln Gly Tyr Ile Asn Leu Arg Ser Gly Phe Pro Pro215 220 225Gly Tyr Leu Ser Phe Glu Ala Ala Glu Lys Ala Lys Phe Asn Leu230 235 240Ile Gln Ala His Ile Gly Ala Tyr Asp Ala Ile Lys Glu Tyr Ser245 250 255Glu Lys Ser Val Gly Val Ile Tyr Ala Phe Ala Trp His Asp Pro260 265 270Leu Ala Glu Glu Tyr Lys Asp Glu Val Glu Glu Ile Arg Lys Lys275 280 285Asp Tyr Glu Phe Val Thr Ile Leu His Ser Lys Gly Lys Leu Asp290 295 300Trp Ile Gly Val Asn Tyr Tyr Ser Arg Leu Val Tyr Gly Ala Lys305 310 315Asp Gly His Leu Val Pro Leu Pro Gly Tyr Gly Phe Met Ser Glu320 325 330Arg Gly Gly Phe Ala Lys Ser Gly Arg Pro Ala Ser Asp Phe Gly335 340 345Trp Glu Met Tyr Pro Glu Gly Leu Glu Asn Leu Leu Lys Tyr Leu350 355 360Asn Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Met Ile lle Thr Glu Asn Gly Met
365 370 375Ala Asp Ala Ala Asp Arg Tyr Arg Pro His Tyr Leu Val Ser His380 385 390Leu Lys Ala Val Tyr Asn Ala Met Lys Glu Gly Ala Asp Val Arg395 400 405Gly Tyr Leu His Trp Ser Leu Thr Asp Asn Tyr Glu Trp Ala Gln410 415 420Gly Phe Arg Met Arg Phe Gly Leu Val Tyr Val Asp Phe Glu Thr425 430 435Lys Lys Arg Tyr Leu Arg Pro Ser Ala Leu Val Phe Arg Glu Ile440 445 450Ala Thr Gln Lys Glu Ile Pro Glu Glu Leu Ala His Leu Ala Asp455 460 465Leu Lys Phe Val Thr Lys Lys Val Ala Ile Ser Phe Phe Leu Cys470 475 480Phe Leu Thr His Ile Phe Gly Lys Ile Arg Ser485 490SEQ ID NO2長(zhǎng)度1476類型核酸鏈型雙鏈形態(tài)線性分子類型基因組DNA序列描述SEQ I D NO2ATGAAGTTCC CAAAAAACTT CATGTTTGGA TATTCTTGGT CTGGTTTCCA GTTTGAGATG 60GGACTGCCAG GAAGTGAAGT GGAAAGCGAC TGGTGGGTGT GGGTTCACGA CAAGGAGAAC 120ATAGCATCAG GTCTAGTAAG TGGAGATCTA CCAGAGAACG GCCCAGCATA TTGGCACCTC 180TATAAGCAAG ATCATGACAT TGCAGAAAAG CTAGGAATGG ATTGTATTAG AGGTGGCATT 240GAGTGGGCAA GAATTTTTCC AAAGCCAACA TTTGACGTTA AAGTTGATGT GGAAAAGGAT 300GAAGAAGGCA ACATAATTTC CGTAGACGTT CCAGAGAGTA CAATAAAAGA GCTAGAGAAA 360ATTGCCAACA TGGAGGCCCT TGAACATTAT CGCAAGATTT ACTCAGACTG GAAGGAGAGG 420GGCAAAACCT TCATATTAAA CCTCTACCAC TGGCCTCTTC CATTATGGAT TCATGACCCA 480ATTGCAGTAA GGAAACTTGG CCCGGATAGG GCTCCTGCAG GATGGTTAGA TGAGAAGACA 540GTGGTAGAGT TTGTGAAGTT TGCCGCCTTC GTTGCTTATC ACCTTGATGA CCTCGTTGAC 600ATGTGGAGCA CAATGAACGA ACCAAACGTA GTCTACAATC AAGGTTACAT TAATCTACGT 860TCAGGATTTC CACCAGGATA TCTAAGCTTT GAAGCAGCAG AAAAGGCAAA ATTCAACTTA 720ATTCAGGCTC ACATCGGAGC ATATGATGCC ATAAAAGAGT ATTCAGAAAA ATCCGTGGGA 780GTGATATACG CCTTTGCTTG GCACGATCCT CTAGCGGAGG AGTATAAGGA TGAAGTAGAG 840GAAATCAGAA AGAAAGACTA TGAGTTTGTA ACAATTCTAC ACTCAAAAGG AAAGCTAGAC 900TGGATCGGCG TAAACTACTA CTCCAGGCTG GTATATGGAG CCAAAGATGG ACACCTAGTT 980CCTTTACCTG GATATGGATT TATGAGTGAG AGAGGAGGAT TTGCAAAGTC AGGAAGACCT1020GCTAGTGACT TTGGATGGGA AATGTACCCA GAGGGCCTTG AGAACCTTCT TAAGTATTTA1080AACAATGCCT ACGAGCTACC AATGATAATT ACAGAGAACG GTATGGCCGA TGCAGCAGAT1140AGATACAGGC CACACTATCT CGTAAGCCAT CTAAAGGCAG TTTACAATGC TATGAAAGAA1200GGTGCTGATG TTAGAGGGTA TCTCCACTGG TCTCTAACAG ACAACTACGA ATGGGCCCAA1260GGGTTCAGGA TGAGATTTGG ATTGGTTTAC GTGGATTTCG AGACAAAGAA GAGATATTTA1320AGGCCAAGCG CCCTGGTATT CAGAGAAATA GCCACTCAAA AAGAAATTCC AGAAGAATTA1380GCTCACCTCG CAGACCTCAA ATTTGTTACC AAGAAAGTAG CCATTTCATT TTTTCTTTGT1440TTTTTAACTC ATATTTTTGG GAAAATAAGA TCATAA 1476SEQ ID NO3長(zhǎng)度510類型氨基酸鏈型單鏈形態(tài)線性分子類型肽序列描述SEQ ID N03Met Phe Pro Glu Lys Phe Leu Trp Gly Val Ala Gln Ser Gly Phe1 5 10 15Gln Phe Glu Met Gly Asp Lys Leu Arg Arg Asn Ile Asp Thr Asn20 25 30Thr Asp Trp Trp His Trp Val Arg Asp Lys Thr Asn Ile Glu Lys35 40 45Gly Leu Val Ser Gly Asp Leu Pro Glu Glu Gly Ile Asn Asn Tyr50 55 60Glu Leu Tyr Glu Lys Asp His Glu Ile Ala Arg Lys Leu Gly Leu65 70 75Asn Ala Tyr Arg Ile Gly Ile Glu Trp Ser Arg Ile Phe Pro Trp80 85 90Pro Thr Thr Phe Ile Asp Val Asp Tyr Ser Tyr Asn Glu Ser Tyr95 100 105Asn Leu Ile Glu Asp Val Lys Ile Thr Lys Asp Thr Leu Glu Glu110 115 120Leu Asp Glu Ile Ala Asn Lys Arg Glu Val Ala Tyr Tyr Arg Ser125 130 135Val Ile Asn Ser Leu Arg Ser Lys Gly Phe Lys Val Ile Val Asn140 145 150Leu Asn His Phe Thr Leu Pro Tyr Trp Leu His Asp Pro Ile Glu155 160 165Ala Arg Glu Arg Ala Leu Thr Asn Lys Arg Asn Gly Trp Val Asn170 175 180Pro Arg Thr Val Ile Glu Phe Ala Lys Tyr Ala Ala Tyr Ile Ala185 190 195Tyr Lys Phe Gly Asp Ile Val Asp Met Trp Ser Thr Phe Asn Glu200 205 210Pro Met Val Val Val Glu Leu Gly Tyr Leu Ala Pro Tyr Ser Gly
215 220 225Phe Pro Pro Gly Val Leu Asn Pro Glu Ala Ala Lys Leu Ala Ile230 235 240Leu His Met Ile Asn Ala His Ala Leu Ala Tyr Arg Gln Ile Lys245 250 255Lys Phe Asp Thr Glu Lys Ala Asp Lys Asp Ser Lys Glu Pro Ala260 265 270Glu Val Gly Ile Ile Tyr Asn Asn Ile Gly Val Ala Tyr Pro Lys275 280 285Asp Pro Asn Asp Ser Lys Asp Val Lys Ala Ala Glu Asn Asp Asn290 295 300Phe Phe His Ser Gly Leu Phe Phe Glu Ala Ile His Lys Gly Lys305 310 315Leu Asn Ile Glu Phe Asp Gly Glu Thr Phe Ile Asp Ala Pro Tyr320 325 330Leu Lys Gly Asn Asp Trp Ile Gly Val Asn Tyr Tyr Thr Arg Glu335 340 345Val Val Thr Tyr Gln Glu Pro Met Phe Pro Ser Ile Pro Leu Ile350 355 360Thr Phe Lys Gly Val Gln Gly Tyr Gly Tyr Ala Cys Arg Pro Gly365 370 375Thr Leu Ser Lys Asp Asp Arg Pro Val Ser Asp Ile Gly Trp Glu380 385 390Leu Tyr Pro Glu Gly Met Tyr Asp Ser Ile Val Glu Ala His Lys395 400 405Tyr Gly Val Pro Val Tyr Val Thr Glu Asn Gly Ile Ala Asp Ser410 415 420Lys Asp Ile Leu Arg Pro Tyr Tyr Ile Ala Ser His Ile Lys Met425 430 435Ile Glu Lys Ala Phe Glu Asp Gly Tyr Glu Val Lys Gly Tyr Phe440 445 450His Trp Ala Leu Thr Asp Asn Phe Glu Trp Ala Leu Gly Phe Arg455 460 465Met Arg Phe Gly Leu Tyr G1u Val Asn Leu Ile Thr Lys Glu Arg470 475 480Ile Pro Arg Glu Lys Ser Val Ser Ile Phe Arg Glu Ile Val Ala485 490 495Asn Asn Gly Val Thr Lys Lys Ile Glu Glu Glu Leu Leu Arg Gly500 505 510SEQ ID NO4長(zhǎng)度491類型氨基酸鏈型單鏈形態(tài)線性分子類型肽序列描述SEQ ID N04Met Leu Ser Phe Pro Lys Gly Phe Lys Phe Gly Trp Ser Gln Ser1 5 10 15Gly Phe Gln Ser Glu Met Gly Thr Pro Gly Ser Glu Asp Pro Asn20 25 30Ser Asp Trp His Val Trp Val His Asp Arg Glu Asn Ile Val Ser35 40 45Gln Val Val Ser Gly Asp Leu Pro Glu Asn Gly Pro Gly Tyr Trp50 55 60Gly Asn Tyr Lys Arg Phe His Asp Glu Ala Glu Lys Ile Gly Leu65 70 75Asn Ala Val Arg Ile Asn Val Glu Trp Ser Arg Ile Phe Pro Arg
80 85 90Pro Leu Pro Lys Pro Glu Met Gln Thr Gly Thr Asp Lys Glu Asn95 100 105Ser Pro Val Ile Ser Val Asp Leu Asn Glu Ser Lys Leu Arg Glu110 115 120Met Asp Asn Tyr Ala Asn His Glu Ala Leu Ser His Tyr Arg His125 130 135Ile Leu Glu Asp Leu Arg Asn Arg Gly Phe His Ile Val Leu Asn140 145 150Met Tyr His Trp Thr Leu Pro Ile Trp Leu His Asp Pro Ile Arg155 160 165Val Arg Arg Gly Asp Phe Thr Gly Pro Thr Gly Trp Leu Asn Ser170 175 180Arg Thr Val Tyr Glu Phe Ala Arg Phe Ser Ala Tyr Val Ala Trp185 190 195Lys Leu Asp Asp Leu Ala Ser Glu Tyr Ala Thr Met Asn Glu Pro200 205 210Asn Val Val Trp Gly Ala Gly Tyr Ala Phe Pro Arg Ala Gly Phe215 220 225Pro Pro Asn Tyr Leu Ser Phe Arg Leu Ser Glu Ile Ala Lys Trp230 235 240Asn Ile Ile Gln Ala His Ala Arg Ala Tyr Asp Ala Ile Lys Ser245 250 255Val Ser Lys Lys Ser Val Gly Ile Ile Tyr Ala Asn Thr Ser Tyr260 265 270Tyr Pro Leu Arg Pro Gln Asp Asn Glu Ala Val Glu Ile Ala Glu275 280 285Arg Leu Asn Arg Trp Ser Phe Phe Asp Ser Ile Ile Lys Gly Glu290 295 300Ile Thr Ser Glu Gly Gln Asn Val Arg Glu Asp Leu Arg Asn Arg305 310 315Leu Asp Trp Ile Gly Val Asn Tyr Tyr Thr Arg Thr Val Val Thr320 325 330Lys Ala Glu Ser Gly Tyr Leu Thr Leu Pro Gly Tyr Gly Asp Arg335 340 345Cys Glu Arg Asn Ser Leu Ser Leu Ala Asn Leu Pro Thr Ser Asp350 355 360Phe Gly Trp Glu Phe Phe Pro Glu Gly Leu Tyr Asp Val Leu Leu365 370 375Lys Tyr Trp Asn Arg Tyr Gly Leu Pro Leu Tyr Val Met Glu Asn380 385 390Gly Ile Ala Asp Asp Ala Asp Tyr Gln Arg Pro Tyr Tyr Leu Val395 400 405Ser His Ile Tyr Gln Val His Arg Ala Leu Asn Glu Gly Val Asp410 415 420Val Arg Gly Tyr Leu His Trp Ser Leu Ala Asp Asn Tyr Glu Trp425 430 435Ser Ser Gly Phe Ser Met Arg Phe Gly Leu Leu Lys Val Asp Tyr440 445 450Leu Thr Lys Arg Leu Tyr Trp Arg Pro Ser Ala Leu Val Tyr Arg455 460 465Glu Ile Thr Arg Ser Asn Gly Ile Pro Glu Glu Leu Glu His Leu470 475 480Asn Arg Val Pro Pro Ile Lys Pro Leu Arg His485 490SEQ ID NO5長(zhǎng)度489類型氨基酸鏈型單鏈形態(tài)線性分子類型肽序列描述SEQ ID N05Met Tyr Ser Phe Pro Asn Ser Phe Arg Phe Gly Trp Ser Gln Ala1 5 10 15Gly Phe Gln Ser Glu Met Gly Thr Pro Gly Ser Glu Asp Pro Asn20 25 30Thr Asp Trp Tyr Lys Trp Val His Asp Pro Glu Asn Met Ala Ala35 40 45Gly Leu Val Ser Gly Asp Leu Pro Glu Asn Gly Pro Gly Tyr Trp50 55 60Gly Asn Tyr Lys Thr Phe His Asp Asn Ala Gln Lys Met Gly Leu65 70 75Lys Ile Ala Arg Leu Asn Val Glu Trp Ser Arg Ile Phe Pro Asn80 85 90Pro Leu Pro Arg Pro Gln Asn Phe Asp Glu Ser Lys Gln Asp Val95 100 105Thr Glu Val Glu Ile Asn Glu Asn Glu Leu Lys Arg Leu Asp Glu110 115 120Tyr Ala Asn Lys Asp Ala Leu Asn His Tyr Arg Glu Ile Phe Lys125 130 135Asp Leu Lys Ser Arg Gly Leu Tyr Phe Ile Leu Asn Met Tyr His140 145 150Trp Pro Leu Pro Leu Trp Leu His Asp Pro Ile Arg Val Arg Arg155 160 165Gly Asp Phe Thr Gly Pro Ser Gly Trp Leu Ser Thr Arg Thr Val170 175 180Tyr Glu Phe Ala Arg Phe Ser Ala Tyr Ile Ala Trp Lys Phe Asp185 190 195Asp Leu Val Asp Glu Tyr Ser Thr Met Asn Glu Pro Asn Val Val200 205 210Gly Gly Leu Gly Tyr Val Gly Val Lys Ser Gly Phe Pro Pro Gly215 220 225Tyr Leu Ser Phe Glu Leu Ser Arg Arg His Met Tyr Asn Ile Ile230 235 240Gln Ala His Ala Arg Ala Tyr Asp Gly Ile Lys Ser Val Ser Lys245 250 255Lys Pro Val Gly Ile Ile Tyr Ala Asn Ser Ser Phe Gln Pro Leu260 265 270Thr Asp Lys Asp Met Glu Ala Val Glu Met Ala Glu Asn Asp Asn275 280 285Arg Trp Trp Phe Phe Asp Ala Ile Ile Arg Gly Glu Ile Thr Arg290 295 300Gly Asn Glu Lys Ile Val Arg Asp Asp Leu Lys Gly Arg Leu Asp305 310 315Trp Ile Gly Val Asn Tyr Tyr Thr Arg Thr Val Val Lys Arg Thr320 325 330Glu Lys Gly Tyr Val Ser Leu Gly Gly Tyr Gly His Gly Cys Glu335 340 345Arg Asn Ser Val Ser Leu Ala Gly Leu Pro Thr Ser Asp Phe Gly350 355 360Trp Glu Phe Phe Pro Glu Gly Leu Tyr Asp Val Leu Thr Lys Tyr365 370 375Trp Asn Arg Tyr His Leu Tyr Met Tyr Val Thr Glu Asn Gly Ile380 385 390Ala Asp Asp Ala Asp Tyr Gln Arg Pro Tyr Tyr Leu Val Ser His
395 400 405Val Tyr Gln Val His Arg Ala Ile Asn Ser Gly Ala Asp Val Arg410 415 420Gly Tyr Leu His Trp Ser Leu Ala Asp Asn Tyr Glu Trp Ala Ser425 430 435Gly Phe Ser Met Arg Phe Gly Leu Leu Lys Val Asp Tyr Asn Thr440 445 450Lys Arg Leu Tyr Trp Arg Pro Ser Ala Leu Val Tyr Arg Glu Ile455 460 465Ala Thr Asn Gly Ala Ile Thr Asp Glu Ile Glu His Leu Asn Ser470 475 480Val Pro Pro Val Lys Pro Leu Arg His485SEQ ID NO6長(zhǎng)度12類型氨基酸鏈型單鏈形態(tài)線性分子類型肽序列描述SEQ ID NO6Asp Trp Ile Gly Val Asn Tyr Tyr Ser Arg Leu Val1 5 10SEQ ID NO7長(zhǎng)度13類型氨基酸鏈型單鏈形態(tài)線性分子類型肽序列描述SEQ ID NO7Pro Ala Ser Asp Phe Gly Trp Glu Met Tyr Pro Glu Gly1 5 10SEQ ID NO8長(zhǎng)度23類型氨基酸鏈型單鏈形態(tài)線性分子類型肽序列描述SEQ ID NO8Gly Tyr Leu His Trp Ser Leu Thr Asp Asn Tyr Glu Trp Ala Gln1 5 10 15Gly Phe Arg Met Arg Phe Gly Leu20
權(quán)利要求
1.源自Pyrococcus furiosus的分離的耐SDS高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶基因。
2.權(quán)利要求1的高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶基因，其編碼具有高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶活性的具有如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列或其部分的片段。
3.權(quán)利要求1的高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶基因，其具有如SEQ ID NO2所示的核基酸序列。
4.一種耐SDS高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶基因，其可與權(quán)利要求2的基因雜交。
5.一種高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶基因的克隆方法，其包括用權(quán)利要求2—4中任一項(xiàng)的基因或其部分作為探針或引物。
6.一種高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶的生產(chǎn)方法，其包括培養(yǎng)一種轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子中已導(dǎo)入了含權(quán)利要求1的高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶基因的重組質(zhì)粒，并從培養(yǎng)物中收獲高熱穩(wěn)定性β—半乳糖苷酶。
全文摘要
一種源自Pyrococcus furiosus的分離的耐SDS高熱穩(wěn)定性β-半乳糖苷酶基因。其實(shí)例包括分別示于SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的基因和可與示于SEQ ID NO1中的上述基因雜交的基因。一種克隆高熱穩(wěn)定性β-半乳糖苷酶基因的方法，其中用上述一種基因或其部分作為探針或引物。一種通過(guò)培養(yǎng)已轉(zhuǎn)入了含上述一種基因的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子來(lái)生產(chǎn)高熱穩(wěn)定性β-半乳糖苷酶的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1128799SQ9510717
公開日1996年8月14日 申請(qǐng)日期1995年6月13日 優(yōu)先權(quán)日1994年6月14日
發(fā)明者島田敦, 大館美紀(jì), 小山信人, 橋野仁一, 淺田起代藏, 加藤郁之進(jìn) 申請(qǐng)人:寶酒造株式會(huì)社