專利名稱：人類半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶Ⅰ型同源蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的多核苷酸，由該多核苷酸編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)。更具體地說，本發(fā)明的多肽是人體中天然存在的半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶家族的一個(gè)新成員，尤其是本發(fā)明的多肽被推斷鑒定為β1，4-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶同系物。本發(fā)明還涉及抑制這些多肽的作用。
生物體中的多糖鏈、糖蛋白和糖脂上的寡糖鏈的合成都由各種專一的糖基轉(zhuǎn)移酶完成的。糖基轉(zhuǎn)移酶類是具有眾多成員的一個(gè)大家族，轉(zhuǎn)移不同的糖基有特異性不同的轉(zhuǎn)移酶。即使轉(zhuǎn)移相同的糖基，由于糖基的受體不同、形成的糖苷鍵不同，也由不同的酶催化。半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶類就是如此它們都以UDP-半乳糖苷為糖基供體，但由于合成的二糖鍵不同而存在著諸如α1，6-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶、α1，3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶等等數(shù)十種不同的酶。在這之中，β1，4-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶(以下簡(jiǎn)稱β1，4GT)是被研究最多的酶之一。它一般負(fù)責(zé)合成最常見的二糖鍵N-乙?；樘前穂Gal(β1-4)GlcNAc]。在哺乳期的哺乳動(dòng)物乳腺中，它會(huì)與α-乳清蛋白結(jié)合，變成“乳糖合成酶”，專一性地催化半乳糖基轉(zhuǎn)移到D-半乳糖上，從而合成乳汁中富含的乳糖。
在生物體各組織的細(xì)胞中，β1，4GT主要以兩種形式廣泛存在①整合于高爾基體膜上，②整合于細(xì)胞質(zhì)膜上。近年來隨著牛、鼠和人的β1，4GT基因的相繼克隆，推進(jìn)了對(duì)其重要生物學(xué)功能的深入研究，目前的研究結(jié)果表明β1，4GT，尤其是整合于細(xì)胞質(zhì)膜上的β1，4GT，與精子的受精作用、神經(jīng)元細(xì)胞的遷移、癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、表皮細(xì)胞的增殖及自體免疫性疾病等諸多方面都有著密切的關(guān)系。
1986年，John Hopkins大學(xué)的Shaper用免疫掃描法率先從λgt11表達(dá)庫中克隆到一個(gè)牛β1，4GT的編碼序列，Northern結(jié)果顯示其mRNA長(zhǎng)4.8kb(Shaper NL et al.Proc Natl Acad Sci.USA.1986；831573)。日本的Narimatsu則于同年首先成功地測(cè)定了它的cDNA全長(zhǎng)(Narimatsu H et al.Proc Natl Acad Sci.USA.1986；834720)。1988年，Shaper又克隆了鼠的β1，4GT的cDNA全長(zhǎng)，并發(fā)現(xiàn)其5′端有兩個(gè)翻譯起始位點(diǎn)(Shaper NL et al.J Biol Chem.1988；26310420)。1988年，Masri等用根據(jù)β1，4GT C端氨基酸順序設(shè)計(jì)的DNA探針獲得了人類第一個(gè)β1，4GT編碼序列的全長(zhǎng)(MasriKA et al.Biochem Biophys Res Commun.1988；157657663)；該基因的全長(zhǎng)cDNA和基因組順序分析于1991年和1995年由Mengle-Gaw和Chatteriee等相繼完成(Mengle-Gaw L et al.Biochem Biophys ResCommun.1991；151269；Chatteriee SK et al.Int J Biochem Cell Biol.1995；27329)。1997年，丹麥的Almeida等克隆并表達(dá)了兩個(gè)人類的β1，4GT家族新成員[7]。然而在本發(fā)明之前，沒有公開過本申請(qǐng)中涉及的人半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶I型同源蛋白。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶家族的一個(gè)新成員，本發(fā)明的半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶同系物命名為hGTH6(GenBank Accession No.AF069054)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種新的半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶家族成員，命名為hGTH6。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶家族成員的方法。
本發(fā)明還涉及這種多肽的各種應(yīng)用。
本發(fā)明涉及一種新的多核苷酸，由該多核苷酸編碼的多肽，以及利用所述多核苷酸生產(chǎn)所述多肽的方法。更具體地說，本發(fā)明的多肽是半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶家族的一個(gè)新成員，尤其是本方面的多肽被推斷鑒定為人β-1，4-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶的同系物。這一鑒定是根據(jù)與所有已知的本發(fā)明的半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶同系物命名為hGTH6(GenBankAccession No.AF069054)。編碼本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA形式和DNA形式，DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA，DNA可以是雙鏈或單鏈，如果是單鏈，可以是編碼鏈或非編碼鏈。
在本發(fā)明中，術(shù)語“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒有分離的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存的其他物質(zhì)中分開，則為分離的。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸全長(zhǎng)為2147個(gè)核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO1，其中開放讀框位于146-1177位核苷酸。該多核苷酸是如此獲得的，以人白血球λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，合成正向引物5’-TCAATGTGGGCTTCAAAGAGGCC-3’和反向引物5’-CAAAGGTCATCATCTTCTCCTCC-3’，進(jìn)行PCR，獲得271bp的目的片段。然后標(biāo)記該片段，以該標(biāo)記片段為探針與擴(kuò)增后的人白血球λgt11cDNA文庫雜交，挑取陽性克隆，經(jīng)同樣的探針及篩選過程對(duì)得到的陽性克隆進(jìn)行復(fù)篩后，最終得到若干陽性單克隆。鑒定測(cè)序后得到SEQ ID NO1的全長(zhǎng)cDNA序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的多核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重組的hGTH6蛋白或多肽。一般來說有以下步驟用本發(fā)明的編碼hGTH6的DNA片段(或變異體)或含有該DNA片段的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞；在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的多核苷酸序列的表達(dá)載體及用所述的表達(dá)載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是含有適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和翻譯控制元件。多種表達(dá)載體可從商業(yè)途徑得到。常用的載體包括(但不限于)質(zhì)粒，噬菌體，粘粒，酵母表達(dá)載體，病毒，Ti質(zhì)粒等，但最常用的載體首選質(zhì)粒。常用的宿主細(xì)胞包括(但不限于)細(xì)菌，酵母，昆蟲細(xì)胞，動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞等，但最常用的宿主細(xì)胞為細(xì)菌，尤其是大腸桿菌。另一個(gè)較常用的表達(dá)系統(tǒng)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，如Hela，COS細(xì)胞系或CHO細(xì)胞系等。
可用本領(lǐng)域中熟練人員已知的方法構(gòu)建含hGTH6編碼序列的重組表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)，DNA合成技術(shù)，體內(nèi)重組技術(shù)等(J Sambrook等1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè))。
本發(fā)明還涉及針對(duì)本發(fā)明的多肽的抗體，有多種方法可用于生產(chǎn)針對(duì)hGTH6抗原決定簇的抗體。這些抗體包括(但不限于)多克隆抗體，單克隆抗體，嵌合抗體，單鏈抗體，F(xiàn)ab片段和Fab表達(dá)文庫產(chǎn)生的片段。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用hGTH6蛋白或多肽免疫動(dòng)物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
hGTH6單克隆抗體可用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)(Kohler and Milstein.Nature，1975，256495-497)。將人恒定區(qū)和非人源的可變區(qū)結(jié)合的嵌合抗體可用已有的技術(shù)生產(chǎn)(Morrison等，PNAS，1985，816851)。而已有的生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(U.S.Pat No.4946778)也可用于生產(chǎn)抗hGTH6的單鏈抗體。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明的多核苷酸和多肽可用于hGTH6相關(guān)疾病的診斷和治療。已知β1，4GT參與受精過程中的頂體反應(yīng)，該酶的失常會(huì)導(dǎo)致不孕癥，而β1，4GT是半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶家族的一個(gè)成員，該家族包括其他許多不同的成員，不同的物種及個(gè)體亦有不同的成員。本發(fā)明的β1，4GT同系物是該家族的新成員。因此本發(fā)明分離到的hGTH6的cDNA可以特異地用于檢測(cè)與本發(fā)明的β1，4GT同系物的失活導(dǎo)致的不孕癥，并且可能為將來這一類的不孕癥的治療提供一種途徑。另一方面，針對(duì)本發(fā)明的多肽的抗體也可以用作避孕藥。
另外，近來研究表明癌細(xì)胞表面的β1，4GT酶活增加使得細(xì)胞易于遷移，提示該酶與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此本發(fā)明分離到的hGTH6的cDNA可以特異地用于檢測(cè)與本發(fā)明的β1，4GT同系物表達(dá)異?；蛎富钐岣邔?dǎo)致的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。另一方面，本發(fā)明的多肽抗體可以與該多肽結(jié)合使酶活降低，從而阻斷癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。
β1，4GT酶活降低可能引發(fā)人類的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自體免疫性疾病，因此本發(fā)明的cDNA及多肽為治療這類疾病提供了一條途徑。
表皮細(xì)胞表面的β1，4GT傳遞來自間質(zhì)的細(xì)胞增殖信號(hào)，提示β1，4GT與表皮細(xì)胞分化增殖密切相關(guān)，因此本發(fā)明的cDNA及多肽為治療與表皮細(xì)胞分化增殖相關(guān)的皮膚疾病以及延緩甚至消除皮膚皺縮、衰老等美容治療提供了一條途徑。
以下將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，但實(shí)施例僅是舉例性的，并非對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1 hGTH6的cDNA的克隆和測(cè)序1.引物擴(kuò)增以人白血球λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用寡核苷酸5’-TCAATGTGGGCTTCAAAGAGGCC-3’為正向引物，寡核苷酸5’-CAAAGGTCATCATCTTCTCCTCC-3’為反向引物，進(jìn)行PCR，PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、54℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測(cè)得到的271bp目的片段。2.探針及其標(biāo)記以上述PCR目的片段為探針，用α-32P-dATP(DuPont公司)對(duì)其進(jìn)行隨機(jī)引物標(biāo)記，條件為37℃1小時(shí)，具體操作見MegaprimeDNA標(biāo)記系統(tǒng)說明書(Amersham)。3.cDNA文庫擴(kuò)增及印跡標(biāo)記(篩選文庫)將人白血球λgt11cDNA文庫進(jìn)行擴(kuò)增，克隆數(shù)達(dá)50萬個(gè)，然后將擴(kuò)增好的cDNA文庫印跡到HybondTM-N+尼龍膜上(Amersham)，再將標(biāo)記好的探針變性后與印跡膜雜交，洗膜，放入帶增感屏的片夾，與FUJI MEDIAI X光膠片于-80℃下進(jìn)行放射自顯影，72小時(shí)后沖片。4.挑取克隆及初篩克隆的復(fù)篩通過上述雜交篩選獲得9個(gè)初篩陽性克隆，用上述相同的探針雜交和篩選過程對(duì)這9個(gè)陽性克隆進(jìn)行復(fù)篩，最終得到8個(gè)陽性單克隆。5.單克隆的鑒定和測(cè)序以上述步驟4中得到的單克隆噬菌體為模板，用上述步驟1的兩個(gè)正反引物分別與λgt11左右臂上的引物S1及S2(S15’-GTTCAACATCAGCCGCTACA-3’；S25’-CACCAGACCAACTTTTAATG-3’)進(jìn)行搭配擴(kuò)增，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以判斷每個(gè)克隆從探針出發(fā)向5’或3’步移(延伸)的長(zhǎng)度，從中選出向5’延伸最長(zhǎng)和向3’延伸最長(zhǎng)的克隆。將這兩個(gè)克隆S1、S2擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對(duì)插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對(duì)缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測(cè)序試劑盒(Epicentre Technologies)對(duì)依次截短的缺失子進(jìn)行測(cè)序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長(zhǎng)cDNA序列，共2147bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO1，其中開放讀框位于146-1177位核苷酸。
根據(jù)得到的cDNA序列推導(dǎo)出hGTH6的氨基酸序列，共343個(gè)氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO2。實(shí)施例2 hGTH6的表達(dá)譜分析和染色體定位多種組織Northern(MNTTM)印跡膜(16種組織)購自Clontech公司，人/嚙齒類體細(xì)胞雜種系Southern印跡膜(PstI)購自O(shè)ncor公司，以上實(shí)施例1步驟中的271bp克隆片段為探針，探針的標(biāo)記方法同實(shí)施例1步驟2，Northern雜交按用戶手冊(cè)操作。
16種組織的Northern雜交結(jié)果顯示hGTH6基因?yàn)閺V譜表達(dá)基因，在脾、胸腺、小腸、大腸、心臟、肺、肝、骨骼肌、腎、胰腺、前列腺11種組織中均有表達(dá)，表達(dá)量稍有差異，在腦、睪丸、卵巢、胎盤和外周血白細(xì)胞中為較高表達(dá)。根據(jù)Southern雜交結(jié)果可將該基因定位在18號(hào)染色體上。
實(shí)施例3人hGTH6在大腸桿菌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以人白血球λgt11cDNA文庫為模版，將編碼人hGTH6的cDNA序列用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人hGTH6 cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5’寡核苷酸引物序列為5’-TCAGGGATCCATGTCTGTGCTCAGGCGGA-3’，該引物含有BamHI限制性限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的人hGTH6編碼序列的19個(gè)核苷酸；3’端引物序列為5’-AAGGAAGCTTTTAATAGTCTTCGATTGGA-3’，該引物含有HindIII限制性限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和人hGTH6的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個(gè)細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個(gè)IPTG-可調(diào)啟動(dòng)子/操縱子(P/O)、一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個(gè)6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用BamHI和HindIII消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證人hGTH6的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至600光密度(OD600)為0.4-0.6時(shí)，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時(shí)，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人hGTH6。用6M鹽酸胍(PH5.0)從柱中洗脫人hGTH6?？捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白。或者，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化后的蛋白質(zhì)被結(jié)合到第二個(gè)柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時(shí)蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(PH0.5)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為約40KDa。
此外，用常規(guī)方法對(duì)達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與推測(cè)的蛋白序列一致。
實(shí)施例4人hGTH6在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，以以人白血球λgt11cDNA文庫模版，將編碼人hGTH6的cDNA序列用對(duì)應(yīng)于該DNA序列的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人hGTH6 cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5’寡核苷酸引物序列為5’-TCAGAAGCTT ATGTCTGTGCTCAGGCGGA--3’該引物含有HindIII限制性限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的人hGTH6編碼序列的19個(gè)核苷酸；3’端引物序列為
5’-AAGGGGATCC TTAATAGTCTTCGATTGGA-3’該引物含有BamHI限制性限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個(gè)翻譯終止子和人hGTH6的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個(gè)噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(fl ori)、一個(gè)病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個(gè)T7啟動(dòng)子、一個(gè)病毒啟動(dòng)子(P-CMV)、一個(gè)Sp6啟動(dòng)子、一個(gè)SV40啟動(dòng)子、一個(gè)SV40加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序、一個(gè)BGH加尾信號(hào)和相應(yīng)的polyA順序。
用BamHI和HindIII消化pcDNA3載體，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證人hGTH6的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin(GiBco Life)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測(cè)定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對(duì)混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時(shí)后，開始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(PH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(PH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(PH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(PH7.4)為透析液對(duì)表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為40KDa。
此外，用常規(guī)方法對(duì)達(dá)蛋白的N端和C端各10個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的氨基酸進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)與推測(cè)的蛋白序列序列一致。
根據(jù)上文教導(dǎo)，本發(fā)明可有各種改進(jìn)和變動(dòng)，因此，在所附權(quán)利要求范圍內(nèi)，本發(fā)明可以與具體所述不同的方式實(shí)施。
序列表(1) 一般信息(i)申請(qǐng)人復(fù)旦大學(xué)(ii) 發(fā)明名稱半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶I型同源蛋白(iii) 序列數(shù)2(iv) 聯(lián)系地址(A) 收信人永新專利商標(biāo)代理有限公司(B) 街道金融大街27號(hào)投資廣場(chǎng)A座10層(C) 城市北京市(D) 國(guó)家中國(guó)(E) 郵政編碼100032(vi) 本申請(qǐng)資料(A) 申請(qǐng)?zhí)?B) 申請(qǐng)日(C) 分類號(hào)(viii) 律師/代理人信息(A) 姓名林曉紅(B) 注冊(cè)號(hào)72002027(C) 卷號(hào)I98599CB(ix) 電訊信息(A) 電話8610-66211834(B) 傳真8610-66211845(2) SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度2147bp(B) 類型核酸(C) 鏈性單鏈(D) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(iii) 分子型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO11 CTCGGGCCCT CTCCCCAGAG CCTCCCCGCG CGGACCCCGC TGCAGTGTCG GGGTTCTCAG61 CACATTTATG GAAGTTTAGG GCCTGGACAG TGGCCCCGAG TCCGGCCTGA GAGCGCAGCC121 TGGGCTGCTG GCAGGGAAGA GGAAGATGTC TGTGCTCAGG CGGATGATGC GGGTTTCCAA181 TCGCTCTCTC CTCGCCTTCA TCTTCTTTTT CTCCCTCTCT TCGTCCTGTC TGTACTTCAT241 CTATGTGGCC CCAGGCATCG ATTATCCCGA AGGCAATAAT TCAAGTGATT ATCTTGTTCA301 AACAACAACG TATCTCCCGG AAAACTTCAC ATACTCACCA TACCTCCCCT GTCCAGAAAA361 GCTGCCTTAT ATGCGAGGAT TCCTCAATGT CAATGTAAGC GAAGTCAGTT TTGATGAAAT421 TCATCAACTC TTCTCCAAGG ATTTAGATAT TGAGCCAGGG GGTCATTGGA GGCCAAAAGA481 CTGTAAACCC AGATGGAAGG TGGCAGTTCT CATTCCTTTC CGTAATCGCC ATGAACATCT541 TCCAATTTTT TTCTTACATC TGATTCCAAT GCTCCAGAAG CAGCGGCTGG AATTTGCGTT601 TTATGTCGTT GAACAGACTG GCACACAACC TTTTAACCGT GCGATGCTTT TCAATGTGGG661 CTTCAAAGAG GCCATGAAAG ACAGTGTCTG GGACTGTGTA ATCTTCCACG ATGTGGATCA721 TCTACCTGAA AATGACCGGA ACTATTACGG ATGTGGAGAA ATGCCACGTC ATTTTGCTGC781 AAAGCTGGAT AAATACATGT ATATTCTTCC ATATAAAGAA TTTTTTGGTG GTGTAAGTGG841 GCTGACAGTG GAACAATTTA GAAAGATCAA TGGTTTTCCT AATGCCTTCT GGGGATGGGG901 AGGAGAAGAT GATGACCTTT GGAACAGAGT TCACTATGCT GGATATAATG TAACCAGACC961 AGAGGGAGAC TTAGGAAAAT ACAAGTCAAT TCCTCATCAC CATAGAGGTG AAGTCCAGTT1021 TTTAGGACGG TATAAATTAC TAAGGTATTC CAAGGAGCGT CAGTACATCG ATGGACTGAA1081 CAATTTAATA TATAGGCCAA AAATACTGGT TGATAGGTTG TATACAAACA TATCTGTAAA1141 CCTCATGCCA GAGTTAGCTC CAATCGAAGA CTATTAAAAG AAGTGGCTGT CGTGGCAAGG1201 TAGACCACAA TGCTGGATCA TAAACTTGGA GCGCGCTCTT AGTGGAGGTC AGTGATTGGC1261 TGTGTCACAG TGCCCTTTTC TCTGAGAAGA GCCAGCAGTC CACAGTGTTT ACAGAGTGGG1321 ACTATATACA GTCACCCTTC TCTCACCCCG TCCTCCCTGC TCTGAGACAC ACCCCTGTGG1381 CGAGCACCGC AGAAACGGGA AGCCACTACT TAAGATCGGA AGTTAAGAGA GCTCCCTCCG1441 AAGAGAAAAT TTTTATACTA AAATCTATAA TTTAATTCAA GAGAATGCTT TTATTTCCGT1501 TTAAACATAT TTTGTATATA TGTGATATAA ATTAATGTGT GCAAATTGTT TAAAAATTAG1561 ATGTGTTGCA GTTTTGCATG TAATCGGTTA TACCTTTATT GGACTTTTAT AGACATTTTT1621 TATTTGCATG AAAAAAACTC ACTAAATTTA CATCACTAAA CAAAGGTTAA CCCTTGTGTG1681 AAATGAAGGA ACTGTCAATA ATTGACAGCC AACTAATACA GTAAACTGTT ATACTAGTTT1741 TGAGCTTTAG ACCTCAGCCT TTTGTGTGGA AGAAGTCACA GCTTTCTTAG GCTTTAAAGG1801 AAAAGAAGGA AGGACTTAAA TAGCTTTTCT TCCTACCGGG ATTACCTATG TTTTTCCTTG1861 CTTGCAATCT CATCTGATTT TGCTAGAAAT CACAACCATA TTGTTTATGC ATATTGCATG1921 AGTATTACCA AGAAAAATCT TTAAAAGTTG TGATGTGACA TGATATAAAG GATCTCTTTA1981 TGTTAAATGT CTTTCCATGT ACCTCTGGTG TGTCAGGGAT TTTGTGCCTC AAAAAATGTT2041 TCCAAGGTTG TGTGTTTATA CTGTGTATTT TTTTTAAATT CACGGTGAAC AGCACTTTTA2101 TTATTTCCAG TTCAGAAGAG CCAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA(2) SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A) 長(zhǎng)度343個(gè)氨基酸(B) 類型氨基酸(C) 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(iii) 分子型多肽(x)序列描述SEQ ID NO21 MSVLRRMMRVSNRSLLAFIFFFSLSSSCLYFIYVAPGIDYPEGNNSSDYLVQTTTYLPEN61 FTYSPYLPCPEKLPYMRGFLNVNVSEVSFDEIHQLFSKDLDIEPGGHWRPKDCKPRWKVA121 VLIPFRNRHEHLPIFFLHLIPMLQKQRLEFAFYVVEQTGTQPFNRAMLFNVGFKEAMKDS181 VWDCVIFHDVDHLPENDRNYYGCGEMPRHFAAKLDKYMYILPYKEFFGGVSGLTVEQFRK241 INGFPNAFWGWGGEDDDLWNRVHYAGYNVTRPEGDLGKYKSIPHHHRGEVQFLGRYKLLR301 YSKERQYIDGLNNLIYRPKILVDRLYTNISVNLMPELAPIEDY
權(quán)利要求
1.一種分離出的多核苷酸，其編碼具有SEQ ID NO2的推導(dǎo)的氨基酸序列的多肽或者所述多肽的片段、類似物或衍生物，所述的片段、類似物或衍生物具有與全長(zhǎng)多肽相同的生物學(xué)功能。
2.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中該多核苷酸是DNA。
3.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中該多核苷酸是RNA。
4.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中該多核苷酸是基因組DNA。
5.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其編碼具有SEQ ID NO2的推導(dǎo)的氨基酸序列的多肽。
6.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其具有SEQ ID NO1所示的編碼序列。
7.含有權(quán)利要求2所述的多核苷酸的載體。
8.一種宿主細(xì)胞，其用權(quán)利要求7的載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)。
9.如權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求9所述的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
11.如權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞為COS-7、CHO、Hela細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞為酵母細(xì)胞。
14.生產(chǎn)多肽的方法，包括在合適的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求8-13的宿主細(xì)胞，使之表達(dá)所述的多肽。
15.一種多肽，所述的多肽是具有SEQ ID NO2的推導(dǎo)的氨基酸序列的多肽或所述多肽的片段、類似物或衍生物，所述的片段、類似物或衍生物具有與全長(zhǎng)多肽相同的生物學(xué)功能。
16.如權(quán)利要求15所述的多肽，所述的多肽具有SEQ ID NO2的推導(dǎo)的氨基酸序列。
17.抗權(quán)利要求15或16所述多肽的抗體。
18.權(quán)利要求15所述的多肽在制備診斷和治療與所述多肽的異常相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的多核苷酸,由該多核苷酸編碼的多肽,以及利用所述多核苷酸生產(chǎn)多肽的方法。更具體的說,本發(fā)明的多肽是人人半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶Ⅰ型同源蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1257925SQ9812569
公開日2000年6月28日 申請(qǐng)日期1998年12月21日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月21日
發(fā)明者余龍, 范玉新, 趙勇, 張宏來, 傅強(qiáng) 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)