一種基于擁有β-半乳糖苷酶的細菌檢測生物毒性的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物毒性檢測領域，尤其是涉及利用擁有3 -半乳糖苷酶的細菌來檢 測生物毒性的方法。
【背景技術】
[0002] 隨著環(huán)境污染問題的日漸突出，生物毒性的檢測，尤其是生物毒性的快速檢測，其 重要性愈發(fā)凸顯。傳統(tǒng)上是使用魚和水蚤來檢測生物毒性，但它往往存在響應慢、耗時長、 費用高等問題。而微生物繁殖速度快、價格低廉，是檢測生物毒性的理想材料。
[0003] MicrotoxR是目前生物毒性檢測領域最成熟的產(chǎn)品，它是利用費希爾弧菌 (Vibriofischeri)。該菌是一種來自海洋中的發(fā)光細菌，稀有少見，價格昂貴，在正常代謝 時會發(fā)出可見熒光；當有毒物質存在時，該菌的正常新陳代謝會受到抑制，它的可見熒光強 度會有所降低，從而根據(jù)它的可見熒光強度可以判斷出有毒物質對該菌的毒害程度，達到 生物毒性檢測的目的。然已經(jīng)發(fā)展得很成熟，其對淡水樣品的檢測存在一定 的限制。這是由于費希爾弧菌生存于海洋中，在淡水中幾乎不存在，且不能在淡水中生存。 因此Microtox在檢測淡水樣品時都不是在真實的淡水環(huán)境下進行的，而是在3%鹽分的溶 液中，這樣就和真實的淡水環(huán)境存在偏差。一般而言，發(fā)光細菌都是生存在海洋中，在淡水 中的極為少見，這就限制了發(fā)光細菌在檢測生物毒性方面的應用。且在實際檢測中遇到的 污水樣品往往存在一定的濁度，濁度的存在會對熒光的觀察存在干擾，從而影響到檢測的 精度和使用范圍。
[0004] Toxi-Chromo加拿大ebpi公司開發(fā)的一款生物毒性檢測裝置；其原理是 利用經(jīng)誘導的大腸桿菌（E.Coli)能產(chǎn)生P-半乳糖苷酶，該酶能將ONPG、X-gal等乳糖類 似物水解，生成有顏色的物質；當有毒物質存在時，3 _半乳糖苷酶的活性就會受到抑制， 從而被水解的乳糖類似物的量就會減少，顏色變淺；根據(jù)顏色的深淺即可判斷出有毒物質 對大腸桿菌的毒害程度。Toxi-ChromotestR利用的是經(jīng)過誘導的能產(chǎn)生(6-半乳糖苷酶的 大腸桿菌，誘導過程較為繁瑣。
[0005] 因此，需要一種快速、簡便、使用范圍廣泛的檢測生物毒性的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種基于擁有(6-半乳糖苷酶的細菌檢測生物 毒性的方法；通過將細菌菌液和待測物質混合，得到混合液；向混合液中加入〇NPG(2-硝基 苯-3 -D-半乳糖苷)，得到混合反應液；向混合反應液中加入碳酸鈉，得到最終液；測試最 終液的吸光度，根據(jù)吸光度來評價生物毒性；本方法無需誘導，在Ih左右快速檢測生物毒 性，操作簡單，無需特殊的大型儀器，對操作人員要求低。
[0007] -種基于擁有P_半乳糖苷酶的細菌檢測生物毒性的方法，包括以下步驟：
[0008] 1)將細菌菌液和待測物質混合，得到混合液；
[0009] 2)向混合液中加入ONPG(2-硝基苯-@ -D-半乳糖苷)，得到混合反應液；
[0010] 3)向混合反應液中加入碳酸鈉，得到最終液；
[0011] 4)測試最終液的吸光度，根據(jù)吸光度來評價生物毒性；
[0012] 其中，所述細菌是無需誘導即可分解ONPG產(chǎn)生(6-半乳糖苷酶的細菌。
[0013] 進一步地，所述細菌為大腸桿菌ATCC25922或枯草芽孢桿菌1. 1086。
[0014] 優(yōu)選地，所述大腸桿菌ATCC25922或枯草芽孢桿菌1. 1086選用處于對數(shù)生長期 的大腸桿菌或枯草芽孢桿菌。
[0015] 大腸桿菌ATCC25922和枯草芽孢桿菌1. 1086均是于2013年6月購于中國普通 微生物菌種保藏管理中心，該中心聯(lián)系方式為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科 學院微生物研究所，電話為010-64807355。
[0016] 大腸桿菌培養(yǎng)基為傳統(tǒng)的LB培養(yǎng)基：取0. 5g牛肉膏、Ig蛋白胨和0. 5g氯化鈉溶 于IOOmL去離子水中，調(diào)節(jié)pH至7.0~7. 4,于高壓蒸汽滅菌中120°C滅菌20min，自然冷 卻，即可使用。
[0017] 枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供，也是生物學上 常見的培養(yǎng)基：取Ig蛋白胨、0. 3g牛肉提取物和0. 5g氯化鈉溶于IOOmL去離子水中，調(diào)節(jié) pH至7.0,于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，自然冷卻。
[0018] 優(yōu)選地，步驟1)中，細菌菌液是將大腸桿菌或枯草芽孢桿菌分散在0. 8%的氯化鈉 溶液中得到，OD6tltl為1.2~3. 5。
[0019] 更優(yōu)選地，步驟1)中，細菌菌液是將培養(yǎng)得到的大腸桿菌或枯草芽孢桿菌離心 分離，用氯化鈉溶液清洗兩次，之后再用氯化鈉溶液分散后得到；其中，離心分離的轉速是 5000~8000轉/分，時間為5~IOmin;清洗的轉速是5000~6000轉/分，時間為5~ IOmin。使用0. 8%氯化鈉溶液。
[0020] 細菌菌液和待測物質的用量比例無須限定，在應用時根據(jù)具體情況來確定。
[0021] 優(yōu)選地，步驟1)中，細菌菌液和待測物質混合后，在37°C放置30~60min，得到混 合液。放置的目的是使待測物質與細菌充分作用。更優(yōu)選地，放置30min。
[0022] 優(yōu)選地，步驟2)中，向混合液加入ONPG后，在37°C放置30~40min，得到混合反 應液。放置的目的是使大腸桿菌水解0NPG。更優(yōu)選地，放置30min。
[0023] 更優(yōu)選地，步驟2)中，ONPG溶液的濃度是4~10mg/mL。ONPG溶液的用量無須限 定，在應用時根據(jù)具體情況來確定。
[0024] 優(yōu)選地，步驟3)中，向混合反應液加入碳酸鈉后，高速離心，取上清液，得到最終 液。碳酸鈉溶液的濃度、用量、與混合反應液的用量比例等均無須限定，在應用時根據(jù)具體 情況來確定。
[0025] 優(yōu)選地，步驟4)中，在420nm波長處測吸光度。
[0026] 在實際檢測時，可取等量的菌液到多個試管，往各試管中加入不同濃度的待測物 質，使數(shù)個試管中待測物質的濃度形成梯度差。之后按照上面步驟分別測定吸光度，通過比 較吸光度的大小來評價待測物質的生物毒性。吸光度越大，表明待測物質對細菌的生物毒 性越??；吸光度越小，表明待測物質對細菌的生物毒性越大?？稍O置對照組來作為評價基 底，對照組試管中加入〇. 8%氯化鈉溶液來替代待測物質。
[0027] 實際檢測待測物質時，通過觀察吸光度有無變化、變化大小來判斷有無毒性、毒性 大小。本方法可適用檢測任意待測物質。在檢測時，可通過提高待測物質的濃度等來使得 檢測效果更易于觀察。
[0028] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0029] 1、在使用大腸桿菌ATCC25922菌液作為細菌菌液時，無需向大腸桿菌培養(yǎng)基中 加入乳糖或IPTG(異丙基硫代半乳糖苷）等(6-半乳糖苷酶誘導物。
[0030] 2、首次利用枯草芽孢桿菌1. 1086來檢測生物毒性。
[0031] 3、用0. 8%氯化鈉溶液分散細菌，有效避免了PBS溶液中磷酸一氫根會和金屬離子 生成沉淀的影響。
[0032] 4、本方法可在Ih左右快速檢測生物毒性，操作簡單，無需特殊的大型儀器，對操 作人員要求低，有很廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0033] 下面結合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明；
[0034] 圖1為本發(fā)明方法的基本原理圖；
[0035] 圖2是實施例1中檢測不同濃度Cd2+對大腸桿菌生物毒性的紫外-可見吸收光 譜；
[0036] 圖3是對比例中檢測不同濃度Cd2+對大腸桿菌生物毒性的紫外-可見吸收光譜；
[0037] 圖4是實施例2中檢測不同濃度Cu2+對大腸桿菌生物毒性的紫外-可見吸收光 譜；
[0038] 圖5是實施例3中檢測不同濃度Cd2+對枯草芽孢桿菌生物毒性的紫外-可見吸收 光譜；
[0039] 圖6是實施例4中檢測不同濃度Pb2+對大腸桿菌生物毒性的紫外-可見吸收光 譜。
【具體實施方式】
[0040] 為更好地理解本發(fā)明，下面將通過具體的實施例進一步說明本發(fā)明的方案，本發(fā) 明的保護范圍應包括權利要求的全部內(nèi)容，但不限于此。
[0041] 圖1為本發(fā)明方法的基本原理圖。
[0042] 實施例1
[0043] 一種基于擁有P_半乳糖苷酶的細菌檢測生物毒性的方法，包括以下步驟：
[0044] 1、配制LB培養(yǎng)基：取0. 5g牛肉膏、Ig蛋白胨和0. 5g氯化鈉溶于IOOmL去離子水 中，調(diào)節(jié)pH至7. 0~7. 4,于高壓蒸汽滅菌中滅菌。待LB培養(yǎng)基冷卻后，向培養(yǎng)基中接種大 腸桿菌（ATCC25922)。然后將接種好的培養(yǎng)基置于37°C恒溫水浴搖床中培養(yǎng)16h，此時大 腸桿菌正好處于對數(shù)生長期。將大腸桿菌離心分離，用〇. 8%的NaCl溶液清洗兩次，之后將 大腸桿菌分散于〇. 8%的NaCl溶液中，得到一定濃度的大腸桿菌菌液。
[0045] 2、取5個I. 5mL的試管，編號為