專利名稱：冷凍的酸乳酪促酵物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于直接接種牛奶的冷凍促酵物的制備方法，以及用該方法獲得的冷凍促酵物。
已知將乳酸菌培養(yǎng)物進(jìn)行冷凍處理可以保存這種培養(yǎng)物，用于制備酸乳酪。這種培養(yǎng)物也稱作促酵物，它們在接種牛奶前通過預(yù)培養(yǎng)可以被活化，或者以冷凍形式直接用于接種牛奶而制備酸乳酪。
美國專利No.3,975,545描述了一種冷凍的酸乳酪促酵物的制備，該促酵物在用于接種牛奶前被活化。在該方法中，乳酸菌生長于一種合成培養(yǎng)基中，濃縮后，加入一種名為甘油磷酸的低溫防護(hù)劑，然后將該細(xì)菌于-20℃冷凍。隨后將該促酵物與低溫防護(hù)劑一起在合成培養(yǎng)基中或牛奶中預(yù)培養(yǎng)而將它活化，然后用于接種牛奶制備酸乳酪。
同樣，EP0,378,478描述了一種用于直接接種牛奶的冷凍促酵物的制備方法。在該方法中，乳酸菌生長于一種合成的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，具體來說，該培養(yǎng)基特別含有用于溶解酪蛋白的多磷酸鹽，將得到的培養(yǎng)物濃縮后冷凍。已冷凍過的這種促酵物每克大約含有109-1010個活細(xì)胞菌落或含有109-1010cfu/g(cfu是菌落形成單位的縮寫)，通常以0.01-0.1％的濃度用于直接接種。
但是用于直接接種的在冷凍促酵物中的乳酸菌常受多種應(yīng)激因素(stress factor)的影響，這些因素影響它以正常方式發(fā)酵牛奶的能力。
這些應(yīng)激因素歸因于例如在組成在不同程度上與牛奶大不相同的合成營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)菌。于是，細(xì)菌產(chǎn)生了一種難于適用于發(fā)酵牛奶的代謝作用。同樣，例如通過離心作用將細(xì)菌濃縮，因而也擾亂了細(xì)菌。最后，按傳統(tǒng)做法在冷卻前向培養(yǎng)物中加入低溫防護(hù)劑，以便保持細(xì)胞免于被凍壞。但是，這些低溫防護(hù)劑也具有抑制細(xì)菌生長的作用。
因此，一旦這種促酵物的活細(xì)菌被擾亂，那么實際上只有一部分細(xì)菌能真正發(fā)酵牛奶，并因而產(chǎn)生乳酸。由此發(fā)現(xiàn)只有低于10％的被接種細(xì)菌能有效地發(fā)酵牛奶。因此，提高冷凍促酵物的發(fā)酵活性水平是非常有意義的。
本發(fā)明的一個目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，并提供一種具有10％以上，優(yōu)選95％以上發(fā)酵活性水平的用于直接接種牛奶的冷凍促酵物。
為了達(dá)到目的，在制備用于直接接種牛奶而制備酸乳酪的冷凍促酵物的方法中，乳酸菌生長于溫度為40-45℃的牛奶中，直到PH達(dá)到4.3-5.5，然后直接將該培養(yǎng)物冷凍。
本發(fā)明還涉及該冷凍促酵物以及它在制備酸乳酪中的應(yīng)用。
因此，本發(fā)明所述的制備冷凍促酵物的方法具有省卻合成培養(yǎng)基以及省卻濃縮裝置的優(yōu)點。因而該方法特別簡單和易于實施。
而且，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的冷凍促酵物具有高于95％的發(fā)酵活性水平，這意味著在冷凍處理后存活下來的活細(xì)菌中，有95％以上的細(xì)菌能快速發(fā)酵牛奶，從而導(dǎo)致乳酸的形成。
因此，本發(fā)明提供的促酵物能與用于直接接種的傳統(tǒng)的冷凍促酵物一樣快地發(fā)酵牛奶，直到PH值達(dá)到酸乳酪的常規(guī)值即4.4-4.8的范圍，而后者含有至少多10倍的活細(xì)胞。
最后，本方法實施時可以不使用低溫防護(hù)劑，尤其是在制備鏈球菌屬冷凍促酵物時，更是如此。
在下文中，術(shù)語“鏈球菌屬”包括根據(jù)新命名法(bergey′smanual)所述的乳球菌和鏈球菌。
實施本方法時，在牛奶中至少生長例如一個鏈球菌菌株和/或至少一個乳桿菌菌株。對于所述鏈球菌，優(yōu)選使用乳酸乳球菌乳酸亞種(Lactococcus lactis Subsp.lactis)、乳酸乳球菌cremoris亞種(Lactococcus lactis Subsp.Cremoris)、乳酸乳球菌乳酸變種二乙酰乳酸(diacetylactis)亞種(Lactococcus lactis Subsp.lacticbiovar diacetylactis)以及嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)。同樣，對于乳桿菌，例如可以使用德彼利氏乳芽孢桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii Subsp.bulgaricus)、嗜酸乳芽孢桿菌(Lactobacillus acidophillus)、瑞士乳芽孢桿菌(Lactobacillus helveticus)、干酪乳芽孢桿菌干酪亞種(Lactobacillus casei Subsp.casei)和德彼利氏乳芽孢桿菌乳酸亞種(Lactobacillus delbruckii Subsp.Lactis)(見Bergey′s Manualof Systematic Bacteriology，vol2，1986)。
制備本發(fā)明的促酵物時，具體可用所用的各細(xì)菌屬或種的新鮮預(yù)培養(yǎng)物和/或用所用的細(xì)菌屬或種的混和物的預(yù)培養(yǎng)物接種牛奶。另外，預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基可以是常規(guī)用于實驗室培養(yǎng)乳細(xì)菌的合成營養(yǎng)培養(yǎng)基，例如MRS培養(yǎng)基(De Man et al，1960)或以牛奶為主要成分的培養(yǎng)基，例如MSK培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有10％的粉狀復(fù)原脫脂牛奶和1/10,000份的市售酵母提取物。因此，考慮用一種或多種新鮮預(yù)培養(yǎng)物接種的所有可能性，其中每種預(yù)培養(yǎng)物包括來自于不同屬或種的乳細(xì)菌的一個或多個菌株。因此，所加入的各新鮮預(yù)培養(yǎng)物的接種物的量依據(jù)達(dá)到最終PH值所需發(fā)酵時間以及所使用的乳細(xì)菌的一個或幾個菌株而定。最后，優(yōu)選的是通過將最初被冷凍或冷干的菌株連續(xù)幾代預(yù)培養(yǎng)而制備新鮮預(yù)培養(yǎng)物，并用這最后一代預(yù)培養(yǎng)物接種牛奶，一般來講，該最后一代預(yù)培養(yǎng)物是在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基處于凝固階段時獲取的第三代培養(yǎng)物。
還可以使用其他形式的直接接種法，例如使用凍干的培養(yǎng)物的方法。
優(yōu)選在冷凍以前向具體含有乳桿菌的培養(yǎng)物加入3-10％甘油。于是，該培養(yǎng)物除含有乳桿菌外，還含有其它種或?qū)俚募?xì)菌，例如鏈球菌的一個或多個菌株。加入甘油后可以提高乳桿菌在冷凍時的存活率，從而獲得具有95％以上發(fā)酵活性水平的本發(fā)明促酵物。但是，必須注意到，加入甘油并不是獲得本發(fā)明所述具有10％以上發(fā)酵活性水平的促酵物的必要條件。
同樣，乳酸菌可以以傳統(tǒng)方式進(jìn)行冷凍，例如在-20～-90℃之間冷凍。
最后，所述牛奶可以采用無菌脫脂牛奶，或者無菌復(fù)原脫脂牛奶，即用奶粉復(fù)原的并在110-120℃滅菌了20-40分鐘得到的牛奶。這種牛奶還可以含有1％酵母提取物，以在制備促酵物時促進(jìn)細(xì)菌的生長。
在本發(fā)明制備具有最大發(fā)酵活性水平的鏈球菌促酵物的方法的第一優(yōu)選實施方案中，鏈球菌在41-44℃溫度生長，直到PH值達(dá)到4.9至5.2，以便使細(xì)胞密度達(dá)到2×108至5×108cfu/g范圍內(nèi)，然后直接將該培養(yǎng)物冷凍。
于是也可在牛奶中生長鏈球菌的多個種或菌株。鏈球菌的接種物可以是含有以混合物形式使用的鏈球菌的幾個種或幾個有株的一種新鮮預(yù)培養(yǎng)物，和/或者可以是所使用的鏈球菌的各個種或菌株的多種新鮮預(yù)培養(yǎng)物。特別是可以以這種方式生長至少一個嗜熱鏈球菌(streptococcus thermophilus)的菌株。
在本發(fā)明制備具有最大活性水平的乳桿菌促酵物的方法的第二個優(yōu)選實施方案中，乳桿菌于41-44℃溫度生長，直到PH值達(dá)到4.6至5，從而使細(xì)胞密度達(dá)到108－5×108cfu/g范圍，然后直接將該培養(yǎng)物冷凍。
于是可以在牛奶中培養(yǎng)多個的乳桿菌種或菌株。該乳桿菌接種物可以是含有以混合物形式使用的乳桿菌的幾個種或菌株的一種新鮮預(yù)培養(yǎng)物，和/或可以是所用的乳桿菌的各個種或各個菌株的多種新鮮預(yù)培養(yǎng)物。尤其是可以以這種方式生長德彼利氏乳芽孢桿菌保加利亞種(Lactobacillus delbruckii Subsp.bulgaricus)的至少一個菌株。
在本發(fā)明制備含有具有最大發(fā)酵活性水平的乳桿菌和鏈球菌的混合物的混合促酵物的方法的第三個優(yōu)選實施方案中，所述細(xì)菌于41-44℃生長，直到PH值達(dá)到4.5-4.9，以使細(xì)胞密度達(dá)到3×108－5×108cfu/g范圍，然后將該培養(yǎng)物直接冷凍。
該接種物還可以是一種新鮮預(yù)培養(yǎng)物，培養(yǎng)物包括以混合物形式使用的細(xì)菌的幾個屬，幾個種或幾個菌株和/或者可以是所使用的細(xì)菌的每個屬，每個種或每個菌株的多種新鮮預(yù)培養(yǎng)物。尤其是這些經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)菌混合物可含有例如相對于乳桿菌的比例為50-90％的鏈球菌。
冷凍促酵物也是本發(fā)明的目的之一。事實上，將會驚奇地看到從冷凍中存活下來的細(xì)胞中有95％以上能夠產(chǎn)生乳酸。
將該冷凍促酵物用于制備酸乳酪也是本發(fā)明的一個目的。事實上，這樣一種促酵物能與傳統(tǒng)促酵物一樣快地發(fā)酵牛奶，而后者含有至少多10倍的活細(xì)胞。因此優(yōu)選的是以在牛奶中濃度為0.01至0.1％的量使用本發(fā)明的促酵物，這也是本發(fā)明的目的之一。
在下文中描述的實施例將更詳細(xì)地闡述本發(fā)明的方法和冷凍促酵物。所述百分?jǐn)?shù)都以重量計。在描述這些實施例前先對附圖進(jìn)行簡單描述。


圖1一種凝固酸乳酪的制備。并顯示了用不同冷凍促酵物的混合物發(fā)酵的二種牛奶的PH值與發(fā)酵時間的函數(shù)關(guān)系。
圖2一種攪碎酸乳酪的制備。并顯示了用不同冷凍促酵物的混合物發(fā)酵的二種牛奶的PH值與發(fā)酵時間的函數(shù)關(guān)系。
實施例1一種商業(yè)酸乳酪菌株嗜熱鏈球菌的冷凍促酵物的制備過程如下將10％的脫脂奶粉復(fù)原成脫脂牛奶，加入1％酵母提取物，將該混合物在115℃滅菌30分鐘，然后冷卻到大約42℃。
通過在已于155℃滅菌30分鐘的MSK培養(yǎng)基中連續(xù)幾次預(yù)培養(yǎng)而將傳統(tǒng)的冷凍嗜熱鏈球菌菌株活化。然后用在培養(yǎng)基凝固階段時獲取的第三代預(yù)培養(yǎng)物以1％的比例接種到該無菌的復(fù)原牛奶中，將該混合物在大約42℃培養(yǎng)直到PH值達(dá)到5.1，然后冷卻到4℃。最后將這一批產(chǎn)物在-75℃冷凍。
實施例2商品粘稠型酸乳酪菌株德彼利氏乳桿菌保加利亞亞種的冷凍促酵物的制備過程如下。
使用實施例1中描述的含有1％酵母提取物的同一種脫脂無菌牛奶。通過在無菌MSK培養(yǎng)基中連續(xù)幾代預(yù)培養(yǎng)而將冷凍的德彼利氏乳桿菌保加利亞亞種的商品菌株進(jìn)行活化。隨后用在培養(yǎng)基凝固階段獲取的第三代預(yù)培養(yǎng)物以5％的比例接種到無菌復(fù)原牛奶中，并將該混合物在42℃培養(yǎng)直到PH值達(dá)到4.8，隨后冷卻到4℃，再加入5％無菌甘油，將該混合物在-75℃冷凍。
實施例3含有嗜熱鏈球菌的兩個商品菌株和德彼利氏乳桿菌保加利亞亞種的一個傳統(tǒng)的粘稠菌株的混合物的一種冷凍混合促酵物的制備過程如下。
首先制備實施例1中描述的也含有1％酵母提取物的同樣的脫脂無菌牛奶。
向這種牛奶中加入1％的按實施例1制備的嗜熱鏈球菌各個菌株的新鮮預(yù)培養(yǎng)物以及2％的按實施例2制備的德彼利氏乳桿菌保加利亞亞種菌株的一種新鮮預(yù)培養(yǎng)物。隨后將牛奶于大約42℃培養(yǎng)，直到PH值達(dá)到4.7。將牛奶冷卻到4℃，然后加入5％無菌甘油，將該混合物在-75℃冷凍。
實施例4用實施例1和2中描述的冷凍促酵物直接接種而制備凝固型酸乳酪。
以含3.7％脂肪和2.5％脫脂奶粉的全脂牛奶為原料制備一種牛奶。將40升的這種牛奶在92℃滅菌6分鐘，隨后在75℃和150巴均質(zhì)化(分兩個階段)，最后冷卻到大約42℃。
現(xiàn)在用三種冷凍促酵物的混合物發(fā)酵該牛奶，該混合物含有一個嗜熱鏈球菌CNCM I-1422菌株，一個嗜熱鏈球菌CNCMI-1424菌株以及一個德彼利氏乳桿菌保加利亞亞種CNCMI-1420菌株。通常這些菌株用于工業(yè)上生產(chǎn)酸乳酪，并已按照布達(dá)佩斯條約規(guī)定，于1994年5月18日將這些菌株寄存于Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)Institut Pasteur，28 rue du Dr Roux，75724.Paris Cedex 15。含有菌株CNCM I-1422和CNCM I-1424的促酵物按實施例1制備，含有CNCM I-1420菌株的促酵物按實施例2制備。
向牛奶加入7ml含有CNCM I-1422和CNCM I-1424菌株的冷凍促酵物以及6ml含有CNCM I-1420菌株的冷凍促酵物，將該牛奶在42℃培養(yǎng)直到PH值達(dá)到約4.65，隨后冷卻到4℃。
同樣，用另三種冷凍促酵物的混合物發(fā)酵經(jīng)巴斯德滅菌的全脂牛奶，每種促酵物各含有嗜熱鏈球菌CNCM I-1421菌株，嗜熱鏈球菌CNCM I-1423菌株以及德彼利氏乳桿菌保加利亞亞種CNCM I-800菌株，這些菌株都可按常規(guī)用于工業(yè)上生產(chǎn)酸乳酪，并且已按照布達(dá)佩斯條約規(guī)定，將CNCM I-1421和I-1423菌株于1994年5月1 8日，CNCM I-800菌株于1988年4月10日寄存于Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes(CNCM)，Institut Pasteur，28 rue du Dr Roux，75724 Paris Cedex 15，法國。含有CNCM I-1421和CNCMI-1423菌株的促酵物按實施例1制備，含有CNCM I-800菌株的促酵物按實施例2制備。
向該牛奶中加入7ml含有CNCM I-1421和CNCMI-1423的冷凍促酵物以及6ml含有CNCM I-800菌株的冷凍促酵物。將牛奶在42℃培養(yǎng)直到PH值達(dá)到大約4.65，隨后冷卻到4℃。
圖1顯示了酸化曲線，下面表中描述了所獲得的產(chǎn)品的特征。<
實施例5用實施例1和2描述的冷凍促酵物直接接種而制備攪碎的酸乳酪。
用含有3.7％脂肪和2.5％脫脂奶粉的全脂奶粉制備牛奶。在105℃將40ml這種牛奶滅菌2分鐘，隨后在75℃和300巴均質(zhì)化(第一階段)，最后將它冷卻到約43℃。
然后用三種冷凍促酵物的混合液發(fā)酵該牛奶，促酵物分別含有CNCM I-1 422，CNCM I-1424和CNCM I-800菌株。為了實現(xiàn)該目的，向牛奶中加入7ml實施例4的含有CNCM I-1422和CNCM I-1424菌桿的冷凍促酵物，以及6ml實施例4的含有CNCM I-800菌株的冷凍促酵物。隨后將該牛奶在43℃培養(yǎng)直到PH值達(dá)到4.65，隨后在攪拌同時冷卻至4℃。
同樣，用另外三種冷凍促酵物的混合液發(fā)酵全脂牛奶，混合液分別含有CNCM I-1421，CNCM I-1423和CNCM I-1420菌株。為了達(dá)到目的，向該牛奶中加入7ml實施例4的含有CNCM I-1421和CNCM I-1423菌株的冷凍促酵物以及6ml實施例4的含有CNCM I-1420菌株的冷凍促酵物。隨后在43℃培養(yǎng)該牛奶，直到PH值達(dá)到4.65，然后冷卻到4℃。
圖2中顯示了酸化曲線，下面的表中描述了獲得的產(chǎn)品的特性。
實施例6用0.05％的實施例5的冷凍促酵物的混合液接種到實施例4中的巴斯德滅菌后的牛奶中，其中促酵物混合液含有相同比例的菌株CNCM I-1422，I-1424和I-800，然后將該牛奶在42℃培養(yǎng)直到PH值達(dá)到4.65。
為了進(jìn)行比較，用3％的傳統(tǒng)新鮮培養(yǎng)物接種同樣的牛奶，其中傳統(tǒng)新鮮培養(yǎng)物含有相同比例的同種嗜熱鏈球菌和德彼利氏乳桿菌保加利亞亞種菌株，然后將該牛奶于42℃培養(yǎng)直到PH值達(dá)到4.65。
為了進(jìn)行比較，用0.02％的傳統(tǒng)的濃縮冷凍促酵物接種同樣的牛奶，傳統(tǒng)濃縮冷凍促酵物含有相同比例的同種嗜熱鏈球菌和德彼利氏乳桿菌保加利亞亞種菌株，然后在42℃培養(yǎng)牛奶直到PH值達(dá)到4.65。
下表中顯示了三種類型的發(fā)酵方法獲得的結(jié)果。
假定細(xì)胞的平均增殖時間為30分鐘，并且以新鮮培養(yǎng)物中細(xì)胞活性水平為100％，則利用下式可以大略地測定冷凍促酵物中細(xì)胞的相對發(fā)酵活性水平。
L＝109×(5.3×108/(1.02338)(實際時間-潛伏期，以分鐘計)/(CFU/每克接種牛奶)這樣發(fā)現(xiàn)兩種類型的冷凍促酵物混合液具有相同的潛伏期，這自然是由于細(xì)胞需對新環(huán)境進(jìn)行適應(yīng)。
但是，這兩種類型的促酵物混合液不能以同樣方式發(fā)酵牛奶。事實上，傳統(tǒng)冷凍促酵物混合液發(fā)酵牛奶的時間為6小時55分鐘，而如果以平均增殖時間為30分鐘作為基準(zhǔn)則該混合液發(fā)酵牛奶的時間應(yīng)為5小時。相反，本發(fā)明的促酵物混合液實質(zhì)上能在預(yù)計的時間內(nèi)發(fā)酵牛奶。
這樣發(fā)現(xiàn)本發(fā)明促酵物中95％以上的乳酸菌發(fā)酵牛奶，而傳統(tǒng)冷凍促酵物中只有低于10％的乳酸菌能夠發(fā)酵牛奶。這就解釋了下述事實作為起始接種百分?jǐn)?shù)的函數(shù)，作為本發(fā)明目的的促酵物能與傳統(tǒng)冷凍促酵物(通過直接接種)一樣快地發(fā)酵牛奶直到PH值達(dá)到酸乳酪的常規(guī)PH值，即4.4-4.8。為了達(dá)到該目的，優(yōu)選用比傳統(tǒng)冷凍促酵物高出2.5倍的本發(fā)明的促酵物接種牛奶。
最后，對于與傳統(tǒng)冷凍促酵物相同的接種百分?jǐn)?shù)，本發(fā)明的促酵物發(fā)酵牛奶的速度略低于用傳統(tǒng)冷凍促酵物的發(fā)酵速度(如上述表中可看出的)。但是，時間損失低，約在20分鐘左右，并且可以通過本發(fā)明的促酵物的成本價格中的收益和它的易制備性得到補(bǔ)償。
權(quán)利要求
1.用于直接接種牛奶從而制備酸乳酪的冷凍促酵物的制備方法，其特征在于使乳酸菌在40-45℃于牛奶中生長，直到PH值達(dá)到4.3-5.5，隨后將該培養(yǎng)物直接冷凍。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于使鏈球菌的至少一個菌株和/或乳桿菌的至少一個菌株生長。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于用一種或多種新鮮預(yù)培養(yǎng)物接種牛奶，所述新鮮預(yù)培養(yǎng)物各含有可屬于不同屬或種的一個或多個乳酸菌菌株。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于在冷凍之前向乳桿菌培養(yǎng)物中加入3-10％的甘油。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于牛奶中還含有1％的酵母提取物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于將培養(yǎng)物在-20℃～-90℃冷凍。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其特征在于鏈球菌于41-44℃生長，直到PH值達(dá)到4.9-5.2，這樣細(xì)胞密度達(dá)到2×108至5×108C FU/g范圍，然后將培養(yǎng)物直接冷凍。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任何一項的方法，其特征在于乳桿菌于41-44℃生長，直到PH值達(dá)到4.6-5，這樣細(xì)胞密度達(dá)到108－5×108CFU/g的范圍，然后將培養(yǎng)物直接冷凍。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任何一項的方法，其特征在于乳桿菌和鏈球菌于41-44℃生長，直到PH達(dá)到4.5-4.9，這樣細(xì)胞密度達(dá)到3×108－5×108CFU/g的范圍，然后將培養(yǎng)物直接冷凍。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于細(xì)菌混合物中含有相對于乳桿菌為50-90％的鏈球菌。
11.用權(quán)利要求1-10中任何一項的方法獲得的冷凍促酵物。
12.權(quán)利要求11的冷凍促酵物用于制備酸乳酪的用途。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的用途，其濃度為牛奶的0.01至0.1％。
全文摘要
用于直接接種牛奶從而制備酸乳酪的冷凍促酵物的制備方法，其中使乳酸菌于40-44℃溫度下于牛奶中生長直至pH值達(dá)到4.3-5.5，隨后將培養(yǎng)物直接冷凍。本發(fā)明還涉及冷凍促酵物以及該促酵物的用途。
文檔編號A23C9/123GK1120584SQ95107028
公開日1996年4月17日 申請日期1995年6月20日 優(yōu)先權(quán)日1994年6月21日
發(fā)明者O·米格諾特 申請人:雀巢制品公司