專利名稱：發(fā)酵法制造l-異亮氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用發(fā)酵法制造L-異亮氨酸的方法和在該方法中所使用的大腸桿菌屬細(xì)菌。L-異亮氨酸對于人類和動物來說是必需的氨基酸，主要以營養(yǎng)劑為主用于醫(yī)藥方面。
由于異亮氨酸具有2個不對稱碳原子，所以用化學(xué)合成方法在工業(yè)上廉價地單生產(chǎn)L型是比較困難的。此外，已知將α-氨基丁酸和α-氧代丁酸等L-異亮氨酸生物合成的前體作為原料，通過生物轉(zhuǎn)化制造L-異亮氨酸的方法。但是這些方法的原料昂貴，不能說是在工業(yè)上能廉價地制造L-異亮氨酸的有效方法。
使用廉價的碳源及氮源，用直接發(fā)酵法制造L-異亮氨酸的方法有以下幾種1)以對于L-異亮氨酸的拮抗劑具有抗藥性的棒狀桿菌屬、沙雷式菌屬或埃希氏桿菌屬的變異株作為L-異亮氨酸生產(chǎn)株的方法(特公昭51-21077號公報(bào)、特公昭52-4629號公報(bào)、特公昭56-29998號公報(bào)、特公昭56-3035號公報(bào)等)，2)以L-異亮氨酸生物合成的關(guān)鍵酶——蘇氨酸脫氨酶或其乙酰羥基酸合酶通過重組DNA技術(shù)而增強(qiáng)的埃希氏桿菌屬或棒狀桿菌屬的微生物作為L-異亮氨酸生產(chǎn)株的方法(特開平2-458號公報(bào)、特開平2-42988號公報(bào)等)。
本發(fā)明的目的在于提供一種利用發(fā)酵法以更高收率廉價地制造L-異亮氨酸的方法。
本發(fā)明者們使用具有L-異亮氨酸生產(chǎn)性的埃希氏桿菌屬細(xì)菌以更高收率廉價地制造了L-異亮氨酸，該菌類的特征是保留含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-蘇氨酸的抑制的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I的thrA基因的thrABC操縱子和含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的蘇氨酸脫氨酶的ilvA基因且除去了減弱作用所必需的區(qū)域的ilvGMEDA操縱子。
本發(fā)明所提供的具有L-異亮氨酸生產(chǎn)性的埃希氏桿菌屬細(xì)菌的特征是保留含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-蘇氨酸的抑制的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I的thrA基因的thrABC操縱子和含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的蘇氨酸脫氨酶的ilvA基因且除去了減弱作用所必需區(qū)域的ilvGMEDA操縱子。
本發(fā)明的埃希氏桿菌屬細(xì)菌可以將上述thrABC操縱子和上述ilvGMEDA操縱子保留在質(zhì)粒上。
本發(fā)明的埃希氏桿菌屬細(xì)菌可以保留攜帶上述thrABC操縱子的質(zhì)粒(A)和攜帶上述ilvGMEDA操縱子的質(zhì)粒(B)兩種質(zhì)粒。
上述ilvGMEDA操縱子的具體例是具有記載在序列表中序列號1上的DNA序列的953位至1160位缺損的DNA序列的ilvGMEDA操縱子。
質(zhì)粒(A)的具體例可以舉出pVIC40，質(zhì)粒(B)的具體例可以舉出pMWD5。
上述的埃希氏桿菌屬細(xì)菌優(yōu)選大腸桿菌。
本發(fā)明中更優(yōu)選的埃希氏桿菌屬細(xì)菌是具有下述特征的大腸桿菌宿主株缺損thrC基因，在5mg/ml的L-蘇氨酸存在下可以增殖，缺失蘇氨酸脫氫酶活性，ilvA基因具有滲漏變異，并且保留含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-蘇氨酸的抑制的AKI-HDI的thrA基因的thrABC操縱子和編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的TD的ilvA基因且除去了減弱作用所必需的區(qū)域的ilvGMEDA操縱子。其具體例可舉出大腸桿菌AJ12919株。
本發(fā)明還提供了具有L-異亮氨酸生產(chǎn)性的埃希氏桿菌屬細(xì)菌，其特征是保留含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-蘇氨酸的抑制的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I的thrA基因的thrABC操縱子和編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-賴氨酸的抑制的天冬氨酸激酶III的lysC基因以及含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的蘇氨酸脫氨酶的ilvA基因且除去了減弱作用所必需的區(qū)域的ilvGMEDA操縱子。
本發(fā)明的埃希氏桿菌屬細(xì)菌可以將上述的thrABC操縱子和上述lysC基因以及上述ilvGMEDA操縱子保留在質(zhì)粒上。
本發(fā)明的埃希氏桿菌屬細(xì)菌可以保留攜帶上述thrABC操縱子和上述lysC基因的質(zhì)粒(C)和攜帶上述ilvGMEDA操縱子的質(zhì)粒(B)兩種質(zhì)粒。
上述ilvGMEDA操縱子的具體例可以舉出具有記載在序列表中序列號1上的DNA序列的953位至1160位缺損的DNA序列的ilvGMEDA操縱子。
質(zhì)粒(C)的具體例可以舉出pVICLC*80A，質(zhì)粒(B)的具體例可以舉出pMWD5。
上述埃希氏桿菌屬細(xì)菌優(yōu)選大腸桿菌。
本發(fā)明的更優(yōu)選的埃希氏桿菌屬細(xì)菌是具有下述特征的大腸桿菌宿主株缺損thrC基因，在5mg/ml的L-蘇氨酸存在下可以增殖，缺失蘇氨酸脫氫酶活性，ilvA基因具有滲漏變異，并且保留含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-蘇氨酸的抑制的AKI-HDI的thrA基因的thrABC操縱子和編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-賴氨酸的抑制的AKIII的lysC基因以及含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的TD的ilvA基因且除去了減弱作用所必需的區(qū)域的ilvGMEDA操縱子。其具體例是大腸桿菌AJ13100株。
本發(fā)明還提供了用發(fā)酵法制造L-異亮氨酸的方法，其特征是在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述埃希氏桿菌屬細(xì)菌，使L-異亮氨酸在該培養(yǎng)基中生成積累，而后從該培養(yǎng)基中采出L-異亮氨酸。
以下，在本申請說明書中，往往將編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-蘇氨酸的抑制的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I的thrA基因稱為“解除型thrA基因”，將含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-蘇氨酸的抑制的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶的thrA基因的thrABC操縱子稱為“解除型thrABC操縱子”。
在本申請說明書中，往往將編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的蘇氨酸脫氨酶的ilvA基因稱為“解除型ilvA基因”，將含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的蘇氨酸脫氨酶的ilvA基因(解除型ilvA基因)的ilvGMEDA操縱子稱為“解除型ilvGMEDA操縱子”。含有解除型ilvA基因且除去了減弱作用所必需的區(qū)域的ilvGMEDA操縱子稱為“完全解除型ilvGMEDA操縱子”。
在本申請說明書中，往往將天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I簡稱為“AKI-HDI”，將蘇氨酸脫氨酶簡稱為“TD”。
在本申請說明書中，往往將實(shí)質(zhì)上解除了L-蘇氨酸的抑制的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I簡稱為“解除型AKI-HDI”，將實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的蘇氨酸脫氨酶簡稱為“解除型TD”。
下面詳細(xì)說明本發(fā)明。
1.含有實(shí)質(zhì)上解除了L-蘇氨酸的抑制的thrA基因的thrABC操縱子含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-蘇氨酸的抑制的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I的thrA基因的thrABC操縱子(即解除型thrABC操縱子)在所含的thrA基因具有變異方面與野生型thrABC操縱子不同。該變異是指解除了L-蘇氨酸對thrA基因編碼的AKI-HDI的反饋抑制的變異。
按以下方法得到這種解除型thrABC操縱子。首先將含有野生型thrABC操縱子的DNA進(jìn)行體外變異處理，變異處理后的DNA與適合宿主的載體DNA連接，得到重組DNA。將重組DNA導(dǎo)入宿主微生物后，得到轉(zhuǎn)化體，如果在所述轉(zhuǎn)化體中選擇可以表達(dá)解除型AKI-HDI的轉(zhuǎn)化體，則該轉(zhuǎn)化體可保留解除型thrABC操縱子。另外將含有野生型thrABC操縱子的DNA與適合宿主的載體DNA連接后，得到重組DNA，將重組DNA進(jìn)行體外變異處理，將變異處理后的重組DNA導(dǎo)入宿主微生物，得到轉(zhuǎn)化體，在所述轉(zhuǎn)化體中選擇可以表達(dá)解除型AKI-HDI的轉(zhuǎn)化體，該轉(zhuǎn)化體也可以保留解除型thrABC操縱子。
也可以將生產(chǎn)野生型AKI-HDI的微生物變異處理，建立生產(chǎn)解除型AKI-HDI的變異株后，再從該變異株得到解除型thrABC操縱子?；蛘邔⒅亟MDNA(該重組DNA連接著野生型thrABC操縱子)導(dǎo)入所形成的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行變異處理，建立生產(chǎn)變異型AKI-HDI的變異株后，從該變異株中回收重組DNA，也可以在該DNA上建立解除型thrABC操縱子。
將DNA體外變異處理的藥劑有羥胺等。羥胺是通過將胞嘧啶變成N4-羥基胞嘧啶而使得胞嘧啶變異成胸腺嘧啶的化學(xué)變異處理劑。另外，在將微生物本身進(jìn)行變異處理時，可以用紫外線照射或用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)等通常人工突變中所用的誘變劑進(jìn)行處理。
作為thrABC操縱子，可以舉出來自埃希氏桿菌屬細(xì)菌、特別是來自大腸桿菌(Escherichia coli；下稱“E.coli”)的thrABC操縱子。
利用來自埃希氏桿菌屬細(xì)菌的thrABC操縱子時，作為含有野生型thrABC操縱子的DNA供給菌，任何屬于埃希氏桿菌屬的微生物都可以使用。具體地說，可以使用Neidhardt等所著書(Neidhardt，F(xiàn).C.等，Escherichia coli and Salmonella Typhimurium，AmericanSociety for Microbiology，Washington D.C.，1208，表1)中列舉的微生物。例如E.coli JM109株和MC1061株等。用野生株作為含有thrABC操縱子的DNA供給菌時，可以得到含有野生型thrABC操縱子的DNA。
(1)野生型thrABC操縱子的獲得下面對于含有thrABC操縱子的DNA的制備例進(jìn)行說明。首先培養(yǎng)具有野生型AKI-HDI的E.coli，例如MC1061株，得到培養(yǎng)物。培養(yǎng)上述微生物時，可以用通常的固體培養(yǎng)法，但是考慮到集菌時的效率，最好采用液體培養(yǎng)法。另外，作為培養(yǎng)基，可使用在酵母提取物、胨、胰酶解胨、或肉提取物中加入氯化鈉(NaCl)得到的培養(yǎng)基。具體地說是L-肉汁(bact·胰酶解胨1％、bact·酵母提取物0.5％、NaCl 0.5％、葡萄糖0.1％，pH＝7.2)。培養(yǎng)基的初始pH最好調(diào)節(jié)到6～8。另外，培養(yǎng)在30～42℃、優(yōu)選37℃左右采用通氣攪拌內(nèi)部培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)或靜置培養(yǎng)等方法進(jìn)行4～24小時。
將這樣得到的培養(yǎng)物在例如3000r.p.m.下離心分離5分鐘，得到E.coli MC1061株菌體。通過使用例如齋藤、三浦的方法(Biochem.Biophys.Acta.，72，619(1963))、K.S.Kirby的方法(Biochem.J.，64，405(1956))等方法可從此菌體得到染色體DNA。
為了從這樣得到的染色體DNA中分離thrABC操縱子，制備染色體DNA庫。首先用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶將染色體DNA部分分解，得到各種片段的混合物。例如，使Sau3AI在30℃以上的溫度、優(yōu)選37℃和1～10單位/ml的酶濃度下與染色體DNA作用不同時間(1分～2小時)，將其消化。
接著，將斷裂的染色體DNA片段連接至可在埃希氏桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)自體復(fù)制的載體DNA上，制備重組DNA。具體地說，將產(chǎn)生與用于切斷染色體DNA的限制性內(nèi)切酶Sau3AI相同的末端堿基順序的限制性內(nèi)切酶(例如BamHI)在30℃以上溫度、1～100單位/ml酶濃度的條件下與載體DNA作用1小時以上、優(yōu)選1～3小時后，將其完全消化、切斷。再將上述得到的染色體DNA片段混合物與斷裂的載體DNA混合，將其與DNA連接酶、優(yōu)選T4DNA連接酶在4～16℃、1～100單位/ml酶濃度的條件下作用1小時以上、優(yōu)選6～24小時，得到重組DNA。
使用得到的重組DNA轉(zhuǎn)化埃希氏桿菌屬微生物，例如大腸菌K-12株或E.coli Gif106M1株(thrA1101，metM1000，lysC1001，ilvA，argH)那類天冬氨酸激酶缺損變異株，制備染色體DNA庫。這種轉(zhuǎn)化可以按照D.M.Morrison的方法(Methods in Enzymology 68，326，1979)或用氯化鈣處理受容菌細(xì)胞的方法(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))進(jìn)行。另外，E.coliGif106M1株可從E.coli Genetic Stock Center(美國康涅狄格州)得到。
從得到的染色體DNA庫中選擇天冬氨酸激酶活性增大的株或者可以互補(bǔ)由于天冬氨酸激酶基因缺損引起的營養(yǎng)缺陷的株，得到具有含有thrA基因的重組DNA的菌株。
確認(rèn)具有含有thrA基因的重組DNA的候補(bǔ)株是否保留thrA基因純株培養(yǎng)成的重組DNA時，可以通過由候補(bǔ)株制備細(xì)胞提取液，由其制備粗酶液后，檢查天冬氨酸激酶活性增大的方法來完成。天冬氨酸激酶活性的測定方法可以按照Stadtman等的方法進(jìn)行(Stadtman，E.R.，Cohen，G.N.，LeBras，G.和Robichon Szulmajster，H.，J.Biol.Chem.，236,2033(1961))。
另外，由于天冬氨酸激酶缺損變異株需要L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-蛋氨酸及二氨基庚二酸，所以當(dāng)將天冬氨酸激酶缺損變異株用于宿主時，可在不含有L-賴氨酸、L-蘇氨酸、L-蛋氨酸及二氨基庚二酸的最少培養(yǎng)基上，或者在不含有高絲氨酸及二氨基庚二酸的培養(yǎng)基上分離出可生長的菌株，通過從該菌株中回收重組DNA，可以得到含有thrA基因的DNA片段。
但是，在E.coli中存在三種天冬氨酸激酶，所以也存在編碼天冬氨酸激酶的三種基因。因此，為了確認(rèn)目的thrA基因是否被分離出來，最好通過分析其堿基順序或限制性內(nèi)切酶切斷模式加以判定。已經(jīng)有關(guān)于E.coli的thrA基因的堿基順序的報(bào)導(dǎo)(Katinka，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，77,5730(1980))。
然后，通過使用P.Guerry等的方法(J.Bacteriol.，116,1064(1973))、D.B.Clewell的方法(J.Bacteriol.，110,667(1972))等，可以從上述菌株中分離出含有thrA基因的DNA被插入載體DNA得到的重組DNA。
分離thrABC操縱子全長時，必須從染色體DNA庫中再次選擇保留含有thrABC操縱子全長的重組DNA的轉(zhuǎn)化體，即，將得到的thrA基因作為探針(プロ-ブ)通過菌落雜交法進(jìn)行選擇。菌落雜交法按常規(guī)方法進(jìn)行(Molecular Cloning，第二版，Cold Spring HarborPress(1989))。
確認(rèn)thrABC操縱子全長是否被分離出來時，可以將分離出的候補(bǔ)DNA導(dǎo)入到缺損thrB基因的株中，確認(rèn)thrB基因的缺損得到恢復(fù)，進(jìn)而將分離出的候補(bǔ)DNA導(dǎo)入到缺損thrC基因的株中，如果能確認(rèn)出thrC基因的缺損得到恢復(fù)即可。缺損thrB基因的株有E.coli YA73株(thrB1000，thi-1，relA1，λ-，spoT1)。缺損thrC基因的株有E.coli Gif41株(thrC1001，thi-1，relA1，λ-，spoT1)。E.coli YA73株和E.coli Gif41株可以從E.coli GeneticStock Center(美國康涅狄格州)得到。
除此之外，在確認(rèn)thrABC操縱子全長是否被分離時，可以通過分析分離出的候補(bǔ)DNA的堿基順序或者限制性內(nèi)切酶切斷模式加以確認(rèn)。已經(jīng)有E.coli的thrB基因的堿基順序的報(bào)導(dǎo)(Cossart，P.等，Nucleic Acids Res.，9,339(1981))，E.coli的thrC基因的堿基順序也有報(bào)導(dǎo)(Parsot，C.等，Nucleic Acids Res.，11,7331(1983))。
野生型thrABC操縱子的獲得方法如下首先從染色體上有野生型thrABC操縱子的株按齋藤、三浦的方法等制備染色體DNA，然后按聚合酶連鎖反應(yīng)法(參照PCRPolymerase chain reaction；White，T.J.等；Trends Genet.5,185(1989))擴(kuò)增thrABC操縱子。用于擴(kuò)增反應(yīng)的DNA引物使用含有thrABC操縱子的全區(qū)域或一部分區(qū)域的DNA雙鏈的兩個3′末端的互補(bǔ)物。當(dāng)僅擴(kuò)增thrABC操縱子的一部分區(qū)域時，必須以該DNA片段作探針從染色體DNA庫篩選含有全區(qū)域的DNA片段。擴(kuò)增thrABC操縱子的全區(qū)域時，將含有DNA片段(該片段含有擴(kuò)增了的thrABC操縱子)的PCR反應(yīng)液提供給瓊脂糖凝膠電泳后，通過提取目的DNA片段可以回收含有thrABC操縱子的DNA片段。
DNA引物可以E.coli中已知的序列為基礎(chǔ)適當(dāng)?shù)刂瞥?。例如，Katinka，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，77,5730(1980)中報(bào)導(dǎo)了E.coli的thrA基因的堿基順序，Cossart，P.等，Nucleic Acids Res.，9,339(1981)中報(bào)導(dǎo)了E.coli的thrB基因的堿基順序，Parsot，C.等，Nucleic Acids Res.，11,7331(1983)中報(bào)導(dǎo)了E.coli的thrC基因的堿基順序。
引物DNA可以通過ホスホァミダイド法(參照TetrahedronLetters，22,1859(1981))，使用市售的DNA合成裝置(例如Applied Biosystems公司制的DNA合成機(jī)380B型等)進(jìn)行合成。另外，PCR反應(yīng)使用市售的PCR反應(yīng)裝置(パ-キンエルマ-公司制的DNA熱循環(huán)機(jī)PJ2000型等)，用Taq DNA聚合酶(寶酒造(株)供給)按照供給者指定的方法進(jìn)行。
用PCR法擴(kuò)增了的thrABC操縱子連接在埃希氏桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)可以自體復(fù)制的載體DNA上，通過導(dǎo)入到埃希氏桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，使得向thrA基因中導(dǎo)入變異等操作變得簡單。所使用的載體DNA和轉(zhuǎn)化方法以及thrABC操縱子存在的確認(rèn)方法與上述方法相同。
(2)向thrABC操縱子中導(dǎo)入變異在上述得到的thrABC操縱子中進(jìn)行氨基酸殘基的置換、插入及缺失等變異的方法有重組體PCR法(Higuchi，R.，61，PCR Technology(Erlich，H.A.Eds.，Stockton press(1989)))、部位特異的變異方法(Kramer，W.和Frits，H.J.，Meth.in Enzymol.，154,350(1987)；Kunkel，T.A.等，Meth.in Enzymol.，154,367(1987))等。使用這些方法，可以在目的部位引起所需的變異。
另外，若按照目的基因的化學(xué)合成方法可以向目的部位導(dǎo)入變異或者隨機(jī)的變異。
還有直接用羥胺處理染色體或質(zhì)粒上的thrABC操縱子的方法(Hashimoto，T.和Sekiguchi，M.，J.Bacteriol.，159,1039(1984))。也可以使用用紫外線照射保留thrABC操縱子的埃希氏桿菌屬細(xì)菌的方法或者用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍或亞硝酸等化學(xué)藥劑處理的方法。按照這些方法可以隨機(jī)地導(dǎo)入變異。
解除型thrABC操縱子的選擇方法如下首先直接用羥胺等將由含有thrABC操縱子的DNA片段和載體DNA構(gòu)成的重組DNA變異處理，用此方法(例如)轉(zhuǎn)化E.coli Gif106M1株。接著在含有L-蘇氨酸拮抗劑(例如α-氨基-β-羥基戊酸(AHV))的最少量培養(yǎng)基(例如M9)中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化株。由于保留含有野生型thrABC操縱子的重組DNA的株用其重組DNA表達(dá)的AKI-HDI受到AHV的抑制，所以L-高絲氨酸及二氨基庚二酸(DAP)的合成不能進(jìn)行，生長受到抑制。與此相反，保留含有thrABC操縱子(該操縱子含有編碼解除了L-蘇氨酸的抑制的AKI-HDI的thrA基因)的重組DNA的株由于該重組DNA中thrA基因所編碼的解除型AKI-HDI不受AHV的抑制，所以可以在添加了AHV的最少培養(yǎng)基中生長。利用這種現(xiàn)象，生長可以選擇對AHV具有抗藥性的株，也就是保留含有thrABC操縱子(該操縱子含有解除了抑制的解除型thrA基因)的重組DNA的株。
將得到的該解除型thrABC操縱子作為重組DNA導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗魑⑸镏?，通過使其表達(dá)，可以得到保留解除了反饋抑制的AKI-HDI、thrABC操縱子所編碼的L-蘇氨酸生物合成系的酶群的表達(dá)增強(qiáng)的微生物。宿主優(yōu)選屬于埃希氏桿菌屬的微生物，例如大腸桿菌(E.coli)。
另外，也可以使用從重組DNA中取出解除型thrABC操縱子并插入其他載體DNA所得到的微生物。在本發(fā)明中可以使用的載體DNA優(yōu)選質(zhì)粒載體DNA，例如pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等。此外，也可以利用噬菌體DNA的載體。
為了有效地進(jìn)行解除型thrABC操縱子的表達(dá)，也可以除去位于解除型thrABC操縱子上游位置的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域(操縱基因或減弱子(attenuator))。或者也可以連接lac、trp、PL等在微生物內(nèi)起作用的其他啟動子，還可以擴(kuò)增thrABC操縱子固有的啟動子后使用。
另外，如上所述，可以將解除型thrABC操縱子插入到能自體復(fù)制的載體DNA后，再導(dǎo)入宿主內(nèi)，作為質(zhì)粒類染色體外DNA保留在宿主內(nèi)，也可以通過利用轉(zhuǎn)導(dǎo)作用、易位子(Berg，D.E.和Berg，C.M.，Bio/Technol.，1,417(1983))、Mu噬菌體(特開平2-109985)或同源性重組(Experiments in Molecular Genetics，ColdSpring Habor Lab.(1972))的方法將thrABC操縱子編入宿主微生物的染色體內(nèi)。
2.含有實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的ilvA基因且除去了減弱作用所必需的區(qū)域的ilvGMEDA操縱子含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的蘇氨酸脫氨酶的ilvA基因的ilvGMEDA操縱子，即解除型ilvGMEDA操縱子，在所含的ilvA基因具有變異方面與野生型ilvGMEDA操縱子不同。此種變異是指解除了L-異亮氨酸對ilvA基因所編碼的TD的反饋抑制的變異。
含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的蘇氨酸脫氨酶的ilvA基因且除去了減弱作用所必需的區(qū)域的ilvGMEDA操縱子，即完全解除型ilvGMEDA操縱子，除解除型ilvGMEDA操縱子外，在導(dǎo)入不發(fā)生減弱的變異方面與野生型ilvGMEDA操縱子或解除型ilvGMEDA操縱子不同。此種變異是除去存在于ilvGMEDA操縱子的5′上游區(qū)域的減弱子全部、一部分或附近部分的變異，此外還包括在減弱子內(nèi)部插入新的DNA片段的變異。
取得解除型ilvGMEDA操縱子的方法如下。首先將含有野生型ilvGMEDA操縱子的DNA進(jìn)行體外變異處理，將變異處理后的DNA與適合宿主的載體DNA連接，得到重組DNA。將重組DNA導(dǎo)入宿主微生物后得到轉(zhuǎn)化體，若在所述轉(zhuǎn)化體中選擇可以表達(dá)解除型TD的轉(zhuǎn)化體，則該形質(zhì)轉(zhuǎn)化體可保留解除型ilvGMEDA操縱子。另外，將含有野生型ilvGMEDA操縱子的DNA與適合宿主的載體DNA連接，得到重組DNA，然后將重組DNA體外變異處理，將變異處理后的重組DNA導(dǎo)入宿主微生物，得到轉(zhuǎn)化體，在所述轉(zhuǎn)化體中選擇可以表達(dá)解除型TD的轉(zhuǎn)化體，該轉(zhuǎn)化體也可保留解除型ilvGMEDA操縱子。
將生產(chǎn)野生型TD的微生物變異處理，建立生產(chǎn)解除型TD的變異株后，也可由變異株取得解除型ilvGMEDA操縱子?；蛘撸瑢⑦B接有野生型ilvGMEDA操縱子的重組DNA導(dǎo)入后得到的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行變異處理，建立生產(chǎn)變異型TD的變異株后，由該變異株回收重組DNA時，可在該DNA上建立解除型ilvGMEDA操縱子。
用于體外變異處理DNA的藥劑有羥胺等。羥胺是通過將胞嘧啶變成N 4-羥基胞嘧啶而使胞嘧啶變異成胸腺嘧啶的化學(xué)變異處理劑。此外，在將微生物本身進(jìn)行變異處理時，可以使用用紫外線照射或用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)等通常人工突變中所使用的誘變劑進(jìn)行處理。
作為ilvGMEDA操縱子，可舉出來自埃希氏桿菌屬細(xì)菌、特別是來自大腸桿菌(E.coli)的ilvGMEDA操縱子。
利用來自埃希氏桿菌屬細(xì)菌的ilvGMEDA操縱子時，作為含有野生型ilvGMEDA操縱子的DNA供給菌，任何屬于埃希氏桿菌屬的微生物都可以使用。具體地說，可以使用Neidhart等的著作(Neidhardt，F(xiàn).C.等，Escherichia coli and Salmonella Typhimurium，American Society for Microbiology，Washington D.C.，1208，表1)中所列舉的微生物。用野生株作為含有ilvGMEDA操縱子的DNA供給菌時，可以得到含有野生型ilvGMEDA操縱子的DNA。
但是，E.coli作為野生型ilvGMEDA操縱子的DNA供給菌時，由于K12野生株的ilvG基因具有移碼變異，所以具有活性的乙酰羥基酸合酶的同功酶II(AHASII)不能表達(dá)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA78，922，1981)。因此，以K12株作為DNA供給菌時，為了使ilvG基因所編碼的乙酰羥基酸合酶II的活性恢復(fù)，必須在制備框架(frame)恢復(fù)變異株后，將該變異株作為供給菌使用?；蛘咭部梢詫碜訩12株以外的E.coli作為DNA供給菌，只分離ilvG基因，再將其導(dǎo)入來自K12株的ilvGMEDA操縱子中。也就是以K12株作為DNA供給菌分離出ilvMEDA部分，以來自K12株以外的E.coli作為DNA供給菌，只分離出ilvG基因，連接兩者得到全長的ilvGMEDA操縱子。另外，乙酰羥基酸合酶的同功酶II(AHASII)由大小兩個亞單元構(gòu)成，大亞單元被ilvG基因編碼，小亞單元被ilvM基因編碼。
獲得完全解除型ilvGMEDA操縱子的方法如下。
R.P.Lawther等報(bào)道了存在于ilvGMEDA操縱子的5′上游區(qū)域的減弱子的位置及堿基順序(Nucleic Acids Res.15，2137(1987))。以解除型ilvGMEDA操縱子作為起始原料，通過制備完全除去減弱子的ilvGMEDA操縱子，可得到完全解除型ilvGMEDA操縱子。
在序列表的序列號1中記載的堿基順序揭示了減弱作用所必需的區(qū)域。從999位至1007位的DNA序列編碼存在于領(lǐng)頭肽內(nèi)的纈氨酸殘基的連續(xù)部分，從1008位至1016位的DNA序列編碼存在于領(lǐng)頭肽內(nèi)的異亮氨酸殘基的連續(xù)部分。從1081位至1104位的DNA序列編碼形成存在于減弱子內(nèi)的低非依賴型終止區(qū)樣干/環(huán)(シュテム/ル-プ)的部分。
當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在足量的L-異亮氨酸時，由于從1081位至1104位的DNA序列轉(zhuǎn)錄的RNA形成了低非依賴型終止區(qū)樣干/環(huán)，所以RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄終止，ilvGMEDA操縱子不能表達(dá)。
細(xì)胞內(nèi)的L-異亮氨酸不足時，細(xì)胞內(nèi)異亮氨酸結(jié)合的tRNA不足，在編碼領(lǐng)頭肽的區(qū)域內(nèi)所存在的異亮氨酸殘基的連續(xù)部分通過核糖體的翻譯停止。為此，mRNA形成了新的立體結(jié)構(gòu)，其結(jié)果由1081位至1104位的DNA序列轉(zhuǎn)錄的RNA形成的低非依賴型終止區(qū)樣干/環(huán)不能形成。因此，可以進(jìn)行由RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄，ilvGMEDA操縱子得到表達(dá)。
因此，為了除去了減弱作用所必需的區(qū)域，只要除去序列表的序列號1公開的序列的1008位至1016位的DNA序列或者1081位至1104位的DNA序列即可。
可是，所謂除去了減弱作用所必需的區(qū)域是指導(dǎo)入不發(fā)生減弱的變異。因此，該變異并不只限于除去存在于ilvGMEDA操縱子的5′上游區(qū)域的減弱子全部。總之，也可以是減弱子不能形成低非依賴型終止區(qū)樣干/環(huán)的變異。在領(lǐng)頭肽內(nèi)也可以存在不含有異亮氨酸殘基的連續(xù)部分的變異。無論哪種情況，減弱作用均消失。
即，此種變異是，除去存在子ilvGMEDA操縱子的5′上游區(qū)域的減弱子全部、一部分或附近部分的變異，此外還包括在減弱子內(nèi)部插入新的DNA片段的變異。
另外，含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的蘇氨酸脫氨酶的ilvA基因且除去了減弱作用所必需的區(qū)域的ilvGMEDA操縱子，即完全解除型ilvGMEDA操縱子也可用以下方法得到，即將變異導(dǎo)入野生型ilvGMEDA操縱子中，使之不發(fā)生減弱，然后將變異導(dǎo)入含在該ilvGMEDA操縱子中的ilvA基因中，成為對該ilvA基因所編碼的蘇氨酸脫氨酶而言實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的操縱子。
(1)野生型ilvGMEDA操縱子的獲得在取得含有ilvGMEDA操縱子的DNA時，可以考慮分別取得ilvGM基因、ilvE基因、ilvD基因及ilvA基因，而后把它們連接起來的方法。
首先，培養(yǎng)具有野生型TD的E.coli，例如E.coli K12株、E.coli W3110株、E.coli MC1061株(以上的三個株的ilvG會引起移碼)、E.coli MI162株(thr-10，car-94，λ-，relA1，ilvG603，thi-1)、E.coliB株(以上的二株具有正常的ilvG)，得到培養(yǎng)物。培養(yǎng)上述微生物時，可以用通常的固體培養(yǎng)法培養(yǎng)，但是考慮到集菌時的效率，最好采用液體培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基可使用在酵母提取物、胨、胰酶解胨、或者肉提取物中加入氯化鈉(NaCl)得到的培養(yǎng)基。具體地說是L-肉汁(bact·胰酶解胨1％、bact·酵母提取物0.5％、NaCl 0.5％、葡萄糖0.1％，pH＝7.2)。培養(yǎng)基的初始pH調(diào)節(jié)到6～8較為適宜。培養(yǎng)在30～42℃、優(yōu)選在37℃左右通過通氣攪拌內(nèi)部培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)或靜置培養(yǎng)等方法進(jìn)行24小時。此外，E.coli MI162株可以從E.coli Genetic StockCenter(美國康涅狄格州)得到。該株的索引號是CGSC5919。該株的詳細(xì)性質(zhì)記載在Mol.Gen.Genet.143，243(1976)，J.Bacteriol.，149，294(1982)上。
將這樣得到的培養(yǎng)物在例如3000r.p.m.下離心分離5分鐘，可以得到E.coli的菌體。通過例如齋藤、三浦的方法(Biochem.Biophys.Acta.，72，619(1963))、K.S.Kirby的方法(Biochem.J.，64，405(1956))等方法可以由此菌體得到染色體DNA。
為了從這樣得到的染色體DNA中分離出ilvGMEDA操縱子，制備染色體DNA庫。首先用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶將染色體DNA部分分解，得到各種片段的混合物。例如，在30℃以上、優(yōu)選37℃和1～10單位/ml的酶濃度下使Sau3AI與染色體DNA作用不同時間(1分～2小時)，將其消化。
接著，將斷裂了的染色體DNA片段連接在可在埃希氏桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)自體復(fù)制的載體DNA上，制備重組DNA。具體地說，將產(chǎn)生與用于切斷染色體DNA的限制性內(nèi)切酶Sau3AI相同的末端堿基順序的限制性內(nèi)切酶(例如BamHI)在30℃以上溫度、1～100單位/ml酶濃度的條件下與載體DNA作用1小時以上、優(yōu)選1～3小時，將其完全消化、切斷。再將上述得到的染色體DNA片段混合物與斷裂的載體DNA混合，在4～16℃、1～100單位/ml酶濃度的條件下使其與DNA連接酶、優(yōu)選T4 DNA連接酶作用1小時以上、優(yōu)選6～24小時，得到重組DNA。
使用得到的重組DNA，將埃希氏桿菌屬的微生物，例如E.coliMI262株(leuB6，ilvI614，ilvH612，λ-，relA1，spoT1，ilvB619，ilvG603，ilvG605(am)，thi-1)類的乙酰羥基酸合酶缺損變異株、E.coli AB2070株(proA2，trp-3，hisG4，ilvE12，metE46，thi-1，ara-9，lacY1或lacZ4，galK2，malA1，mtl-1，rpsL8或rpsL9，ton-1，tsx-3，λR，λ-，supE44)類的轉(zhuǎn)氨基酶B缺損變異株、或者E.coli AB1280株(hisG1，ilvD16，metB1，argH1，thi-1，ara-13，lacY1或lacZ4，gal-6，xyl-7，mtl-2，malA1，rpsL8，9或17，tonA2，λR，λ-，supE44)類的二羥酸脫水酶缺損變異株、E.coli AB1255株(thi-1，ilvA201，argH1，metB1，hi sG1，lacY1或lacZ4，malA1，mtl-2，xyl-7，ara-13，gal-6，rpsL8，9或17，tonA2，tsx-5，λR，λ-，supE44)類的蘇氨酸脫氨酶缺損變異株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，制備染色體DNA庫。此轉(zhuǎn)化可通過D.M.Morrison的方法(Methods inEnzymology 68，326，1979)或用氯化鈣處理受體菌細(xì)胞以增加DNA的透過性的方法(Mandel，M.和Hi ga A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970)等來進(jìn)行。此外，E.coli MI262株可以從E.coli GeneticStock Center(美國康涅狄格州)得到。該株的索引號是CGSC5769。該株的詳細(xì)性質(zhì)記載在Mol.Gen.Genet.，156，1(1977)。E.coliAB2070株可以從E.coli Genetic Stock Center(美國康涅狄格州)得到。該株的索引號是CGSC2070。該株的詳細(xì)性質(zhì)記載在J.Bacteriol.，109，730(1972)。E.coli AB1280株可從E.coliGenetic Stock Center(美國康涅狄格州)得到。該株的索引號是CGSC1280。E.coli AB1255株可從E.coli Genetic StockCenter(美國康涅狄格州)得到。該株的索引號是CGSC1255。該株的詳細(xì)性質(zhì)記載在J.Bacteriol.，109，730(1972)。
可是，由于ilvGMEDA操縱子的全堿基順序是明確的(NucleicAcids Res.15，2137(1987))，所以通過選擇特定的限制性內(nèi)切酶消化染色體DNA，可以將含有目的基因的DNA片段切成特定的長度。只將具有此特定長度的DNA片段與載體DNA連接，制成重組DNA，用此重組DNA制成染色體DNA庫，可更有效地取得含有目的基因的DNA片段。
從得到的染色體DNA庫中選擇乙酰羥基酸合酶活性增大的株或者選擇可互補(bǔ)因乙酰羥基酸合酶基因缺損引起的營養(yǎng)缺陷的株，得到具有含ilvGM基因的重組DNA的菌株。
從得到的染色體DNA庫中選擇轉(zhuǎn)氨基酶B活性增大的株或者選擇可互補(bǔ)因轉(zhuǎn)氨基酶B基因缺損引起的營養(yǎng)缺陷的株，得到具有含ilvE基因的重組DNA的菌株。
從得到的染色體DNA庫中選擇二羥酸脫水酶活性增大的株或者選擇可互補(bǔ)因二羥酸脫水酶基因缺損引起的營養(yǎng)缺陷的株，得到具有含ilvD基因的重組DNA的菌株。
從得到的染色體DNA庫中選擇蘇氨酸脫氨酶活性增大的株或者選擇可互補(bǔ)因蘇氨酸脫氨酶基因缺損引起的營養(yǎng)缺陷的株，得到具有含ilvA基因的重組DNA的菌株。
確認(rèn)具有含ilvGM基因的重組DNA的候補(bǔ)株是否保留ilvGM基團(tuán)純株培養(yǎng)得到的重組DNA的方法如下由候補(bǔ)株制備細(xì)胞提取液，由此制備粗酶液后，確認(rèn)乙酰羥基酸合酶活性的增大。乙酰羥基酸合酶的酶活性的測定可以按照M.D.Felice等的方法進(jìn)行(Methods inEnzymology 166，241)。
另外，由于乙酰羥基酸合酶缺損變異株需要異亮氨酸、亮氨酸及纈氨酸，所以將乙酰羥基酸合酶缺損變異株用于宿主時，可以在不含有纈氨酸的最少培養(yǎng)基上分離出可以生長的菌株，通過由該菌株回收重組DNA，可得到含有ilvGM基因的DNA片段。
R.P.Lawther等報(bào)導(dǎo)了含有ilvGM基因的DNA的堿基順序(NucleicAcids Res.15，2137(1987))。因此可從候補(bǔ)株分離出重組DNA，解碼其堿基順序，通過與該報(bào)告中的堿基順序比較加以確認(rèn)。
如上所述，E.coli K12株的ilvG基因的解讀框架內(nèi)部產(chǎn)生變異。結(jié)果引起移碼，進(jìn)而由于中途出現(xiàn)終止密碼子而翻譯終止。即，從ilvG基因的開始密碼子的ATG(第1～3位)數(shù)到第982～984位，出現(xiàn)終止密碼子。因此，使用從該株取得的ilvGM基因時，有時必須通過サイト·ダイレクテイツド·ミュ-タジエネシス法使變異部分恢復(fù)正常。例如，對于大腸桿菌MI162株的ilvG基因(ilvG603)，在第982～984位的終止密碼子TGA前插入TG兩個堿基對后，框架恢復(fù)正常。J.Bacteriol.149，294(1982)的圖2詳細(xì)記載了其他基因。
具有含ilvE基因的重組DNA的候補(bǔ)株是否保留ilvE基因純株培養(yǎng)得到的重組DNA可按以方法確定。由于轉(zhuǎn)氨基酶B缺損變異株需要異亮氨酸，所以將轉(zhuǎn)氨基酶B缺損變異株用于宿主時，在不含有異亮氨酸的最少培養(yǎng)基上分離出可生長的菌株，通過從該菌株回收重組DNA可以得到含有ilvE基因的DNA片段。
R.P.Lawther等報(bào)導(dǎo)了含有ilvE基因的DNA的堿基順序(NucleicAcids Res.15，2137(1987))。因此，從候補(bǔ)株分離出重組DNA，解碼其堿基順序，通過與該報(bào)告中的堿基順序比較也可以確認(rèn)。
具有含ilvD基因的重組DNA的候補(bǔ)株是否保留ilvD基因純株培養(yǎng)得到的重組DNA可按以下方法加以確定。由于二羥酸脫水酶缺損變異株需要異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸，所以將二羥酸脫水酶缺損變異株用于宿主時，在不含有纈氨酸的培養(yǎng)基上分離出可生長的菌株，通過從該菌株回收重組DNA，可以得到含有ilvD基因的DNA片段。
R.P.Lawther等報(bào)導(dǎo)了含有ilvD基因的DNA的堿基順序(NucleicAcids Res.15，2137(1987))。因此，從候補(bǔ)株分離出重組DNA，解碼其堿基順序，通過與該報(bào)告中的堿基順序比較也可以確認(rèn)。
具有含ilvA基因的重組DNA的候補(bǔ)株是否保留ilvA基因純株培養(yǎng)得到的重組DNA可按以下方法確定。由候補(bǔ)株制備細(xì)胞提取液，由此制備粗酶液后，確認(rèn)蘇氨酸脫氨酶活性的增大。蘇氨酸脫氨酶的酶活性的測定方法記載在Methods in Enzymology 17B，555(1971)中。
另外，由于蘇氨酸脫氨酶缺損變異株需要異亮氨酸，所以將蘇氨酸脫氨酶缺損變異株用于宿主時，在不含有異亮氨酸的最少培養(yǎng)基上分離出能生長的菌株，通過從該菌株回收重組DNA，可以得到含有il vA基因的DNA片段。
R.P.Lawther等報(bào)導(dǎo)了含有ilvA基因的DNA的堿基順序(NucleicAcids Res.15，2137(1987))。因此，從候補(bǔ)株分離出重組DNA，解碼其堿基順序，通過與該報(bào)告中的堿基順序比較也可以確認(rèn)。
通過P.Guerry等的方法(J.Bacteriol.，116，1064(1973))、D.B.Clewell的方法(J.Bacteriol.，110，667(1972))等可以從上述各菌株中分離重組DNA。
分離ilvGMEDA操縱子全長時，將具有ilvGM基因的DNA片段、具有ilvE基因的DNA片段、具有ilvD基因的DNA片段及具有ilvA基因的DNA片段連接。連接時，可以參考R.P.Lawther等報(bào)導(dǎo)的ilvGMEDA操縱子全堿基順序(Nucleic Acids Res.15，2137(1987))。
野生型ilvGMEDA操縱子的獲得也可按齋藤、三浦的方法等由染色體上具有野生型ilvGMEDA操縱子的株制備染色體DNA，按聚合酶連鎖反應(yīng)法(參照PCRPolymerase Chain reaction；White，T.J.等；Trends Genet.5，185(1989))通過ilvGMEDA操縱子的擴(kuò)增來完成。用于擴(kuò)增反應(yīng)的DNA引物使用含有ilvGMEDA操縱子的全區(qū)域或者一部分區(qū)域的DNA雙鏈的兩個3′末端互補(bǔ)的引物。只是擴(kuò)增ilvGMEDA操縱子的一部分區(qū)域時，必須以該DNA片段作為探針從染色體DNA庫中篩選含有全區(qū)域的DNA片段。擴(kuò)增ilvGMEDA操縱子的全區(qū)域時，可將含有DNA片段(該片段含有擴(kuò)增了的ilvGMEDA操縱子)的PCR反應(yīng)液提供給瓊脂糖凝膠電泳，然后通過提取目的的DNA片段回收含有ilvGMEDA操縱子的DNA片段。
制備DNA引物時，可以參考R.P.Lawther等報(bào)導(dǎo)的E.Coli的ilvGMEDA操縱子全堿基順序(Nucleic Acids Res.15，2137(1987))。
引物DNA的合成可以按ホスホァミダイド法(參照TetrahedronLetters，22，1859(1981))等常規(guī)方法，使用市售的DNA合成裝置(例如Applied Biosystems公司制的DNA合成機(jī)380B型等)進(jìn)行。另外，PCR反應(yīng)可使用市售的PCR反應(yīng)裝置(パ-キンエルマ-公司制的DNA熱循環(huán)機(jī)PJ2000型等)，用Taq DNA聚合酶(寶酒造(株)提供)按提供者指定的方法進(jìn)行。
用PCR法擴(kuò)增了的ilvGMEDA操縱子連接在埃希氏桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)可自體復(fù)制的載體DNA上，通過導(dǎo)入埃希氏桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞，使得向ilvA基因?qū)胱儺惖牟僮骷俺? 減弱作用所必需的區(qū)域的操作變得簡單。所用的載體DNA和轉(zhuǎn)化方法以及ilvGMEDA操縱子存在的確認(rèn)方法與上述相同。
(2)向ilvGMEDA操縱子導(dǎo)入變異在上述得到的ilvGMEDA操縱子中進(jìn)行氨基酸殘基的置換、插入及缺失等變異的方法有重組體PCR法(Higuchi，R.，61，PCRTechnology(Erlich H.A.Eds.，Stockton press(1989)))、部位特異的變異方法(Kramer，W.和Frits，H.J.，Meth.inEnzymol.，154，350(1987)；Kunkel，T.A.等，Meth.in Enzymol.，154，367(1987))等。使用這些方法，可以在目的部位引起所需的變異。
另外，如果用化學(xué)方法合成目的基因，可以向目的部位導(dǎo)入變異或者隨機(jī)的變異。
還有直接用羥胺處理染色體或質(zhì)粒上的ilvGMEDA操縱子的方法(Hashimoto，T.和Sekiguchi，M.，J.Bacteriol.，159，1039(1984))?；蛘咭部梢允褂糜米贤饩€照射保留ilvGMEDA操縱子的埃希氏桿菌屬細(xì)菌的方法或者用N-甲基-N′-硝基-亞硝基胍或亞硝酸等化學(xué)藥劑處理的方法。用這些方法可隨機(jī)地導(dǎo)入變異。
按以下的方法選擇具有解除型ilvA基因的DNA片段。首先直接用羥胺等變異處理由含有ilvA基因的DNA片段和載體DNA構(gòu)成的重組DNA，用此方法轉(zhuǎn)化例如E.coli W3110株。接著在含有L-異亮氨酸的拮抗劑(例如適量的甘氨酰-L-亮氨酸)的最少培養(yǎng)基(例如M9)中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化株時，保留具有野生型ilvA基因的重組DNA的株有時不能合成L-異亮氨酸，生長受到抑制(載體上使用少量復(fù)制物，可以減少由基因劑量效果帶來的影響，所以較為合適)。與此相反，保留具有編碼解除了L-異亮氨酸的抑制的TD的ilvA基因的重組DNA的株，即使甘氨酰-L-亮氨酸存在時，由于過剩合成L-異亮氨酸，所以在添加了甘氨酰-L-亮氨酸的最少培養(yǎng)基上的生長應(yīng)該是可能的。利用此現(xiàn)象，生長可以選擇對甘氨酰-L-亮氨酸有抗藥性的株，即保留含有解除了抑制的解除型ilvA基因的重組DNA的株。
將含有這樣得到的解除型ilvA基因的解除型ilvGMEDA操縱子作為重組DNA導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗魑⑸镏校ㄟ^使其表達(dá)，可以得到保留解除了反饋抑制的TD、ilvGMEDA操縱子所編碼的L-異亮氨酸生物合成系的酶群的表達(dá)增強(qiáng)的微生物。宿主優(yōu)選屬于埃希氏桿菌屬的微生物，例如大腸桿菌(E.coli)。
另外，也可使用從重組DNA中取出解除型ilvGMEDA操縱子并插入其他載體DNA所得的微生物。可用于本發(fā)明的載體DNA優(yōu)選質(zhì)粒載體DNA，例如pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等。此外，也可以利用噬菌體DNA的載體。
進(jìn)而，為了有效地進(jìn)行解除型ilvGMEDA操縱子的表達(dá)，也可以除去位于解除型ilvGMEDA操縱子的上游位置的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域(操縱基因或減弱子)?；蛘咭部梢赃B接lac、trp、PL等在微生物內(nèi)起作用的其他啟動子，還可以擴(kuò)增ilvGMEDA操縱子固有的啟動子后使用。
另外，如上所述，可將插入了解除型ilvGMEDA操縱子的可自體復(fù)制的載體DNA導(dǎo)入宿主中，作為質(zhì)粒類染色體外DNA保留在宿主中，但也可以通過利用轉(zhuǎn)導(dǎo)作用、易位子(Berg，D.E.和Berg，C.M.，Bio/Technol.，1，417(1983))、Mu噬菌體(特開平2-109985)或同源性重組(Experiments in Molecular Genetics，ColdSpring Habor Lab.(1972))的方法將ilvGMEDA操縱子編入宿主微生物的染色體中。
(3)ilvGMEDA操縱子的減弱作用所必需區(qū)域的除去從ilvGMEDA操縱子中除去減弱作用所必需的區(qū)域，即在ilvGMEDA操縱子上導(dǎo)入不發(fā)生減弱的變異時，除了除去存在于ilvGMEDA操縱子的5′上游區(qū)域的減弱子全部、一部分或附近部分之外，也包括在減弱子內(nèi)部插入新的DNA片段。此處所稱“減弱子”是指形成低非依賴型終止區(qū)樣干/環(huán)的堿基序列，例如記載在序列表序列號1中的堿基序列的1081位至1104位的部分。
為了除去減弱子，制備處于ilvGMEDA操縱子的減弱子部分的上游的DNA片段，另外，制備處于ilvGMEDA操縱子的減弱子部分的下游的DNA片段，將兩者連接起來即可。例如，ilvGMEDA操縱子中處于減弱子部分的上游的DNA片段可以通過用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切斷含有完全長的ilvGMEDA操縱子的DNA片段來制備?；蛘咭部捎肞CR法擴(kuò)增處于ilvGMEDA操縱子中減弱子部分的上游的DNA片段。用于PCR法的引物DNA可以R.P.Lawther等報(bào)導(dǎo)的堿基順序(Nucleic Acids Res.15，2137(1987))、G.Coppola等報(bào)導(dǎo)的堿基順序(Gene 97，21(1991)為基礎(chǔ)進(jìn)行化學(xué)合成。進(jìn)而，也可以用化學(xué)方法合成處于ilvGMEDA操縱子的減弱子部分的上游的DNA片段。
ilvGMEDA操縱子中處于減弱子部分的下游的DNA片段的制備方法與上述相同。
以解除型ilvGMEDA操縱子為起始原料，通過制備除去減弱子的一部分或附近部分的ilvGMEDA操縱子，有時可以得到完全解除型ilvGMEDA操縱子。R.P.Lawther等報(bào)導(dǎo)了減弱子的位置及堿基順序(Nucleic Acids Res，15.2137(1987))，以此堿基順序?yàn)榛A(chǔ)可決定除去的DNA。
除去的DNA部分是減弱子形成低非依賴型終止區(qū)樣干/環(huán)所必需的DNA部分或含有編碼位于該干/環(huán)的上游的連續(xù)異亮氨酸殘基的適當(dāng)?shù)腄NA部分，或者優(yōu)選兩者。為了除去減弱子的一部分或附近部分，制備處于ilvGMEDA操縱子中被除去的DNA部分的上游的DNA片段以及處于ilvGMEDA操縱子中被除去的DNA部分的下游的DNA片段，將兩者連接起來即可。例如，處于ilvGMEDA操縱子中被除去的DNA部分的上游的DNA片段可以通過用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切斷含有完全長的ilvGMEDA操縱子的DNA片段來制備?；蛘咭部捎肞CR法擴(kuò)增處于ilvGMEDA操縱子中被除去的DNA部分的上游的DNA片段。PCR法中所使用的引物DNA可以R.P.Lawther等報(bào)導(dǎo)的堿基順序(Nucleic Acids Res.15，2137(1987))、G.Coppola等報(bào)導(dǎo)的堿基順序(Gene 97，21(1991))為基礎(chǔ)進(jìn)行化學(xué)合成。進(jìn)而也可以用化學(xué)合成法合成處于ilvGMEDA操縱子中被除去的DNA部分的上游的DNA片段。
處于ilvGMEDA操縱子中被除去的DNA部分的下游的DNA片段的制備方法與上述相同。
以解除型ilvGMEDA操縱子作為起始原料，通過制備在減弱子內(nèi)部插入了新DNA片段的ilvGMEDA操縱子，有時也能得到完全解除型ilvGMEDA操縱子。R.P.Lawther等或G.Coppola等報(bào)導(dǎo)了減弱子的位置及堿基順序，可以以此順序?yàn)榛A(chǔ)決定新的DNA片段的插入位置及插入的DNA片段的堿基順序。
插入的新DNA片段最好插入減弱子形成低非依賴型終止區(qū)樣干/環(huán)所必需的DNA部分或編碼位于該干/環(huán)的上游的連續(xù)異亮氨酸殘基的DNA部分。插入的結(jié)果，減弱子往往不能形成低非依賴型終止區(qū)樣干/環(huán)，因此可以預(yù)期減弱子機(jī)能消失。
插入的新DNA片段的堿基順序最好設(shè)計(jì)成在插入時減弱子不形成低非依賴型終止區(qū)樣干/環(huán)，以及在插入時該干/環(huán)的上游不存在連續(xù)異亮氨酸殘基。
為了在減弱子內(nèi)部插入新的DNA片段，制備處于ilvGMEDA操縱子中插入了新的DNA片段的DNA部分的上游的DNA片段。另外，制備處于ilvGMEDA操縱子中插入了新的DNA片段的DNA部分的下游的DNA片段，進(jìn)而制備插入的新的DNA片段，將三者連接起來即可。例如，處于ilvGMEDA操縱子中插入了新DNA片段的DNA部分的上游的DNA片段可以通過用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切斷含有完全長的ilvGMEDA操縱子的DNA片段進(jìn)行制備?；蛘咭部捎肞CR法擴(kuò)增處于ilvGMEDA操縱子中插入了新DNA片段的DNA部分的上游的DNA片段。用于PCR法的引物DNA可以R.P.Lawther等報(bào)導(dǎo)的堿基順序(Nucleic Acids Res.15，2137(1987))、G.Coppolo等報(bào)導(dǎo)的堿基順序(Gene 97，21(1991))為基礎(chǔ)進(jìn)行化學(xué)合成。進(jìn)而，也可以用化學(xué)合成法合成處于ilvGMEDA操縱子中插了新的DNA片段的DNA部分的上游的DNA片段。
處于ilvGMEDA操縱子中插入了新DNA片段的DNA部分的下游的DNA片段的制備方法與上述方法相同。
插入的新DNA片段可用化學(xué)合成方法制備。
另外，當(dāng)用PCR法擴(kuò)增處于ilvGMEDA操縱子中插入了新DNA片段的DNA部分的上游的DNA片段、或者處于ilvGMEDA操縱子中插入了新DNA片段的DNA部分的下游的DNA片段時，可以連接插入引物DNA的新DNA片段。例如，在為了擴(kuò)增處于ilvGMEDA操縱子中插入了新的DNA片段的DNA部分的上游的DNA片段而使用的3′側(cè)DNA引物上，連接插入的新DNA片段的一個鏈。同樣，在為了擴(kuò)增處于ilvGMEDA操縱子中插入了新的DNA片段的DNA部分的下游的DNA片段而使用的5′側(cè)DNA引物上，連接插入的新DNA片段的互補(bǔ)鏈。將用這些引物擴(kuò)增了的兩種DNA片段連接。
將這樣得到的完全解除型ilvGMEDA操縱子作為重組DNA導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)乃拗魑⑸镏?，通過使其表達(dá)，可以得到保留解除了反饋抑制的TD、且由于不產(chǎn)生減弱而使得ilvGMEDA操縱子所編碼的L-異亮氨酸生物合成系的酶群的表達(dá)更強(qiáng)的微生物。宿主例如屬于埃希氏桿菌屬的微生物，優(yōu)選大腸桿菌(E.coli)。
另外，也可以使用從重組DNA中取出完全解除型ilvGMEDA操縱子并將其插入到其他載體DNA得到的微生物。本發(fā)明中可以使用的載體DNA優(yōu)選質(zhì)粒載體DNA，例如pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等。此外，也可以利用噬菌體DNA的載體。
進(jìn)而，為了有效地進(jìn)行完全解除型ilvGMEDA操縱子的表達(dá)，也可以在完全解除型ilvGMEDA操縱子的上游連接lac、trp、PL等在微生物內(nèi)起作用的其他啟動子，也可以擴(kuò)增ilvGMEDA操縱子固有的啟動子后使用。
如上所述，可以將完全解除型ilvGMEDA操縱子插入到可自體復(fù)制的載體DNA并導(dǎo)入到宿主中，作為質(zhì)粒類染色體外DNA保留在宿主中，但也可以通過利用轉(zhuǎn)導(dǎo)作用、易位子(Berg.D.E.和Berg，C.M.，Bio/Technol.，1，417(1983))、Mu噬菌體(特開平2-109985)或者同源性重組(Experiments in Molecular Genetics，ColdSpring Habor Lab.(1972))的方法，將ilvGMEDA操縱子編入宿主微生物的染色體中。
可使用任何屬于埃希氏桿菌屬的微生物作為含有編碼AKIII的基因(lysC)的DNA的供給菌。具體地說，可使用Neidhardt等所著書(Neidhardt，F(xiàn).C.等，Escherichia coli and SalmonellaTyphimurium，American Society for Microbiology，WashingtonD.C.，1208，表1)中列舉的微生物。例如，E.coli JM109株、MG1061株等。
用野生株作為含有編碼AKIII的基因(lysC)的DNA的供給菌時，可得到含有野生型AKIII基因的DNA。欲向該基因中導(dǎo)入變異而得到解除了L-賴氨酸的反饋抑制的AKIII基因(lysC*)，可采取直接用羥胺處理DNA的體外變異處理法。羥胺是通過將胞嘧啶轉(zhuǎn)變成N4-羥基胞嘧啶而使胞嘧啶變異成胸腺嘧啶的化學(xué)變異處理劑。
另外，通過用解除了L-賴氨酸對AKIII活性的反饋抑制的變異株作為DNA供給菌，可以得到含有解除了L-賴氨酸的反饋抑制的AKIII基因的DNA。例如可從用常規(guī)的變異處理法、即用紫外線照射或用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(NTG)等誘變劑處理所得的變異株細(xì)胞群中得到該變異株。
下面說明含有編碼AKIII的基因(lysC)的DNA的制備。
首先，培養(yǎng)具有野生型lysC的E.coli(例如MC1061株)，得到培養(yǎng)物。培養(yǎng)上述微生物時，可用常規(guī)的固體培養(yǎng)法培養(yǎng)，但從集菌效率的觀點(diǎn)考慮，優(yōu)選采用液體培養(yǎng)法。作為培養(yǎng)基，例如可以使用在酵母提取物、胨、肉提取物、玉米漿或者大豆或小麥的浸出液等一種以上的氮源中，加入磷酸鉀、磷酸氫鉀、硫酸鎂、氯化鈉、氯化鎂、氯化鐵、硫酸鐵或硫酸錳等無機(jī)鹽中的一種以上，以及根據(jù)需要適當(dāng)?shù)丶尤胩穷愒稀⒕S生素等得到的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)節(jié)到7～8較為適宜。培養(yǎng)在30-42℃、優(yōu)選37℃左右用常規(guī)的攪拌內(nèi)部培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、靜置培養(yǎng)等進(jìn)行4-24小時。將這樣得到的培養(yǎng)物在例如3000r.p.m.下離心分離5分鐘，得到E.coliMC1061株的菌體。
可通過例如齋藤等的方法(Biochem.Biophys.Acta.，72,619(1963))、K.S.Kirby的方法(Biochem.J.，64，405(1956))等方法由該菌體得到染色體DNA。
lysC基因的分離方法如下。用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切斷用上述方法得到的染色體DNA。然后連接在埃希氏桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)可增殖的載體DNA，用得到的重組DNA使埃希氏桿菌屬微生物的天冬氨酸激酶I、II、III全缺損變異株(例如GT3)轉(zhuǎn)化(基因庫)，分離可在不含有賴氨酸的最少培養(yǎng)基上生長的菌株，由此可分離lysC基因的重組DNA。
具體地說，用限制性內(nèi)切酶(例如Sau3AI)在30℃以上溫度、優(yōu)選37℃和1-10單位/ml的酶濃度下與染色體DNA作用不同時間(1分鐘至2小時)，將其消化、部分分解，得到各種染色體DNA片段混合物。使一種限制性內(nèi)切酶(例如BamHI)與可于埃希氏桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)增殖的載體DNA在30℃以上溫度和1-100單位/ml的酶濃度下作用1小時以上、優(yōu)選1-3小時，將其完全消化，得到斷裂的DNA，其中所述限制性內(nèi)切酶可產(chǎn)生與切斷染色體DNA所用的限制性內(nèi)切酶Sau3AI相同的末端堿基順序。然后，將上述得到的含有來自E.coli MC1061株的含有l(wèi)ysC基因的DNA片段的混合物與斷裂的載體DNA混合，使DNA連接酶、優(yōu)選T4 DNA連接酶在4-16℃、1-100單位/ml的酶濃度下與之作用1小時以上、優(yōu)選6-24小時，得到重組DNA。
可在本發(fā)明中使用的載體DNA優(yōu)選質(zhì)粒載體DNA，例如pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、RSF1010等。也可使用噬菌體DNA的載體。為了有效地進(jìn)行目的基因的表達(dá)，也可使用lac、trp、PL等在微生物內(nèi)起作用的啟動子。這里所說的重組DNA還包括通過利用易位子(Berg，D.E.和Berg，C.M.，Bio/Technol.，1，417(1983))、Mu噬菌體(特開平2-109985號公報(bào))或同源性重組(Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring HaborLab.(1972))的方法將所述目的基因編入染色體所得的重組DNA。
用該重組DNA轉(zhuǎn)換例如大腸桿菌K12株、優(yōu)選GT3株，由AK活性增大的株或互補(bǔ)營養(yǎng)缺陷的株得到具有l(wèi)ysC基因的重組DNA的菌株。該轉(zhuǎn)化可按D.M.Morrison的方法(Methods in Enzymology 88，326，1979)或用氯化鈣處理受容菌細(xì)胞以增加DNA的透過性的方法(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))進(jìn)行。然后可通過例如P.Guerry等的方法(J.Bacteriol.，116，1064(1973))、D.B.Clewell的方法(J.Bacteriol.，110，667(1972))等由上述菌株中分離含有l(wèi)ysC基因的DNA被插入載體DNA所得的重組DNA。
確認(rèn)候補(bǔ)株是否保留lysC純株培養(yǎng)得到的重組DNA的方法如下制備細(xì)胞提取液，再由此制備粗酶液，然后確認(rèn)天冬氨酸激酶活性。天冬氨酸激酶的酶活性可按Stadtman等的方法(Stadtman，E.R.，Cohen，G.N.，LeBras，G.和Robichon-Szulmajster，H.，J.Biol.Chem.，236，2033(1961))進(jìn)行測定。
或者，lysC基因也可用下述方法得到由上述按齋藤等的方法等得到的染色體DNA按PCR法(參照Polymerase chain reaction；White，T.J.等；Trends Genet.，5，185(1989))擴(kuò)增lysC基因。擴(kuò)增所用的DNA引物使用含有l(wèi)ysC基因的全部區(qū)域或一部分區(qū)域的DNA雙鏈的兩個3′末端互補(bǔ)的引物。僅擴(kuò)增lysC基因的一部分區(qū)域時，必須以該DNA片段作引物由基因庫中篩選含有全區(qū)域的DNA片段。擴(kuò)增全部區(qū)域時，將該DNA片段供入瓊脂糖凝膠電泳后，通過取出目的帶，可回收含有l(wèi)ysC基因的DNA片段。
作為DNA引物，例如可以E.coli中已知的序列(Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.和Patte，J.C.，J.Biol.Chem.，261，1052(1986))為基礎(chǔ)適當(dāng)制成，但可擴(kuò)增編碼lysC基因的1347base的區(qū)域的5′-CTTCCCTTGTGCCAAGGCTG-3′(后面所示序列表的序列號6)和5′-GAATTCCTTTGCGAGCAG-3′(后面所示序列表的序列號7)兩種引物也適用。DNA的合成可使用Applied Biosystems公司制的“DNA合成機(jī)380B型”，用ホスホァミダイド法(參照Tetrahedron Letters，22，1859(1981))按常規(guī)方法進(jìn)行。PCR反應(yīng)用寶酒造公司制的“DNA熱循環(huán)機(jī)PJ2000型”，用Taq DNA聚合酶按提供者指定的方法進(jìn)行。
將用PCR法擴(kuò)增的lysC基因與可在埃希氏桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)增殖的載體DNA連接，導(dǎo)入埃希氏桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)。所用的載體DNA和轉(zhuǎn)化法以及l(fā)ysC的確認(rèn)方法與上述方法相同。
對得到的lysC進(jìn)行氨基酸置換、插入和缺失等變異的方法有重組體PCR法(Higuchi，R.，61，PCR Technology(Erlich，H.A.Eds.，Stockton Press(1989))、部位特異的變異法(Kramer，W.和Frits，H.J.，Meth.in Enzymol.，154，350(1987)和Kunkel，T.A.等，Meth.in Enzymol.，154，367(1987))等。用這些方法可在目的部位產(chǎn)生目的變異。另外，利用直接用羥胺處理染色體或質(zhì)粒上的目的基因DNA的方法(Hashimoto，T.和Sekiguchi，M.，J.Bacteriol.159，1039(1984))或者用紫外線照射保留該DNA的菌體或用N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍、亞硝酸等化學(xué)藥劑處理的常規(guī)方法、化學(xué)合成目的基因的方法等，都可以隨機(jī)地導(dǎo)入變異。
抑制解除型變異基因lysC*的獲得方法如下。首先，將變異處理得到的重組DNA轉(zhuǎn)化或AK完全缺損株，例如E.coli GT3株。然后在含有大量賴氨酸的最少培養(yǎng)基(例如M9)中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化株。由于保留具有野生型lysC的質(zhì)粒的株的唯一的AK受賴氨酸的抑制，故而不能合成蘇氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸和二氨基庚二酸(DAP)，生長受到抑制。與此相反，具有解除了賴氨酸的抑制的lysC*的質(zhì)粒的保留株在加入了大量賴氨酸的最少培養(yǎng)基中應(yīng)該是可能生長的。利用這種現(xiàn)象，生長可以選擇對賴氨酸或賴氨酸的類似物S-2-氨乙基半胱氨酸(ABC)有抗藥性的株，即具有解除了抑制的lysC*的質(zhì)粒的保留株。
將這樣得到的變異型基因作為重組DNA導(dǎo)入適當(dāng)?shù)奈⑸?宿主)中，通過使其表達(dá)，可得到保留解除了反饋抑制的AK的微生物。
生產(chǎn)蘇氨酸時，得到的lysC基因或變異型lysC基因(lysC*)被導(dǎo)入并擴(kuò)增的宿主的例子是上述埃希氏桿菌屬細(xì)菌的野生株，除此之外，滿足下述條件的菌均可作為宿主使用這樣得到的重組載體DNA的復(fù)制起點(diǎn)和lysC基因或變異型lysC基因(lysC*)發(fā)揮作用，重組載體DNA可以復(fù)制，且lysC基因或變異型lysC基因(lysC*)可以增強(qiáng)。最好的宿主是E.coli B-3996株。
3.用本發(fā)明方法制造L-異亮氨酸通過導(dǎo)入上述得到的解除型thrABC操縱子使之轉(zhuǎn)化，進(jìn)而在合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)保留解除型ilvGMEDA操縱子的埃希氏桿菌屬細(xì)菌，使L-異亮氨酸在該培養(yǎng)物中生產(chǎn)積累，從該培養(yǎng)物中采出L-異亮氨酸，可以高效地制造L-異亮氨酸。即，通過將解除型thrABC操縱子和解除型ilvGMEDA操縱子同時保留在埃希氏桿菌屬細(xì)菌中，可以高效地制造L-異亮氨酸。
進(jìn)而，通過導(dǎo)入上述得到的解除型thrABC操縱子使之轉(zhuǎn)化，進(jìn)而在合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)保留完全解除型ilvGMEDA操縱子的埃希氏桿菌屬細(xì)菌，使L-異亮氨酸在該培養(yǎng)物中生產(chǎn)積累，從該培養(yǎng)物中采出L-異亮氨酸，可以更高效地制造L-異亮氨酸。即，將解除型thrABC操縱子和完全解除型ilvGMEDA操縱子同時保留在埃希氏桿菌屬細(xì)菌中，可以更高效地制造L-異亮氨酸。
作為保留解除型thrABC操縱子的埃希氏桿菌屬細(xì)菌，可舉出含有解除型thrABC操縱子的DNA被編入染色體DNA并轉(zhuǎn)化的埃希氏桿菌屬細(xì)菌，或者將連接該DNA和在埃希氏桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)可自體復(fù)制的載體DNA構(gòu)成的重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)并使之轉(zhuǎn)化的埃希氏桿菌屬細(xì)菌等。
另一方面，通過將含有解除型ilvGMEDA操縱子的DNA導(dǎo)入埃希氏桿菌屬細(xì)菌中進(jìn)行轉(zhuǎn)化時，可將含有解除型ilvGMEDA操縱子的DNA編入染色體DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化，也可通過將連接含有解除型ilvGMEDA操縱子的DNA和在埃希氏桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)可自體復(fù)制的載體DNA構(gòu)成的重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
進(jìn)而，通過將含有完全解除型ilvGMEDA操縱子的DNA導(dǎo)入埃希氏桿菌屬細(xì)菌中進(jìn)行轉(zhuǎn)化時，可將含有完全解除型ilvGMEDA操縱子的DNA編入染色體DNA中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，也可通過將連接含有完全解除型ilvGMEDA操縱子的DNA和在埃希氏桿菌屬細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)可自體復(fù)制的載體DNA構(gòu)成的重組DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
將解除型thrABC操縱子和解除型ilvGMEDA操縱子兩者或解除型thrABC操縱子和完全解除型ilvGMEDA操縱子兩者同時導(dǎo)入埃希氏桿菌屬細(xì)菌中時，即使兩個操縱子均可被編在埃希氏桿菌屬細(xì)菌的染色體DNA上而被保留，也可在細(xì)胞內(nèi)作為染色體外DNA被保留在單一或分開的質(zhì)粒上。進(jìn)而，一個操縱子可被編在染色體DNA上而被保留，另一個操縱子可作為染色體外DNA被保留在細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒上。解除型thrABC操縱子和解除型ilvGMEDA操縱子或完全解除型ilvGMEDA操縱子以各自的質(zhì)粒形式保留在大腸桿菌屬細(xì)菌中時，優(yōu)選兩種質(zhì)粒不顯示不相容性且具有不同種類的復(fù)制起點(diǎn)。
將含有解除型thrABC操縱子的DNA及含有解除型ilvGMEDA操縱子的DNA導(dǎo)入埃希氏桿菌屬細(xì)菌時，兩個DNA的導(dǎo)入順序無關(guān)緊要。
將含有解除型thrABC操縱子的DNA及含有完全解除型ilvGMEDA操縱子的DNA導(dǎo)入埃希氏桿菌屬細(xì)菌時，兩個DNA的導(dǎo)入順序無關(guān)緊要。
作為宿主使用的埃希氏桿菌屬細(xì)菌只要滿足下述條件即可為了使其細(xì)胞內(nèi)的解除型thrABC操縱子、解除型ilvGMEDA操縱子及完全解除型ilvGMEDA操縱子的啟動子或它們的基因表達(dá)的其他啟動子發(fā)揮作用，進(jìn)而所述操縱子中的任何一個作為染色體外DNA導(dǎo)入到質(zhì)粒上時，用于導(dǎo)入的載體DNA的復(fù)制起點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用而能夠復(fù)制。將解除型thrABC操縱子解除型ilvGMEDA操縱子或完全解除型ilvGMEDA操縱子以各自的質(zhì)粒的形式保留在埃希氏桿菌屬細(xì)菌中時，兩種質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)必須同時發(fā)揮作用。
用本發(fā)明的微生物生產(chǎn)L-異亮氨酸可用通常的微生物培養(yǎng)方法進(jìn)行。
所用的培養(yǎng)基只要含有碳源、氮源、無機(jī)物，必要時含有適當(dāng)量的所用菌株生長需要的營養(yǎng)源，無論合成培養(yǎng)基還是天然培養(yǎng)基都可以。
作為碳源，可舉出以葡萄糖為主的各種糖類、以丙酮酸為主的各種有機(jī)酸。另外，根據(jù)所使用的微生物的可利用性，可使用乙醇、甘油等醇類物質(zhì)。
氮源可使用氨、硫酸銨等各種酸的銨鹽及胺類以外的氮化合物以及胨、大豆水解產(chǎn)物、發(fā)酵菌體分解物等天然氨源。
無機(jī)物可使用磷酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、碳酸鈣等。
培養(yǎng)在振蕩培養(yǎng)、通氣攪拌培養(yǎng)等有氧條件下進(jìn)行，培養(yǎng)溫度為20～40℃，優(yōu)選30～38℃。培養(yǎng)基的pH為5～9，優(yōu)選6.5～7.2。培養(yǎng)基的pH可通過氨、碳酸鈣、各種酸、各種堿、緩沖液等進(jìn)行調(diào)節(jié)。
通常培養(yǎng)1～3日，L-異亮氨酸積累在培養(yǎng)液中。
培養(yǎng)結(jié)束后，可用離心分離、膜分離法除去培養(yǎng)液中的菌體等固形物，通過離子交換法、濃縮法、結(jié)晶法等回收L-異亮氨酸。
下面說明本發(fā)明的實(shí)施例。
實(shí)施例1 pMWD5的構(gòu)建從大腸桿菌MI162株提取染色體DNA。用限制性內(nèi)切酶HindIII切斷該染色體DNA。判明含有ilvGM基因的HindIII-HindIII DNA片段的長度為4.8kb。因此，將長度為4.8kb左右的HindIII-HindIII DNA片段和用HindIII切斷由寶酒造公司購入的質(zhì)粒載體pBR322得到的DNA片段連接。將得到的DNA混合物導(dǎo)入乙酰羥基酸合酶缺損株——大腸桿菌MI262株。轉(zhuǎn)化后，選擇乙酰羥基酸合酶缺損的性狀的互補(bǔ)株，分離該株保留的質(zhì)粒。分析該質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在pBR322的HindIII部位插入了含有ilvGM基因的4.8kb的DNA片段。將該質(zhì)粒命名為pBRGM7。
以Gene 97，21(1991)、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78，922(1981)和J.Bacteriol.149，294(1982)報(bào)導(dǎo)的堿基順序作為參數(shù)，合成了序列表中序列號2及序列號3記載的合成低聚核苷酸DNA。以兩個DNA作為引物，以MI162株的染色體DNA作為模板，用PCR法進(jìn)行DNA的擴(kuò)增。擴(kuò)增的DNA片段是具有序列表中序列號1記載的堿基順序中第25位到952位的序列的DNA片段。將該片段作為片段(A)。
同樣，以Gene 97，21(1991)、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78，922(1981)和J.Bacteriol.149，294(1982)報(bào)導(dǎo)的堿基順序作為參考，合成了序列表中序列號4及序列號5記載的合成低聚核苷酸DNA。以兩個DNA作為引物，以MI162株的染色體DNA作為模板，用PCR法擴(kuò)增DNA。擴(kuò)增的DNA片段是具有序列表中序列號1記載的堿基順序中第1161位至2421位的序列的DNA片段。將該片段作為片段(B)。
將用SmaI消化片段(A)得到的大片段和用SmaI消化pUC18(寶酒造)得到的DNA片段連接，得到質(zhì)粒pUCA。將用KpnI消化片段(B)得到的大片段和用HincII及KpnI消化pHSG399(寶酒造)得到的大片段連接，得到質(zhì)粒pHSGB。
用KpnI消化質(zhì)粒pUCA，用DNA聚合酶I的大片段(クレノ-片段)將斷裂端平滑末端化，進(jìn)而用PstI消化，最終分離含有片段(A)的DNA片段。用HindIII消化質(zhì)粒pHSGB，用DNA聚合酶I的大片段(クレノ-片段)將斷裂端平滑末端化，進(jìn)而用PstI消化，最終分離含有片段(B)的NA片段。連接兩個DNA片段，作成質(zhì)粒pHSGSK。
將攜帶在pHSGSK上的來自片段(A)及片段(B)的SmaI-KpnI片段命名為片段(C)。片段(C)相當(dāng)于用SmaI和KpnI切斷含有ilvGM基因的4.8kb的HindIII-HindIII片段所得到的片段，含有啟動子、SD序列及ilvG基因的上游區(qū)域，但缺少由領(lǐng)頭序列到減弱子區(qū)域的序列約0.2kb。將以上構(gòu)建pHSGSK的步驟表示在

圖1中。
將用SmaI和KpnI消化質(zhì)粒pHSGSK得到的片段(C)與用SmaI和KpnI消化質(zhì)粒pBRGM7得到的大DNA片段連接。將得到的質(zhì)粒命名為pdGM1。攜帶在pdGM1上的含有ilvGM基因的4.6kb的HindIII-HindIII片段缺少減弱作用所必需的區(qū)域。將缺少減弱作用所必需的區(qū)域的ilvGM基因在本實(shí)施例及圖中表示為“ΔattGM”。將構(gòu)建pdGN1的步驟表示在圖2中。
特開平2-458號公報(bào)記載的質(zhì)粒pDRIA4是通過將可用埃希氏桿菌屬細(xì)菌自體復(fù)制且可用短桿細(xì)菌屬細(xì)菌自體復(fù)制的シヤトル載體pDR1120和含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的蘇氨酸脫氨酶的ilvA基因的BamHI-BamHI片段結(jié)合來制備的。另外，該BamHI-BamHI片段在特開平2-458號公報(bào)中為2.3kb，但現(xiàn)在表明為2.75kb。質(zhì)粒pDRIA4存在于黃色短桿菌J12358(FERM BP-5087)或者黃色短桿菌J12359(FERM BP-5088)的染色體DNA外。可用通常方法由這些株制備質(zhì)粒pDRIA4。
在質(zhì)粒pDRIA4上的BamHI-BamHI 2.3kb的DNA片段中，制備含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的蘇氨酸脫氨酶的ilvA基因的HindIII-BamHI片段，并與用HindIII及BamHI切斷載體pMW119(日本基因社制)得到的DNA片段連接，將這樣制得的質(zhì)粒命名為pMWA1。在本實(shí)施例及圖中將編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的蘇氨酸脫氨酶的ilvA基因表示為“A*”。
將用HindIII切斷質(zhì)粒pMWA1后得到的DNA片段與用HindIII切斷質(zhì)粒pdGM1得到的含有ilvGM基因的DNA片段連接。通過分析存在于質(zhì)粒上的限制性內(nèi)切酶識別部位的位置，選擇ilvGM基因的轉(zhuǎn)錄方向和ilvA基因的轉(zhuǎn)錄方向相同者，將其命名為質(zhì)粒pMWGMA2。將構(gòu)建pMWGMA2的步驟表示在圖3中。
制備大腸桿菌MI162株的染色體DNA，用SalI及PstI將其切斷，制備DNA片段混合物。另一方面，用SalI及PstI切斷載體pUC19(寶酒造社)，制備DNA片段。連接DNA片段混合物及切斷pUC19得到的DNA片段，得到DNA混合物。將該DNA混合物導(dǎo)入到轉(zhuǎn)氨基酶B缺損的AB2070株中，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，選擇支鏈氨基酸需要性恢復(fù)的株。在由該株制備質(zhì)粒時，將用SalI及PstI切斷質(zhì)粒pUC19得到的DNA片段和含有ilvE基因的SalI-PstI DNA片段連接。將該質(zhì)粒命名為pUCE1。
用HindIII部分消化pMWGA2，制備DNA片段混合物。另一方面，用HindIII切斷pUCE1，制備含有一部分ilvE基因和一部分ilvD基因的1.7kb的HindIII-HindIII DNA片段。使用連接兩者得到的DNA混合物轉(zhuǎn)化二羥酸脫水酶(ilvD基因產(chǎn)物)缺損的AB1280株，選擇被轉(zhuǎn)化株中支鏈氨基酸需要性消失的株。由該轉(zhuǎn)化株制備質(zhì)粒時，將僅用存在于ΔattGN和A*之間的HindIII部位切斷pMWGMA2得到的DNA片段與含有來自pUCE1的ilvE基因的一部分與一部分ilvD基因的1.7kb的HindIII-HindIIIDNA片段連接，再生ilvGMEDA質(zhì)粒。將這樣得到的質(zhì)粒命名為pMWD5。構(gòu)建pMWD5的步驟表示在圖4中。
如上述得到的質(zhì)粒pMWD5是以pMW119作為載體攜帶含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的TD的ilvA基因且除去了減弱作用所必需的區(qū)域的ilvGMEDA操縱子的質(zhì)粒。
實(shí)施例2 L-異亮氨酸生產(chǎn)菌株的制造將由實(shí)施例1得到的質(zhì)粒pMWD5用常規(guī)氯化銣法導(dǎo)入到特表平3-501682號公報(bào)及USP 5，175，107記載的L-蘇酸氨生產(chǎn)菌大腸桿菌B-3996株中。在由pMWD5轉(zhuǎn)化得到的株中，選擇對100μg/ml鏈霉素和100μg/ml氨芐青霉素同時具有抗藥性的轉(zhuǎn)化株。將得到的轉(zhuǎn)化株命名為AJ12919株。
L-蘇氨酸生產(chǎn)菌大腸桿菌B-3996株以登記號1867保存在原蘇聯(lián)抗生素研究院(the USSR Antibiotics Research Institute)中。B-3996株的宿主菌是大腸桿菌TDH-6株，缺損thrC基因，在5mgml的L-蘇氨酸存在下可以增殖，缺失蘇氨酸脫氫酶活性，ilvA基因具有滲漏變異。而且B-3996株保留著質(zhì)粒pVIC40，該質(zhì)粒是thrABC操縱子被來自廣宿主域載體RSF1010的載體攜帶而得到的，其中thrABC操縱子含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-蘇氨酸的抑制的AKI-HDI的thrA基因。因此，保留質(zhì)粒pVIC40和質(zhì)粒pMWD5的大腸桿菌AJ12919株是通過質(zhì)粒載體保留thrABC操縱子和ilvGMEDA操縱子的株，其中thrABC操縱子含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-蘇氨酸的抑制的AKI-HDI的thrA基因，ilvGMEDA操縱子含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的TD的ilvA基因且除去了減弱作用所必需的區(qū)域。
實(shí)施例3 用AJ12919株生產(chǎn)L-異亮氨酸的試驗(yàn)(1)用由實(shí)施例2得到的AJ12919株進(jìn)行L-異亮氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)試驗(yàn)。在由1％bact·胰酶解胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、1.5％瓊脂、100μg/ml鏈霉素、100μg/ml氨芐青霉素組成的培養(yǎng)基上涂布AJ12919株，在37℃下培養(yǎng)18～24小時后，將其中一部分用白金環(huán)接種在20ml發(fā)酵培養(yǎng)基(4％葡萄糖、1.6％硫酸銨、0.1％磷酸二氫鉀、0.1％硫酸鎂七水合鹽、0.001％硫酸亞鐵七水合鹽、0.001％硫酸錳五水合鹽、0.2％酵母提取物、3％碳酸鈣，pH7.0)中，在37℃下振蕩培養(yǎng)24小時。用高速液相色譜法測定除去菌體的培養(yǎng)上清液中的L-異亮氨酸及L-蘇氨酸的濃度。結(jié)果表示在表1中。
(表1)菌株 L-異亮氨酸濃度(g/l)L-蘇氨酸濃度(g/l)AJ 1291910 0實(shí)施例4 用AJ12919株生產(chǎn)L-異亮氨酸的試驗(yàn)(2)將AJ12919株在與實(shí)施例3相同的瓊脂培養(yǎng)基中在37℃下培養(yǎng)24小時后，接種在含有300ml與實(shí)施例3相同組成的發(fā)酵培養(yǎng)基的1升發(fā)酵槽中，在400rpm攪拌速度、300ml/分通氣量、37℃下培養(yǎng)16小時，得到種培養(yǎng)液。將30ml得到的種培養(yǎng)液接種在含有250ml由6％葡萄糖、1.6％硫酸銨、0.1％磷酸二氫鉀、0.1％硫酸鎂七水合鹽、0.001％硫酸亞鐵七水合鹽、0.001％硫酸錳五水合鹽、0.2％酵母提取物組成的發(fā)酵培養(yǎng)基(pH7.0)的1升發(fā)酵槽中，在37℃、300ml/分通氣量下，一邊控制攪拌數(shù)，使培養(yǎng)基中的溶存氧濃度達(dá)5％以上，一邊適當(dāng)?shù)毓┙o葡萄糖，用氨氣維持pH值在7.0左右，培養(yǎng)進(jìn)行23小時。用高速液相色譜法測定除去菌體的培養(yǎng)上清液中的L-異亮氨酸濃度。結(jié)果表明，培養(yǎng)上清液中L-異亮氨酸的積累量為39g/升。
實(shí)施例5 L-異亮氨酸生產(chǎn)菌種的制備(2)在國際公開專利WO94/11517號公報(bào)中，公開了從保藏在原蘇聯(lián)抗菌素研究院(登記號1867)的L-蘇氨酸生產(chǎn)菌B-3996株保留的質(zhì)粒pVIC40和保藏在日本工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(登記號FERMP-13136，國際保藏號FERM BP-4462)的編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-賴氨酸的抑制的AKIII的lysC基因攜帶質(zhì)粒(PLLC*80)，構(gòu)建含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-蘇氨酸的抑制的AKI-HDI的thrA基因的thrABC操縱子和編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-賴氨酸的抑制的AKIII的lysC基因被來自廣宿主域載體RSF1010的載體攜帶得到的質(zhì)粒pVICLC*80A的方法，以及將該質(zhì)粒pVICLC*80A導(dǎo)入B-3996株的宿主B-399株(TDH-6株)得到的L-蘇氨酸生產(chǎn)菌。
在將質(zhì)粒pVICLC*80A導(dǎo)入B-3996株的宿主B-399株(TDH-6株)所得的L-蘇氨酸生產(chǎn)菌中，用常規(guī)氯化銣法導(dǎo)入由實(shí)施例1得到的質(zhì)粒pMWD5。在由pMWD5轉(zhuǎn)化而成的株中，選擇對100μg/ml鏈霉素和100μg/ml氨芐青霉素同時具有抗藥性的轉(zhuǎn)化株。將得到的轉(zhuǎn)化株命名為AJ13100株。
AJ13100株的宿主菌是大腸桿菌TDH-6株(B-399株)，缺損thrC基因，在5mg/ml的L-蘇氨酸存在下可以增殖，缺失蘇氨酸脫氫酶活性，ilvA基因具有滲漏變異。而且AJ13100株保留著質(zhì)粒pVICLC*80A和實(shí)施例1得到的質(zhì)粒pMWD5，質(zhì)粒pVICLC*80A是thrABC操縱子和lysC基因被來自廣宿主域載體RSF1010的載體攜帶而得到的，其中thrABC操縱子含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-蘇氨酸的抑制的AKI-HDI的thrA基因，lysC基因編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-賴氨酸的抑制的AKIII。因此，大腸桿菌AJ13100株是通過質(zhì)粒載體保留thrABC操縱子、lysC基因和ilvGMEDA操縱子的株，其中thrABC操縱子含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-蘇氨酸的抑制的AKI-HDI的thrA基因，lysC基因編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-賴氨酸的抑制的AKIII，ilvGMEDA操縱子含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的TD的ilvA基因且除去了減弱作用所必需的區(qū)域。
實(shí)施例5中所用的TDH-6株(B-399株)已保藏在原蘇聯(lián)商業(yè)微生物保藏中心(位于USSR Research Institute of Geneticsand Selection of Commercial Microorganism，保藏號BKIIMB-3420)。
實(shí)施例6 由AJ13100株生產(chǎn)L-異亮氨酸的試驗(yàn)用實(shí)施例5得到的AJ13100株進(jìn)行L-異亮氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)試驗(yàn)。在由1％bact·胰酶解胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、1.5％瓊脂、100μg/ml鏈霉素、100μg/ml氨芐青霉素組成的培養(yǎng)基上涂布AJ13100株，在37℃下培養(yǎng)18～24小時后，將其中一部分用白金環(huán)接種在20ml發(fā)酵培養(yǎng)基(4％葡萄糖、1.6％硫酸銨、0.1％磷酸二氫鉀、0.1％硫酸鎂七水合鹽、0.001％硫酸亞鐵七水合鹽、0.001％硫酸錳五水合鹽、0.2％酵母提取物、3％的碳酸鈣，pH7.0)中，在37℃下振蕩培養(yǎng)24小時。按同樣方法培養(yǎng)由實(shí)施例2得到的AJ12919株。用高速液相色譜法測定除去菌體的培養(yǎng)上清液中的L-異亮氨酸及L-蘇氨酸的濃度。結(jié)果表示在表2中。
(表2)菌株 L-異亮氨酸濃度(g/l)L-蘇氨酸濃度(g/l)AJ 12919 100AJ 13100 120由于含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-蘇氨酸的抑制的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I的thrA基因的thrABC操縱子被攜帶在多復(fù)制的質(zhì)粒上進(jìn)行擴(kuò)增，所以本發(fā)明的具有L-異亮氨酸生產(chǎn)性的埃希氏桿菌屬細(xì)菌 可生物合成足量的L-異亮氨酸的前體物質(zhì)——L-蘇氨酸。進(jìn)而，由于含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的蘇氨酸脫氨酶的ilvA基因且除去了減弱作用所必需的區(qū)域的ilvGMEDA操縱子被攜帶在復(fù)數(shù)復(fù)制的質(zhì)粒上進(jìn)行擴(kuò)增，故可高效地將L-蘇氨酸變換成L-異亮氨酸。
若使用含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的蘇氨酸脫氨酶的ilvA基因且除去了減弱作用所必需的區(qū)域的ilvGMEDA操縱子，可以使來自ilvGM基因、ilvE基因、ilvD基因及ilvA基因的L-異亮氨酸生物合成系的酶群平衡地產(chǎn)生。由于轉(zhuǎn)錄用原來的啟動子進(jìn)行，所以能高效率地進(jìn)行。
一般認(rèn)為，使用多復(fù)制的質(zhì)粒，只增加含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的蘇氨酸脫氨酶的ilvA基因的ilvGMEDA操縱子的基因量，可解除ilvGMEDA操縱子的轉(zhuǎn)錄水平的負(fù)控制，充分改善L-異亮氨酸的生產(chǎn)性?？墒窃诒旧暾埖陌l(fā)明中，通過進(jìn)一步除去 減弱作用所必需的區(qū)域，意外成功地進(jìn)一步改善了L-異亮氨酸的生產(chǎn)性。
序列表序列號(SEQ ID NO)1序列長度2841序列類型核酸(nucleic acid)鏈數(shù)雙鏈(double)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈形(linear)序列種類染色體DNA起源生物名大腸桿菌(Escherichia coli)株名MI162序列的特征表示特征的符號CDS存在位置957..1055決定特征的方法S表示特征的符號減弱子存在位置1081..1104決定特征的方法S表示特征的符號CDS存在位置1195..2841決定特征的方法S表示特征的符號斷裂部位(SmaI)存在位置52..57決定特征的方法S表示特征的符號斷裂部位(KpnI)
存在位置2395..2400決定特征的方法S序列CTCGCTTTCC TTGTTCCTGA CCGATAACAT CACTGAGATC ATGTTGTAGC GCCCGGGATA 60CTGCATCAGT TGGTTTCGGG CGTTCGAGAG CGTGCTTACC TTCCAGAAAC GCACAGACAG120CTTGCAGATG ATCGGCTATC AGGCATCCTT CACCGTTAAT TAGCCCCACT TCATCTTCGT180TATCTTTCGC GACGATAATT TTTCTGCCCG ACTTAATAGC TTCAGTTGCA CTGGAGATTG240CGCCGGGAAC GCCACGCAGA GCGCCTGTAA GCGCCAGTTC TCCGACTAAT TCATATTCAT300CTAACTTATT GGCTGTAAGC TGTTCTGAGG CCGCCAGCAA CGCAATGGCG ATAGGTAAAT360CATATCGTCC CCCTTCTTTT GGCAGATCAG CTGGAGCCAG GTTGATGGTG ATTTTTTTCG420CCGGATATTC ATATCCGCTA TTGATAATGG CGCTGCGCAC GCGATCGCGA GCTTCTTTTA480CCGTTGTTTC TGGTAAGCCC ACCATCGTTA AGCCGGGTAG ACCTTTACTG ATATGTACCT540CAACAGTGAT CGGGGGCGCA TTTACTCCCA GGGCTGCGCG GGTATGAACA ATTGACAGTG600ACATAAGCCC TCCTTGAGTC ACCATTATGT GCATAAGATA TCGCTGCTGT AGCCCGCTAA660TTCGTGAATT TTAGTGGCTG ATTCCTGTTT ATTTGTGCAA GTGAAGTTGA GTTGTTCTGG720CGGTGGAATG ATGCTCGCAA AAATGCAGCG GACAAAGGAT GAACTACGAG GAAGGGAACA780ACATTCATAC TGAAATTGAA TTTTTTTCAC TCACTATTTT ATTTTTAAAA AACAACAATT840TATATTGAAA TTATTAAACG CATCATAAAA ATCGGCCAAA AAATATCTTG TACTATTTAC900AAAACCTATG GTAACTCTTT AGGCATTCCT TCGAACAAGA TGCAAGAAAA GACAAA956ATG ACA GCC CTT CTA CGA GTG ATT AGC CTG GTC GTG ATT AGC GTG GTG 1004Met Thr Ala Leu Leu Arg Val Ile Ser Leu Val Val Ile Ser Val Val1 5 10 15GTG ATT ATT ATC CCA CCG TGC GGG GCT GCA CTT GGA CGA GGA AAG GCT 1052Val Ile Ile Ile Pro Pro Cys Gly Ala Ala Leu Gly Arg Gly Lys Ala20 25 30TAGAGATCAA GCCTTAACGA ACTAAGACCC CCGCACCGAA AGGTCCGGGG GTTTTTTTTG1112ACCTTAAAAA CATAACCGAG GAGCAGACAA TGAATAACAG CACAAAATTC TGTTTCTCAA1172GATTCAGGAC GGGGAACTAA CT ATG AAT GGC GCA CAG TGG GTG GTA CAT GCG 1224Met Asn Gly Ala Gln Trp Val Val His Ala1 5 10TTG CGG GCA CAG GGT GTG AAC ACC GTT TTC GGT TAT CCG GGT GGC GCA 1272Leu Arg Ala Gln Gly Val Asn Thr Val Phe Gly Tyr Pro Gly Gly Ala15 20 25ATT ATG CCG GTT TAC GAT GCA TTG TAT GAC GGC GGC GTG GAG CAC TTG 1320Ile Met Pro Val Tyr Asp Ala Leu Tyr Asp Gly Gly Val Glu His Leu30 35 40CTA TGC CGA CAT GAG CAG GGT GCG GCA ATG GCG GCT ATC GGT TAT GCT 1368Leu Cys Arg His Glu Gln Gly Ala Ala Met Ala Ala Ile Gly Tyr Ala45 50 55CGT GCT ACC GGC AAA ACT GGC GTA TGT ATC GCC ACG TCT GGT CCG GGC 1416Arg Ala Thr Gly Lys Thr Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly60 65 70GCA ACC AAC CTG ATA ACC GGG CTT GCG GAC GCA CTG TTA GAT TCC ATC 1464Ala Thr Asn Leu Ile Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser Ile75 80 85 90CCT GTT GTT GCC ATC ACC GGT CAA GTG TCC GCA CCG TTT ATC GGC ACT 1512Pro Val Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Ser Ala Pro Phe Ile Gly Thr95 100 105GAC GCA TTT CAG GAA GTG GAT GTC CTG GGA TTG TCG TTA GCC TGT ACC 1560Asp Ala Phe Gln Glu Val Asp Val Leu Gly Leu Ser Leu Ala Cys Thr110 115 120AAG CAT AGC TTT CTG GTG CAG TCG CTG GAA GAG TTG CCG CGC ATC ATG 1608Lys His Ser Phe Leu Val Gln Ser Leu Glu Glu Leu Pro Arg Ile Met125 130 135GCT GAA GCA TTC GAC GTT GCC TGC TCA GGT CGT CCT GGT CCG GTT CTG 1656Ala Glu Ala Phe Asp Val Ala Cys Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu140 145 150GTC GAT ATC CCA AAA GAT ATC CAG TTA GCC AGC GGT GAC CTG GAA CCG 1704Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Leu Ala Ser Gly Asp Leu Glu Pro155 160 165 170TGG TTC ACC ACC GTT GAA AAC GAA GTG ACT TTC CCA CAT GCC GAA GTT 1752Trp Phe Thr Thr Val Glu Asn Glu Val Thr Phe Pro His Ala Glu Val175 180 185GAG CAA GCG CGC CAG ATG CTG GCA AAA GCG CAA AAA CCG ATG CTG TAC 1800Glu Gln Ala Arg Gln Met Leu Ala Lys Ala Gln Lys Pro Met Leu Tyr190 195 200GTT GGC GGT GGC GTG GGT ATG GCG CAG GCA GTT CCG GCT TTG CGT GAA 1848Val Gly Gly Gly Val Gly Met Ala Gln Ala Val Pro Ala Leu Arg Glu205 210 215TTT CTC GCT GCC ACA AAA ATG CCT GCC ACC TGT ACG CTG AAA GGG CTG 1896Phe Leu Ala Ala Thr Lys Met Pro Ala Thr Cys Thr Leu Lys Gly Leu220 225 230GGC GCA GTA GAA GCA GAT TAT CCG TAC TAT CTG GGC ATG CTG GGG ATG 1944Gly Ala Val Glu Ala Asp Tyr Pro Tyr Tyr Leu Gly Met Leu Gly Met235 240 245 250CAC GGC ACC AAA GCG GCA AAC TTC GCG GTG CAG GAG TGT GAC CTG CTG 1992His Gly Thr Lys Ala Ala Asn Phe Ala Val Gln Glu Cys Asp Leu Leu255 260 265ATC GCC GTG GGC GCA CGT TTT GAT GAC CGG GTG ACC GGC AAA CTG AAC 2040Ile Ala Val Gly Ala Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Asn270 275 280ACC TTC GCG CCA CAC GCC AGT GTT ATC CAT ATG GAT ATC GAC CCG GCA 2088Thr Phe Ala Pro His Ala Ser Val Ile His Met Asp Ile Asp Pro Ala285 290 295GAA ATG AAC AAG CTG CGT CAG GCA CAT GTG GCA TTA CAA GGT GAT TTA 2136Glu Met Asn Lys Leu Arg Gln Ala His Val Ala Leu Gln Gly Asp Leu300 305 310AAT GCT CTG TTA CCA GCA TTA CAG CAG CCG TTA AAT CAA TGT GAC TGG 2184Asn Ala Leu Leu Pro Ala Leu Gln Gln Pro Leu Asn Gln Cys Asp Trp315 320 325 330CAG CAA CAC TGC GCC CAG CTG CGT GAT GAA CAT TCC TGG CGT TAC GAC 2232Gln Gln His Cys Ala Gln Leu Arg Asp Glu His Ser Trp Arg Tyr Asp335 340 345CAT CCC GGT GAC GCT ATC TAC GCG CCG TTG TTG TTA AAA CAA CTG TCG 2280His Pro Gly Asp Ala Ile Tyr Ala Pro Leu Leu Leu Lys Gln Leu Ser350 355 360GAT CGT AAA CCT GCG GAT TGC GTC GTG ACC ACA GAT GTG GGG CAG CAC 2328Asp Arg Lys Pro Ala Asp Cys Val Val Thr Thr Asp Val Gly Gln His365 370 375CAG ATG TGG GCT GCG CAG CAC ATC GCC CAC ACT CGC CCG GAA AAT TTC 2376Gln Met Trp Ala Ala Gln His Ile Ala His Thr Arg Pro Glu Asn Phe380 385 390ATC ACC TCC AGC GGT TTA GGT ACC ATG GGT TTT GGT TTA CCG GCG GCG 2424Ile Thr Ser Ser Gly Leu Gly Thr Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala395 400 405 410GTT GGC GCA CAA GTC GCG CGA CCG AAC GAT ACC GTT GTC TGT ATC TCC 2472Val Gly Ala Gln Val Ala Arg Pro Asn Asp Thr Val Val Cys Ile Ser415 420 425GGT GAC GGC TCT TTCATG ATG AAT GTG CAA GAG CTG GGC ACC GTA AAA 2520Gly Asp Gly Ser Phe Met Met Asn Val Gln Glu Leu Gly Thr Val Lys430 435 440CGC AAG CAG TTA CCG TTG AAA ATC GTC TTA CTC GAT AAC CAA CGG TTA 2568Arg Lys Gln Leu Pro Leu Lys Ile Val Leu Leu Asp Asn Gln Arg Leu445 450 455GGG ATG GTT CGA CAA TGG CAG CAA CTG TTT TTT CAG GAA CGA TAC AGC 2616Gly Met Val Arg Gln Trp Gln Gln Leu Phe Phe Gln Glu Arg Tyr Ser460 465 470GAA ACC ACC CTT ACT GAT AAC CCC GAT TTC CTC ATG TTA GCC AGC GCC 2664Glu Thr Thr Leu Thr Asp Asn Pro Asp Phe Leu Met Leu Ala Ser Ala475 480 485 490TTC GGC ATC CAT GGC CAA CAC ATC ACC CGG AAA GAC CAG GTT GAA GCG 2712Phe Gly Ile His Gly Gln His Ile Thr Arg Lys Asp Gln Val Glu Ala495 500 505GCA CTC GAC ACC ATG CTG AAC AGT GAT GGG CCA TAC CTG CTT CAT GTC 2760Ala Leu Asp Thr Met Leu Asn Ser Asp Gly Pro Tyr Leu Leu His Val510 515 520TCA ATC GAC GAA CTT GAG AAC GTC TGG CCG CTG GTG CCG CCT GGC GCC 2808Ser Ile Asp Glu Leu Glu Asn Val Trp Pro Leu Val Pro Pro Gly Ala525 530 535AGT AAT TCA GAA ATG TTG GAG AAA TTA TCA TGA 2841Ser Asn Ser Glu Met Leu Glu Lys Leu Ser540 545序列號(SEQ ID NO)2序列長度22序列類型核酸(nucleic acid)鏈數(shù)單鏈(single)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈形(linear)序列的起源其他核酸 合成DNA序列TAACATCACT GAGATCATGT TG序列號(SEQ ID NO)3序列長度21序列類型核酸(nucleic acid)鏈數(shù)單鏈(single)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈形(linear)序列的起源其他核酸 合成DNA序列TCTTTTCTTG CATCTTGTTC G序列號(SEQ ID NO)4序列長度22序列類型核酸(nucleic acid)鏈數(shù)單鏈(single)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈形(linear)序列的起源其他核酸 合成DNA序列TCTGTTTCTC AAGATTCAGG AC序列號(SEQ ID NO)5序列長度19序列類型核酸(nucleic acid)鏈數(shù)單鏈(single)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈形(linear)序列的起源其他核酸 合成DNA序列CGCCGGTAAA CCAAAACCC序列號(SEQ ID NO)6序列長度20序列類型核酸(nucleic acid)鏈數(shù)單鏈(single)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈形(linear)序列的起源其他核酸 合成DNA序列CTTCCCTTGT GCCAAGGCTG序列號(SEQ ID NO)7序列長度18序列類型核酸(nucleic acid)鏈數(shù)單鏈(single)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)直鏈形(linear)序列的起源其他核酸 合成DNA序列GAATTCCTTT GCGAGCAG附圖的簡要說明圖1表示質(zhì)粒pHSGSK的構(gòu)建步驟。
圖1中所用的省略符號中，H表示存在于DNA上的HindIII切斷部位。同樣，P表示PstI切斷部位，K表示KpnI切斷部位，B表示BamHI切斷部位，X表示XbaI切斷部位，Sm表示SmaI切斷部位。&表示不能由限制性內(nèi)切酶再切斷。
P→表示啟動子。SD表示シヤイン·ダルガノ序列。ATG表示翻譯開始密碼子。TGA表示翻譯終止密碼子。
Ap是賦予轉(zhuǎn)化株對氨芐青霉素的抗藥性的標(biāo)記基因。Cm是賦予轉(zhuǎn)化株對氯霉素的抗藥性的標(biāo)記基因。
圖2表示除去了ilvGMEDA操縱子的減弱作用所必需的區(qū)域的ilvGM基因及質(zhì)粒pdGM1的構(gòu)建步驟。
圖2中所用的省略符號與圖1中所用的省略符號的意義相同。
圖3表示質(zhì)粒pMWGMA2的構(gòu)建步驟。
圖3中所用的省略符號與圖1中所用的省略符號的意義相同。
圖4表示質(zhì)粒pMWD5的構(gòu)建步驟。
圖4中所用的省略符號與圖1中所用的省略符號的意義相同。此外，S表示SaII切斷部位，par表示質(zhì)粒的穩(wěn)定化區(qū)域。
權(quán)利要求
1.具有L-異亮氨酸生產(chǎn)性的埃希氏桿菌屬細(xì)菌，其特征是保留含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-蘇氨酸的抑制的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I的thrA基因的thrABC操縱子和含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的蘇氨酸脫氨酶的ilvA基因且除去了減弱作用所必需的區(qū)域的ilvGMEDA操縱子。
2.權(quán)利要求1所述的埃希氏桿菌屬細(xì)菌，其特征是將上述thrABC操縱子和上述ilvGMEDA操縱子保留在質(zhì)粒上。
3.權(quán)利要求2所述的埃希氏桿菌屬細(xì)菌，其特征是保留攜帶上述thrABC操縱子的質(zhì)粒(A)和攜帶上述ilvGMEDA操縱子的質(zhì)粒(B)兩種質(zhì)粒。
4.權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)所述的埃希氏桿菌屬細(xì)菌，其中上述的ilvGMEDA操縱子具有記載在序列表中序列號1上的DNA序列的953位至1160位缺損的DNA序列。
5.權(quán)利要求4所述的埃希氏桿菌屬細(xì)菌，其中上述兩種質(zhì)粒中，質(zhì)粒(A)是pVIC40，質(zhì)粒(B)是pMWD5。
6.權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)所述的埃希氏桿菌屬細(xì)菌，其中上述的埃希氏桿菌屬細(xì)菌是大腸桿菌。
7.權(quán)利要求6所述的大腸桿菌，其特征是宿主株缺損thrC基因，在5mg/ml的L-蘇氨酸存在下可以增殖，缺失蘇氨酸脫氫酶活性，ilvA基因具有滲漏變異，并且保留含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-蘇氨酸的抑制的AKI-HDI的thrA基因的thrABC操縱子和含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的TD的ilvA基因且除去了減弱作用所必需的區(qū)域的ilvGMEDA操縱子。
8.權(quán)利要求7所述的大腸桿菌，它是大腸桿菌AJ12919株。
9.用發(fā)酵法制造L-異亮氨酸的方法，其特征是在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1-8的任何一項(xiàng)所述的埃希氏桿菌屬細(xì)菌，使L-異亮氨酸在該培養(yǎng)基中生成積累，而后從該培養(yǎng)基中采出L-異亮氨酸。
10.具有L-異亮氨酸生產(chǎn)性的埃希氏桿菌屬細(xì)菌，其特征是保留含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-蘇氨酸的抑制的天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶I的thrA基因的thrABC操縱子和編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-賴氨酸的抑制的天冬氨酸激酶III的lysC基因以及含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的蘇氨酸脫氨酶的ilvA基因且除去了減弱作用所必需的區(qū)域的ilvGMEDA操縱子。
11.權(quán)利要求10所述的埃希氏桿菌屬細(xì)菌，其特征是將上述thrABC操縱子和上述lysC基因以及上述ilvGNEDA操縱子保留在質(zhì)粒上。
12.權(quán)利要求11所述的埃希氏桿菌屬細(xì)菌，其特征是保留攜帶上述thrABC操縱子和上述lysC基因的質(zhì)粒(C)和攜帶上述ilvGMEDA操縱子的質(zhì)粒(B)兩種質(zhì)粒。
13.權(quán)利要求10-12中任何一項(xiàng)所述的埃希氏桿菌屬細(xì)菌，其中上述的ilvGMEDA操縱子具有記載在序列表中序列號1上的DNA序列的953位至1160位缺損的DNA序列。
14.權(quán)利要求13所述的埃希氏桿菌屬細(xì)菌，其中上述兩種質(zhì)粒中，質(zhì)粒(C)是pVICLC*80A，質(zhì)粒(B)是pMWD5。
15.權(quán)利要求10-14中任何一項(xiàng)所述的埃希氏桿菌屬細(xì)菌，其中上述的埃希氏桿菌屬細(xì)菌是大腸桿菌。
16.權(quán)利要求15所述的大腸桿菌，其特征是宿主株缺損thrC基因，在5mg/ml的L-蘇氨酸存在下可以增殖，缺失蘇氨酸脫氫酶活性，ilvA基因具有滲漏變異，并且保留含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-蘇氨酸的抑制的AKI-HDI的thrA基因的thrABC操縱子和編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-賴氨酸的抑制的AKIII的lysC基因以及含有編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-異亮氨酸的抑制的TD的ilvA基因且除去了減弱作用所必需的區(qū)域的ilvGMEDA操縱子。
17.權(quán)利要求16所述的大腸桿菌，它是大腸桿菌AJ13100株。
18.用發(fā)酵法制造L-異亮氨酸的方法，其特征是在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求10-17中任何一項(xiàng)所述的埃希氏桿菌屬細(xì)菌，使L-異亮氨酸在該培養(yǎng)基中生成積累，而后從培養(yǎng)基中采出L-異亮氨酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了用發(fā)酵法以更高收率廉價制造L-異亮氨酸的方法，亦提供了以更高收率廉價制造用于輸液用氨基酸等用途的L-異亮氨酸的制造方法。本發(fā)明包括屬于埃希氏桿菌屬、保留解除型thrABC操縱子和完全解除型ilvGMEDA操縱子的L-異亮氨酸生產(chǎn)性微生物；屬于埃希氏桿菌屬、保留上述thrABC操縱子、上述ilvGMEDA操縱子和編碼實(shí)質(zhì)上解除了L-賴氨酸的抑制的天冬氨酸激酶III的lysC基因的L-異亮氨酸生產(chǎn)性微生物；以及用上述微生物通過發(fā)酵法制造L-異亮氨酸的方法。
文檔編號C12N15/52GK1117524SQ9510662
公開日1996年2月28日 申請日期1995年5月30日 優(yōu)先權(quán)日1994年5月30日
發(fā)明者橋口賢一, 岸野浩子, 辻本信晴, 松本裕 申請人:味之素株式會社