專利名稱：一種桿線蟲的培養(yǎng)方法及其培養(yǎng)器的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種生物培養(yǎng)技術，更具體地說，是涉及一種桿線蟲的培養(yǎng)方法及其
培養(yǎng)器。
背景技術：
生活變得豐裕，空閑時間增多，用大片草地構成的高爾夫球場和足球場等建設正逐漸增加著，綠色農產物栽培面積也在增加。為了幫助這樣的草地和農作物生長，防治病害，正在使用大部分為有機合成農藥的各種肥料和殺蟲劑等，降雨過后噴灑的毒性農藥隨著周邊的河流和地下水流出成為環(huán)境污染的主犯直接威脅著人類的健康。據此，上訴有機合成農藥的噴灑被限制，但反面，病蟲害等比級數增加，導致了高爾夫球場和農作物的損失逐年遞增的實情。特別是對上面所說的草地產生傷害的害蟲中加害草根部的金龜子幼蟲蠐螬類的防治很困難所以導致了殺蟲劑的過度使用，中國高爾夫球場里發(fā)現(xiàn)的有害金龜子有東方麗金龜，中華弧麗金龜，紅腳平爪觸金龜，茶色金龜的幼蟲，共有8屬12種。一般土壤下 IOcm 內外棲息的東方_金龜(Blitopertha orientalis Waterhouse) 和中華弧麗金龜(Papillia guadriguttata Fabricius)等金龜子類為主要害蟲,密度高的地方每立方米有120-150只，地上發(fā)現(xiàn)不了導致預查困難，更加難以防治的實情。上述金龜子類的幼蟲時期攝食活躍對草的根部產生傷害，繁育完全成熟的草地， 即使受到金龜子的傷害也不會在表面變現(xiàn)出來，但是草地休眠期過后下一年春天到來受害區(qū)域的草便不會生長，這個時期以受害區(qū)域為重點實行防治的話為時已晚，金龜子已經處于向其它區(qū)域移動中，預查和防治真的十分困難?，F(xiàn)今對于金龜子類的防治是使用有機磷系，合成擬除蟲菊酯系等有機農藥，害蟲對象在土壤底下攝食所以使用上苦難點很多，誘發(fā)幼蟲對藥劑的抗藥性，使得草地自我防御變弱等問題很嚴峻，特別是大的高爾夫球場采用部分灌注處理的方法來防治，這是非常無效率的，也不經濟的方法。為了克服這些利用昆蟲病原性線蟲的生物學方面的防治開始興起，在國際上存在很多專利，但是大部分昆蟲病原性線蟲中屬線蟲(Steinernema)科的蟲生線蟲 (carpocapsae)和格式線蟲(glaseri)，利用它們來達到防治效果，但只限于使用在溫室等一些局限的場所，大量培養(yǎng)難度大，農民們也逐漸有避諱使用的趨勢。由于寄主特殊性導致殺蟲率和生存率過低，作為防治劑的自身作用得不到充分發(fā)揮，而且沒有可以大量培養(yǎng)的基礎知識，生產速率低，導致了需求預測變得不可能，生產工程上要求高費用，大量生產難度變大，因此液體大量培養(yǎng)方法的研究就變得非常急切。

發(fā)明內容
本發(fā)明就是針對上述問題，提供了一種既環(huán)保，又可以大規(guī)模培養(yǎng)的桿線蟲的培養(yǎng)方法及其培養(yǎng)器。為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案，其在培養(yǎng)中不斷進行氧氣傳遞。具體的培養(yǎng)步驟為，(I)首先將培養(yǎng)基在溫度為115°C 125°C，壓強為14 16psi的條件下滅菌15 30min，然后將殺菌后的培養(yǎng)基冷卻到25 28°C ；(2)將名稱為Photorahabdus. spp的線蟲共生菌接種到上述培養(yǎng)基中，接種量為 IXlO9 2X 109cfu/mL培養(yǎng)基，在溫度為20 25°C，轉速為200 250rpm的條件下培養(yǎng)2 5天；(3)將桿線蟲(Heterorhabditis megidis)接種到步驟⑵得到的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，接種量為4000 5000只/ml培#液，在溫度為20 25°C，轉速為200 250rpm的條件下培養(yǎng)8 14天，培養(yǎng)體系中不斷進行氧氣的置換，確保體系的氧氣傳遞速率為O. 6
O.7mmo1 02/L · min。步驟(I)中所述的培養(yǎng)基的組成為，IL蒸餾水中，含細菌用胰蛋白胨17g，細菌用朊間質蛋白胨3g,細菌用乳糖蛋白胨IOg,氯化鈉5g,細菌用膽汁鹽I. 5g。步驟(3)的培養(yǎng)液中加入了玉米油，加入量為20 60g/ml培養(yǎng)液。培養(yǎng)器包括筒體、葉輪、氧氣傳遞裝置、水循環(huán)裝置和Do探頭，葉輪和氧氣傳遞裝置設置在筒體內，水循環(huán)裝置設置在筒體外側，Do探頭設置在筒體的底部并伸入到筒體內； Do探頭可向計算機輸出信號用以計算氧氣傳遞速率，進而用來監(jiān)測體系中的氧氣傳遞速率是否符合要求。氧氣傳遞裝置由供氧裝置和兩個串聯(lián)的曝氣裝置組成，供氧裝置位于筒體的內側壁上，曝氣裝置位于筒體的內底部，曝氣裝置上設置了透氣孔。透氣孔的外徑為Imm,內徑為O. 7mm,長度為5cm。所述的葉輪為為兩翼的漿型葉輪，下層葉輪和筒體內底面的距離為8 12cm。筒體內還設置了隔板，筒體底部還設置了溫度計和PH探頭。筒體外徑是15cm，內徑是13cm，厚度是1cm，高是36cm，漿型葉輪的直徑是6cm，高是 IOcnio本發(fā)明的有益效果本發(fā)明操作簡單，可進行大規(guī)模的培養(yǎng)，Iml培養(yǎng)基中，4000只桿線蟲經培養(yǎng)后， 可達到200-400X 103只。同時，經實驗驗證，將本發(fā)明培養(yǎng)出來的桿線蟲用到高爾夫球場后，對高爾夫草坪，樹木，農作物的根部產生傷害的蠐螬類害蟲的殺蟲率可以達到95%。更重要的是，本發(fā)明在培養(yǎng)過程中不會產生有害的物質，不會造成環(huán)境的污染，是環(huán)保型的培養(yǎng)方法。


圖I為本發(fā)明培養(yǎng)器的結構示意圖。圖I中，I為pH探頭,2為溫度計,3為Do探頭,4為水循環(huán)裝置,5為隔板,6為筒體，7為葉輪，8為供氧裝置，9為氧氣傳遞裝置，10為曝氣裝置。圖2為培養(yǎng)后的桿線蟲外觀圖，b為a的放大圖。
具體實施例方式培養(yǎng)器包括筒體、葉輪、氧氣傳遞裝置、水循環(huán)裝置和Do探頭，葉輪和氧氣傳遞裝置設置在筒體內，水循環(huán)裝置設置在筒體外側，Do探頭設置在筒體的底部并伸入到筒體內； Do探頭可向計算機輸出信號用以計算氧氣傳遞速率，進而用來監(jiān)測體系中的氧氣傳遞速率是否符合要求。氧氣傳遞裝置由供氧裝置和兩個串聯(lián)的曝氣裝置組成，供氧裝置位于筒體的內側壁上，曝氣裝置位于筒體的內底部，曝氣裝置上設置了透氣孔。透氣孔的外徑為Imm,內徑為O. 7mm,長度為5cm。所述的葉輪為為兩翼的漿型葉輪，下層葉輪和筒體內底面的距離為8 12cm。筒體內還設置了隔板，筒體底部還設置了溫度計和PH探頭。筒體外徑是15cm，內徑是13cm，厚度是1cm，高是36cm，漿型葉輪的直徑是6cm，高是 IOcnio實施例I(I)首先在培養(yǎng)器中，將培養(yǎng)基在溫度為115°C，壓強為14psi的條件下滅菌 30min，然后利用水循環(huán)裝置將殺菌后的培養(yǎng)基冷卻到25°C，培養(yǎng)基的組成為，IL蒸餾水中，含細菌用胰蛋白胨17g，細菌用朊間質蛋白胨3g，細菌用乳糖蛋白胨10g，氯化鈉5g，細菌用膽汁鹽1.5g；(2)將名稱為Photorahabdus. spp的線蟲共生菌接種到上述培養(yǎng)基中，接種量為 I X 109cfu/mL±if#*,在溫度為25°C，轉速為250rpm的條件下培養(yǎng)5天；(3)將桿線蟲(Heterorhabditis megidis)接種到步驟⑵得到的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，接種量為4000只，加入玉米油，在溫度為25°C，轉速為250rpm 的條件下培養(yǎng)10天，培養(yǎng)體系中，利用供氧裝置不斷進行氧氣的置換，確保體系的氧氣傳遞速率為O. 6m mo I 02/L · min，同時用Do探頭對體系中的氧氣傳遞速率進行檢測，進行調節(jié)，培養(yǎng)后桿線蟲達到200X 103/mL。實施例2(I)首先在培養(yǎng)器中，將培養(yǎng)基在溫度為125°C，壓強為15psi的條件下滅菌 20min，然后利用水循環(huán)裝置將殺菌后的培養(yǎng)基冷卻到28°C，培養(yǎng)基的組成為，IL蒸餾水中，含細菌用胰蛋白胨17g，細菌用朊間質蛋白胨3g，細菌用乳糖蛋白胨10g，氯化鈉5g，細菌用膽汁鹽1.5g；(2)將名稱為Photorahabdus. spp的線蟲共生菌接種到上述培養(yǎng)基中，接種量為 2X 109cfu/mL##s，在溫度為20°C，轉速為200rpm的條件下培養(yǎng)3天；(3)將桿線蟲(Heterorhabditis megidis)接種到步驟⑵得到的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，接種量為5000只，加入玉米油，在溫度為20°C，轉速為200rpm 的條件下培養(yǎng)14天，培養(yǎng)體系中，利用供氧裝置不斷進行氧氣的置換，確保體系的氧氣傳遞速率為O. 7m mo I 02/L · min,同時用DO探頭對體系中的氧氣傳遞速率進行檢測，進行調節(jié)，培養(yǎng)后桿線蟲達到400X 103/mL。實施例3(I)首先在培養(yǎng)器中，將培養(yǎng)基在溫度為120°C，壓強為16psi的條件下滅菌15min，然后利用水循環(huán)裝置將殺菌后的培養(yǎng)基冷卻到26°C，培養(yǎng)基的組成為，IL蒸餾水中，含細菌用胰蛋白胨17g，細菌用朊間質蛋白胨3g，細菌用乳糖蛋白胨10g，氯化鈉5g，細菌用膽汁鹽1.5g；(2)將名稱為Photorahabdus. spp的線蟲共生菌接種到上述培養(yǎng)基中，接種量為
I.5X 109cfu/mL_s，在溫度為23°C，轉速為230rpm的條件下培養(yǎng)2天；(3)將桿線蟲(Heterorhabditis megidis)接種到步驟⑵得到的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，接種量為4000只，加入玉米油，在溫度為23°C，轉速為230rpm 的條件下培養(yǎng)8天，培養(yǎng)體系中，利用供氧裝置不斷進行氧氣的置換，確保體系的氧氣傳遞速率為O. 7m mo I 02/L *min,同時用DO探頭對體系中的氧氣傳遞速率進行檢測，進行調節(jié)， 培養(yǎng)后桿線蟲達到400X 103/mL。實施例4采集了 100只健康的東方麗金龜放到移栽了 50X 50X 30cm草坪的高爾夫球場的土壤里，每個幼蟲用100只實施例I培養(yǎng)的線蟲進行處理，10天后檢查幼蟲存活情況，最后得到結論為殺蟲率達到95%。
權利要求
1.一種桿線蟲的培養(yǎng)方法，其特征在于，其在培養(yǎng)過程中不斷進行氧氣傳遞。
2.根據權利要求I所述的桿線蟲的培養(yǎng)方法，其特征在于，具體的培養(yǎng)步驟為，Cl)首先將培養(yǎng)基在溫度為115°C 125°C，壓強為14 16psi的條件下滅菌15 30min，然后將滅菌后的培養(yǎng)基冷卻到25 28°C ；(2)、備名爾、％Photorahabdus. spp的線蟲共生菌接種到上述培養(yǎng)基中，接種量為 I X IO9 2 X 109cfu/mL培養(yǎng)基，在溫度為20 25°C，轉速為200 250rpm的條件下培養(yǎng)2 5天；(3)將桿線蟲接種到步驟(2)得到的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，接種量為4000 5000只/ml 在溫度為20 25°C，轉速為200 250rpm的條件下培養(yǎng)8 14天，培養(yǎng)體系中不斷進行氧氣的置換，確保體系的氧氣傳遞速率為O. 6 O. 7 m mo I O2A · min。
3.根據權利要求2所述的桿線蟲的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(I)中所述的培養(yǎng)基的組成為，IL蒸餾水中，含細菌用胰蛋白胨17g，細菌用朊間質蛋白胨3g，細菌用乳糖蛋白胨 10g，氯化鈉5g，細菌用膽汁鹽I. 5g。
4.根據權利要求2所述的桿線蟲的培養(yǎng)方法，其特征在于，步驟(3)的培養(yǎng)液中還加入了玉米油，加入量為20 60g/ml培養(yǎng)液。
5.一種用于培養(yǎng)權利要求I所述的桿線蟲的培養(yǎng)器，其特征在于，包括筒體、葉輪、氧氣傳遞裝置、水循環(huán)裝置和Do探頭，葉輪和氧氣傳遞裝置設置在筒體內，水循環(huán)裝置設置在筒體外側，Do探頭設置在筒體的底部并伸入到筒體內。
6.根據權利要求5所述的培養(yǎng)器，其特征在于，氧氣傳遞裝置由供氧裝置和兩個串聯(lián)的曝氣裝置組成，供氧裝置位于筒體的內側壁上，曝氣裝置位于筒體的內底部，曝氣裝置上設置了透氣孔。
7.根據權利要求5所述的培養(yǎng)器，其特征在于，透氣孔的外徑為1mm，內徑為O.7mm，長度為5cm。
8.根據權利要求5所述的培養(yǎng)器，其特征在于，所述的葉輪為為兩翼的漿型葉輪，下層葉輪和筒體內底面的距離為8 12cm。
9.根據權利要求5所述的培養(yǎng)器，其特征在于，筒體內還設置了隔板，筒體底部還設置了溫度計和pH探頭。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物培養(yǎng)技術，更具體地說，是涉及一種桿線蟲的培養(yǎng)方法及其培養(yǎng)器。本發(fā)明提供了一種既環(huán)保，又可以大規(guī)模培養(yǎng)的桿線蟲的培養(yǎng)方法及其培養(yǎng)器。其在培養(yǎng)中不斷進行氧氣傳遞。培養(yǎng)器包括筒體、葉輪、氧氣傳遞裝置、水循環(huán)裝置和Do探頭，葉輪和氧氣傳遞裝置設置在筒體內，水循環(huán)裝置設置在筒體外側，Do探頭設置在筒體的底部并伸入到筒體內。本發(fā)明操作簡單，可進行大規(guī)模的培養(yǎng)，1ml培養(yǎng)基中，4000只桿線蟲經培養(yǎng)后，可達到200-400×103只。同時，經實驗驗證，將本發(fā)明培養(yǎng)出來的桿線蟲用到高爾夫球場后，對高爾夫草坪，樹木，農作物的根部產生傷害的蠐螬類害蟲的殺蟲率可以達到95%。
文檔編號A01K67/033GK102599114SQ20121006430
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月12日 優(yōu)先權日2012年3月12日
發(fā)明者南旭浩, 金孝炫, 金泰完 申請人:沈陽麥克斯生物工程有限公司