專利名稱：：昆蟲組織酶解物及其在昆蟲病原線蟲人工培養(yǎng)上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物害蟲生物防治領(lǐng)域，具體地說涉及一種昆蟲組織酶解物，以及昆蟲組織酶解物在昆蟲病原線蟲人工培養(yǎng)上的應(yīng)用，還涉及含有昆蟲組織酶解物的昆蟲病原線蟲培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
：昆蟲病原線蟲是一類重要的生物殺蟲劑，它隨寄主昆蟲的食物或從昆蟲自然開口、節(jié)間膜進入昆蟲體內(nèi)，在昆蟲血腔中釋放自身攜帶的共生菌，共生菌分泌的毒性因子造成昆蟲患敗血癥死亡。昆蟲病原線蟲寄主范圍較廣，能主動搜尋寄主，因此對土棲和鉆蛀等隱蔽性害蟲具獨特防治優(yōu)勢；同時具有可大量人工培養(yǎng)和對人、畜、環(huán)境安全等優(yōu)點。在工業(yè)化國家昆蟲病原線蟲制劑占生物農(nóng)藥巿場銷售額的13%,僅次于蘇云金桿菌產(chǎn)品。澳大利亞、美國、德國、荷蘭、加拿大等國家均有一些昆蟲病原線蟲產(chǎn)品廣泛用于防治農(nóng)林、牧草、花卉、和衛(wèi)生等重要害蟲。昆蟲病原線蟲雖然在20多年前就實現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)，但由于存在線蟲生產(chǎn)成本高和線蟲質(zhì)量不穩(wěn)定等問題，限制了其在生產(chǎn)上的應(yīng)用。線蟲培養(yǎng)技術(shù)主要集中于線蟲產(chǎn)量、質(zhì)量和成本，一般通過優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件可提高線蟲產(chǎn)量，從而降低生產(chǎn)成本和提高線蟲質(zhì)量。如專利《酶解培養(yǎng)基培養(yǎng)昆蟲病原線蟲的方法》(專利號為ZL200410096044.5)公開了一種固體培養(yǎng)線蟲的淀粉酶酶解培養(yǎng)基，主要是在以淀粉為主要成分的培養(yǎng)基中加入淀粉酶；此方法使線蟲產(chǎn)量大幅提高、收獲期提前，線蟲的收獲率和清潔度也得到提高。但是仍然存在生產(chǎn)成本高，且所生產(chǎn)的線蟲質(zhì)量不高等問題。另外，在培養(yǎng)基中加入昆蟲物質(zhì)或寄主物質(zhì)可復(fù)壯菌株和提高產(chǎn)量(劉石泉等，微生物學(xué)通報，2008，35(7):1091-1095。吳友良，江蘇蠶業(yè)，2003，3:10-11。常韶華等，中國生物防治，1998，14(3):105-106)。但是在培養(yǎng)基中昆蟲表皮的存在會大大降低線蟲清潔度，增加線蟲收獲時的清洗難度。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種昆蟲組織酶解物。本發(fā)明另一目的在于提供上述昆蟲組織酶解物在昆蟲病原線蟲人工培養(yǎng)上的應(yīng)用。本發(fā)明還一目的是提供含有上述昆蟲組織酶解物的昆蟲病原線蟲培養(yǎng)基。實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明一種昆蟲組織酶解物，按照如下方法制備將昆蟲組織和水加入到勻漿器中，勻漿，再加入蛋白酶進行水解反應(yīng)，然后過濾，棄殘渣，所得濾液即為昆蟲組織酶解物。上述昆蟲組織酶解物的制備方法，包括將昆蟲組織和水加入到勻漿器中，勻漿，再加入蛋白酶進行水解反應(yīng)，然后過濾，棄殘渣，所得濾液即為昆蟲組織酶解物。所述的蛋白酶的添加量因所添加蛋白酶的種類和蛋白酶的活性的不同而不同，一般蛋白酶的添加量占昆蟲組織干物質(zhì)重的重量百分比為0.520%。所述的昆蟲組織干物質(zhì)重可以通過計算得到，一般昆蟲組織干物質(zhì)重為昆蟲鮮重的3040%或昆蟲干粉重的9095%。上述蛋白酶進行水解反應(yīng)的時間因蛋白酶的種類和蛋白酶活性的不同而不同；通常蛋白酶的水解反應(yīng)時間為10180min。所述的蛋白酶是指可以催化分解蛋白質(zhì)肽鍵的蛋白質(zhì)水解酶，如酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶等。所述的酶均可自市場上購買。上述蛋白酶進行水解反應(yīng)的溫度為所述酶活性最高時的溫度；可按照所購酶說明書上所標(biāo)明的溫度進行。所述的昆蟲組織可以是昆蟲組織干粉或活體昆蟲。所述的昆蟲干粉是將昆蟲幼蟲干燥，然后粉碎即得。所述的昆蟲病原線蟲是指可進行人工培養(yǎng)的昆蟲病原線蟲，如蕪菁斯氏線蟲(5tez'wewe附a^/"ae)，d、巻娥斯氏線蟲(Stez'wer打emacar/ocajosae)，格氏斯氏線蟲g/osen')，大異刁、桿線蟲(//eferor/^k^Y/s附egzV&)，嗜菌異小桿線蟲(//"efe/wtoW他6""en'o//zora)等。所述的昆蟲是指可進行人工培養(yǎng)或容易獲得、繁殖成本低的昆蟲，優(yōu)選可人工飼養(yǎng)且蛋白質(zhì)含量較高的昆蟲；進一步優(yōu)選為所培養(yǎng)線蟲的寄主昆蟲；如小木蠹蛾、蠅蛆、蠶蛹、玉米螟、大蠟螟、菜青蟲、米蛾、棉鈴蟲、黃粉蟲、桃小食心蟲等。所述的組織勻漿器是指可以破碎昆蟲組織的工具;勻漿器可自市場上購買。所述的過濾是指用孔徑小于勻漿后昆蟲組織的濾網(wǎng)進行，如尼龍網(wǎng)、綢布或紗布等。上述昆蟲組織酶解物在昆蟲病原線蟲人工培養(yǎng)上的應(yīng)用。所述的應(yīng)用是指將昆蟲組織酶解物作為昆蟲病原線蟲培養(yǎng)基的組份。含有昆蟲組織酶解物的昆蟲病原線蟲培養(yǎng)基，按照如下方法制備在昆蟲病原線蟲培養(yǎng)基中加入昆蟲組織酶解物，混勻后高壓滅菌；所添加的昆蟲組織酶解物的數(shù)量為勻漿前昆蟲組織干物質(zhì)重與培養(yǎng)基的質(zhì)量比為1:2.5250。所述的昆蟲病原線蟲培養(yǎng)基是指可以人工培養(yǎng)線蟲的固體或液體培養(yǎng)基等，如狗飼料培養(yǎng)基(House等.Natrue，1965，206:847)、雞內(nèi)臟培養(yǎng)基(Bedding等.Ann.appl.Biol.,1984，104:117-120)、鴨腸培養(yǎng)基(楊懷文等.中國生物防治，1991,2:87)、豆粉培養(yǎng)基(韓日疇等.昆蟲天敵，1995，17(4):153-164)、動植物蛋白混合培養(yǎng)基(Yang等.Biologicalcontrol,1997，10,193-198)、蠶蛹培養(yǎng)基(常韶華等.中國生物防治，1998，14(3):105-106)等。本發(fā)明具有的優(yōu)點利用本發(fā)明昆蟲組織酶解物配制的培養(yǎng)基培養(yǎng)的線蟲產(chǎn)量高、培養(yǎng)周期短、線蟲毒力強、生產(chǎn)成本低；收獲的線蟲更清潔，簡化了收獲程序，降低了線蟲貯存期污染的幾率；操作簡便易行，適于線蟲的大規(guī)模生產(chǎn)。具體實施例方式實施例1芫菁斯氏線蟲(5fez'f2^7zema/eto'ae)培養(yǎng)的對比試驗1、昆蟲大蠟螟組織酶解物的制備(1)選取實驗室培養(yǎng)的營養(yǎng)、生理狀況一致的大蠟螟末齡幼蟲16g，加500g水后用組織勻漿器充分破碎昆蟲組織，使大蠟螟組織內(nèi)含物完全釋放并均勻懸浮于混合液中；(2)在混合液中加入中性蛋白酶(北京奧博星公司)lg，在45'C下進行水解反應(yīng)10分鐘；然后用致密綢布濾去大蠟螟組織殘渣，所得濾液即為大蠟螟組織酶解物。2、蕪菁斯氏線蟲培養(yǎng)基的制備(1)向步驟l(2)所得濾液中加入黃豆粉240g、面粉80g、蛋黃粉16g、蛋白胨8g、酵母膏24g、豬油80g、水500g,然后充分?jǐn)嚢杈鶆颍儆?60g海綿吸附；(2)將步驟(1)的培養(yǎng)基以40g/瓶的量裝入250ml三角瓶，在121。C下濕熱滅菌45分鐘后備用。3、蕪菁斯氏線蟲的對比培養(yǎng)試驗(1)培養(yǎng)基為a.本發(fā)明的培養(yǎng)基，b.對照為豆粉培養(yǎng)基(組成成份為黃豆粉240g，面粉80g，蛋黃粉16g，蛋白胨8g，酵母膏24g，豬油80g，海綿160g，水1000g)。(2)在上述培養(yǎng)基中分別接種蕪菁斯氏線蟲的共生細菌(&"on^Z^^6oWem7)，于25。C下黑暗培養(yǎng)2天；(3)在步驟(2)培養(yǎng)細菌的培養(yǎng)基中接種蕪菁斯氏線蟲，于25"C下黑暗培養(yǎng)；(4)從第6天開始每2天檢測培養(yǎng)基中昆蟲病原線蟲侵染期線蟲的比例含量直到收獲，每處理重復(fù)4次；(5)在侵染期線蟲比例穩(wěn)定到達95%以上時收獲線蟲，在解剖鏡下對收獲的侵染期昆蟲病原線蟲計數(shù)，每處理重復(fù)7次，計算得到每克培養(yǎng)基中侵染期線蟲平均產(chǎn)量(IJs/g);以接種線蟲到收獲線蟲所用的天數(shù)作為線蟲的培養(yǎng)周期；用"沙柱法"(Yang等.Biologicalcontrol,1997,10，193-198)測定昆蟲病原線蟲對大蠟螟的侵入率，作為線蟲質(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果(見表l)昆蟲組織培養(yǎng)基線蟲產(chǎn)量為對照豆粉培養(yǎng)基的1.52倍，培養(yǎng)周期由原來的22天縮短為16天，收獲的侵染期線蟲對大蠟螟的侵入率提高5.24%。表l蕪菁斯氏線蟲培養(yǎng)的對比試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例2蕪菁斯氏線蟲培養(yǎng)的對比試驗重復(fù)實施例l、但進行下述修改將實施例l步驟l(2)中的中性蛋白酶lg改為酸性蛋白酶(北京奧博星公司)lg，酶解反應(yīng)條件改為在55'C下進行水解反應(yīng)30分鐘。結(jié)果(見表2)昆蟲組織培養(yǎng)線蟲產(chǎn)量為豆粉培養(yǎng)基的1.50倍，培養(yǎng)周期比豆粉培養(yǎng)基縮短了6天，收獲的侵染期線蟲對大蠟螟的侵入率提高了6.10%。表2蕪菁斯氏線蟲培養(yǎng)的劉t比試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例3蕪菁斯氏線蟲培養(yǎng)的對比試驗重復(fù)實施例l，但進行下述修改將實施例l步驟l(2)中的中性蛋白酶改為堿性蛋白酶(北京奧博星公司)0.5g，酶解反應(yīng)條件為在5(TC下進行水解反應(yīng)60分鐘；結(jié)果(見表3)昆蟲組織培養(yǎng)線蟲產(chǎn)量為對照豆粉培養(yǎng)基的1.58倍，培養(yǎng)周期比對照豆粉培養(yǎng)基縮短了6天，收獲的侵染期線蟲對大蠟螟的侵入率提高了4.78%。表3蕪菁斯氏線蟲培養(yǎng)對比試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例4小巻蛾斯氏線蟲(Ste&ememacar;7oca戸ae)培養(yǎng)的對比試驗重復(fù)實施例l，但進行下述修改將步驟l(1)中的大蠟螟末齡幼蟲質(zhì)量改為黃粉蟲干粉320g;將步驟l(2)中的酶用量改為5g，酶解反應(yīng)條件改為在45'C下進行水解反應(yīng)60分鐘；將步驟3(2)中修改為接種小巻蛾斯氏線蟲(Sfe/"ememacfl^wca/M"e)的共生細菌(^Te"cWzaWw51"謡fl鄉(xiāng)fe7"51)。將步驟3(3)中修改為接種小巻蛾斯氏線蟲5fe/"er"emac^r/oca/wae;結(jié)果(見表4)昆蟲組織培養(yǎng)線蟲產(chǎn)量為對照豆粉培養(yǎng)基的2.26倍，培養(yǎng)周期比對照豆粉培養(yǎng)基縮短6天，收獲的侵染期線蟲對大蠟螟的侵入率提高了9.78%。表4小巻蛾斯氏線蟲培養(yǎng)對比試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例5小巻蛾斯氏線蟲培養(yǎng)的對比試驗重復(fù)實施例4，但進行下述修改將其中的黃粉蟲干粉改為蛆干粉。結(jié)果(見表5)昆蟲組織培養(yǎng)線蟲產(chǎn)量為豆粉培養(yǎng)基的2.17倍，培養(yǎng)周期縮短6天，收獲的侵染期線蟲對大蠟螟侵入率提高了10.56%。表5/」、巻蛾斯氏線蟲培養(yǎng)的對比試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例6小巻蛾斯氏線蟲5"te/wememaca/poca/waei咅養(yǎng)基的制備重復(fù)實施例5，但進行下述修改將其中的中性蛋白酶改為酸性蛋白酶5g(北京奧博星公司)，酶解反應(yīng)條件改為在55"C下進行水解反應(yīng)120分鐘。結(jié)果(見表6)昆蟲組織培養(yǎng)基線蟲產(chǎn)量為對照豆粉培養(yǎng)基的2.15倍，培養(yǎng)周期縮短6天，收獲的侵染期線蟲對大蠟螟侵入率提高了9.50%。表6'」、巻蛾斯氏線蟲培養(yǎng)對比試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例7異小桿線蟲(//e/m^/za^/fe^rc&n'o//7ora)培養(yǎng)對比試驗重復(fù)實施例5，但進行下述修改將其中的黃粉蟲質(zhì)量改為1600g;將其中的蛋白酶(北京奧博星公司)用量改為3g;將其中接種的共生細菌修改為接種異小桿線蟲的共生細菌(i^oto^Wc/附/"m/M^"m);將其中接種的線蟲修改為接種異小桿線蟲。結(jié)果(見表7)昆蟲組織培養(yǎng)線蟲產(chǎn)量為豆粉培養(yǎng)基的2.15倍，培養(yǎng)周期縮短4天，收獲的侵染期線蟲對大蠟螟侵入率提高了6.42%。表7異小桿線蟲培養(yǎng)對比試驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例8異小桿線蟲(//efera^7flZ^to6ac^7'o//zoraJ培養(yǎng)對比試驗重復(fù)實施例7，但進行下述修改將其中的酶解反應(yīng)條件改為在45'C下進行水解反應(yīng)180分鐘；結(jié)果(見表8)昆蟲組織培養(yǎng)線蟲產(chǎn)量為豆粉培養(yǎng)基的2.10倍，培養(yǎng)周期縮短為18天，收獲的侵染期線蟲對大蠟螟侵入率提高了10.57%。表8異小桿線蟲培養(yǎng)對比試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權(quán)利要求1、一種昆蟲組織酶解物，其特征在于按照如下方法制備將昆蟲組織和水加入到勻漿器中，勻漿，再加入蛋白酶進行水解反應(yīng)10～180min，然后過濾，棄殘渣，所得濾液即為昆蟲組織酶解物。2、按照權(quán)利要求l所述的昆蟲組織酶解物，其特征在于所添加蛋白酶的數(shù)量占昆蟲組織干物質(zhì)重的重量百分比為0.520%。3、按照權(quán)利要求1或2所述的昆蟲組織酶解物，其特征在于所述的蛋白酶是指酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶或胰蛋白酶之一種。4、按照權(quán)利要求3所述的昆蟲組織酶解物，其特征在于所述的昆蟲組織是指昆蟲組織干粉或活體昆蟲。5、按照權(quán)利要求4所述的昆蟲組織酶解物，其特征在于所述的昆蟲是小木蠹蛾、蠅蛆、蠶蛹、玉米螟、大蠟螟、菜青蟲、米蛾、棉鈴蟲、黃粉蟲或桃小食心蟲之一種。6、權(quán)利要求1所述的昆蟲組織酶解物在昆蟲病原線蟲人工培養(yǎng)上的應(yīng)用。7、按照權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用是指將昆蟲組織酶解物作為昆蟲病原線蟲培養(yǎng)基的組份。8、按照權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的昆蟲病原線蟲是指蕪菁斯氏線蟲、小巻蛾斯氏線蟲、格氏斯氏線逸、大異小枉線蟲或嗜菌異小桿線蟲。9、含有權(quán)利要求15任一所述的昆蟲組織酶解物的昆蟲病原線蟲培養(yǎng)基，按照如下方法制備在昆蟲病原線蟲培養(yǎng)基中加入昆蟲組織酶解物，混勻后高壓滅菌；所添加的昆蟲組織酶解物的數(shù)量為勻漿前昆蟲組織干物質(zhì)重與培養(yǎng)基的質(zhì)量比為1:2.5250。10、按照權(quán)利要求9所述的昆蟲病原線蟲培養(yǎng)基，其特征在于所述的昆蟲病原線蟲培養(yǎng)基是指人工培養(yǎng)線蟲的固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基。全文摘要本發(fā)明公開了一種昆蟲組織酶解物，主要是利用蛋白酶對昆蟲組織進行水解，然后過濾，所得濾液即為昆蟲組織酶解物。本發(fā)明還公開了昆蟲組織酶解物在人工培養(yǎng)病原線蟲上的應(yīng)用，即將昆蟲酶解物作為組份加入到常規(guī)培養(yǎng)基中，混勻滅菌即可。利用本發(fā)明昆蟲組織酶解物配制的培養(yǎng)基培養(yǎng)的線蟲產(chǎn)量高、培養(yǎng)周期短、線蟲毒力強、生產(chǎn)成本低；收獲線蟲更清潔，簡化了收獲程序，降低了線蟲貯存期污染的幾率；操作簡便易行，適于線蟲的大規(guī)模生產(chǎn)。文檔編號A23K1/18GK101411405SQ20081022728公開日2009年4月22日申請日期2008年11月26日優(yōu)先權(quán)日2008年11月26日發(fā)明者倩劉,曹翠玲,王金利,恒簡申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)