本發(fā)明涉及遺傳工程領(lǐng)域，尤其涉及一種提高乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的重組枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
在人體中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖單元的合成前體，其對修復和維持軟骨及關(guān)節(jié)組織功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被廣泛添加在藥物和營養(yǎng)膳食中來治療和修復關(guān)節(jié)損傷。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妝品和制藥領(lǐng)域也具有諸多應用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解蝦殼或蟹殼中甲殼素生產(chǎn)，然而，此方法產(chǎn)生的廢液對環(huán)境污染較為嚴重，而且得到的產(chǎn)品易引起過敏反應，不適宜海鮮過敏的人群服用。
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種被廣泛用作食品酶制劑及重要營養(yǎng)化學品的生產(chǎn)宿主，其產(chǎn)品被FDA認證為GRAS(Generally Regarded as Safe)安全級別。專利申請?zhí)枮?01510761678.6中構(gòu)建的重組枯草芽孢桿菌BSGNKAP仍然存在乙酰氨基葡萄糖/葡萄糖轉(zhuǎn)化效率低的缺點。因此，如何提高葡萄糖的利用效率及乙酰氨基葡萄糖合成效率，是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的亟待解決問題。
鑒于上述原因，本發(fā)明人積極加以研究創(chuàng)新，以期創(chuàng)建一種新型的提高乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的重組枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法，使其更具有產(chǎn)業(yè)上的利用價值。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種提高乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的重組枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法是加強表達了枯草芽孢桿菌中的丙酮酸羧化酶編碼基因(pycA)，操作簡單，便于使用，且所構(gòu)建的重組枯草芽孢桿菌可有效地減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生，大大提高乙酰氨基葡糖的產(chǎn)量。在一方面，本發(fā)明提供了一種提高乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的重組枯草芽孢桿菌，該重組枯草芽孢桿菌通過加強表達枯草芽孢桿菌的丙酮酸羧化酶編碼基因pycA得到。
在一具體實施例中，用強組成型啟動子P43替換丙酮酸羧化酶編碼基因pycA原始啟動子，并將丙酮酸羧化酶編碼基因pycA起始密碼子GTG替換為ATG，來加強表達枯草芽孢桿菌的丙酮酸羧化酶編碼基因pycA。
在一更具體實施例中，其中基因pycA被加強表達的枯草芽孢桿菌為BSGNKAP，其是以B.subtilis 168Δ nagPΔ gamPΔ gamAΔ nagAΔ nagBΔ ldhΔ pta:：lox72為宿主，分別以啟動子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重組表達，并敲除葡萄糖激酶編碼基因glck、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因pckA和丙酮酸激酶編碼基因pyk得到，如申請?zhí)枮?01510761678.6的中國專利申請中所公開的。
進一步地，丙酮酸羧化酶編碼基因pycA如NCBI-Gene ID:935920所示。
在另一方面，本發(fā)明還提供了一種上述重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
(1)構(gòu)建丙酮酸羧化酶編碼基因pycA的啟動子和起始密碼子的替換框；
(2)經(jīng)同源重組，用步驟(1)中得到的替換框替換枯草芽孢桿菌基因組中的酮酸羧化酶編碼基因pycA的啟動子及起始密碼子GTG。
在一具體實施例中，在步驟(1)中，用丙酮酸羧化酶編碼基因pycA的上游序列、pycA序列、PH01終止子Ter、強組成型啟動子P43以及博來霉素抗性 基因zeo序列，構(gòu)建丙酮酸羧化酶編碼基因pycA的啟動子和起始密碼子替換框。
在一具體實施例中，在步驟(2)中，起始密碼子GTG替換為ATG。
在一具體實施例中，丙酮酸羧化酶編碼基因pycA的上游序列來自枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168購自美國典型微生物保藏中心，編號為ATCC No.27370。
在又一具體實施例中，丙酮酸羧化酶編碼基因pycA的上游序列及pycA序列如SEQ ID NO.1所示
在一具體實施例中，在步驟(1)中，丙酮酸羧化酶編碼基因pycA的啟動子和起始密碼子替換框的序列如SEQ ID NO.2所示。
在一具體實施例中，在步驟(2)中，枯草芽孢桿菌為BSGNKAP，其是以B.subtilis 168Δ nagPΔ gamPΔ gamAΔ nagAΔ nagBΔ ldhΔ pta:：lox72為宿主，分別以啟動子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重組表達，并敲除葡萄糖激酶編碼基因glck、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因pckA和丙酮酸激酶編碼基因pyk得到的，如申請?zhí)枮?01510761678.6的中國專利申請中所公開的。
在又一具體實施例中，通過pP43-GNA1質(zhì)粒游離表達GNA1基因，通過pM7Z6M-PxylA-glmS質(zhì)粒整合表達glmS基因。
在又一方面，本發(fā)明還提供了一種上述構(gòu)建的重組枯草芽孢桿菌制備乙酰氨基葡萄糖的方法，包括以下步驟：將重組枯草芽孢桿菌在種子培養(yǎng)基中活化，然后將活化后的種子轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，加入誘導劑進行發(fā)酵培養(yǎng)，得到乙酰氨基葡萄糖。
進一步地，種子在35-37℃下在種子培養(yǎng)基中活化，活化后的種子在35-37℃下發(fā)酵培養(yǎng)。
進一步地，種子培養(yǎng)基包括以下成分：蛋白胨、酵母粉和氯化鈉；
在一具體實施例中，種子培養(yǎng)基以其重量為基準，包括以下成分：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉和10g/L氯化鈉。
進一步地，發(fā)酵培養(yǎng)基包括以下成分：葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、硫酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、碳酸鈣和微量元素溶液。
在一更具體實施例中，發(fā)酵培養(yǎng)基以其重量為基準，包括以下成分：20g/L葡萄糖、6g/L蛋白胨、12g/L酵母粉、6g/L硫酸銨、12.5g/L磷酸氫二鉀、2.5g/L磷酸二氫鉀、5g/L碳酸鈣和10ml/L微量元素溶液。
進一步地，微量元素溶液包括：硫酸錳、氯化鈷、鉬酸鈉、硫酸鋅、氯化鋁、氯化銅、硼酸和鹽酸。
在一具體實施例中，微量元素溶液以其重量為基準，包括以下成分：1.0g/L硫酸錳、0.4g/L氯化鈷、0.2g/L鉬酸鈉、0.2g/L硫酸鋅、0.1g/L氯化鋁、0.1g/L氯化銅、0.05g/L硼酸和5mol/L鹽酸。
在一具體實施例中，活化后的種子以5％-6％的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。
在一具體實施例中，誘導劑為木糖，每升發(fā)酵培養(yǎng)基的木糖用量為4.5-5.5g。
借由上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
本發(fā)明提供了一種提高乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量的重組枯草芽孢桿菌，BSGNKAP2通過加強表達了枯草芽孢桿菌BSGNKAP的丙酮酸羧化酶編碼基因pycA得到，與出發(fā)菌株相比，其乙酰氨基葡萄糖產(chǎn)量大大提高。本發(fā)明通過加強表達丙酮酸羧化酶，將更多的丙酮酸引入到三羧酸循環(huán)，提高谷氨酰胺合成前體α-酮戊二酸的濃度，進而提高谷氨酰胺的合成，促進乙酰氨基葡萄糖積累。三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物α-酮戊二酸是連接碳代謝和氮代謝關(guān)鍵節(jié)點，α-酮戊二酸作為谷氨酰胺合成的前體，同時谷氨酰胺是乙酰氨基葡萄糖的合成前體，因此 提高胞內(nèi)α-酮戊二酸的合成可以有效增加谷氨酰胺的含量，進而可以提高乙酰氨基葡萄糖的合成。同時，將丙酮酸引入三羧酸循環(huán)可以有效的減少副產(chǎn)物乙偶姻的生成，提高葡萄糖的利用效率。本發(fā)明的重組枯草芽孢桿菌構(gòu)建方法簡單，便于使用，具有很好地應用前景。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細描述。以下實施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的保護范圍的限制。
實施例1
構(gòu)建枯草芽孢桿菌BSGNKAP
根據(jù)中國專利申請201510761678.6中所公開的內(nèi)容，以B.subtilis 168Δ nagPΔ gamPΔ gamAΔ nagAΔ nagBΔ ldhΔ pta:：lox72為宿主，分別以啟動子PxylA、P43控制glmS、GNA1的重組表達，以pP43-GNA1質(zhì)粒游離表達GNA1基因，pM7Z6M-PxylA-glmS質(zhì)粒整合表達glmS基因，然后在此基礎(chǔ)上敲除葡萄糖激酶編碼基因glck、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因pckA和丙酮酸激酶編碼基因pyk，得到重組枯草芽孢桿菌BSGNKAP。
實施例2
構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌BSGNKAP2
根據(jù)NCBI上公布的購買自美國典型微生物保藏中心，編號為ATCC No.27370的Bacillus subtilis 168的丙酮酸羧化酶編碼基因pycA的上游序列和pycA序列(如序列表SEQ ID NO.1所示)，PH01終止子Ter、P43強組成型啟動子以及博來霉素抗性基因zeo的序列，構(gòu)建序列如SEQ ID NO.2所示的替換框。本發(fā)明中通過引入PHT01質(zhì)粒的終止子Ter終止pycA原始啟動子的表達調(diào)控。
將構(gòu)建好的替換框轉(zhuǎn)化實施例1中得到的枯草芽孢桿菌BSGNKAP，經(jīng)同 源重組，用構(gòu)建好的替換框整合至枯草芽孢桿菌BSGNKAP基因組中，達到替換丙酮酸羧化酶編碼基因pycA的啟動子及起始密碼子GTG，得到重組枯草芽孢桿菌BSGNKAP2，加強表達了宿主菌胞內(nèi)丙酮酸羧化酶，通過博來霉素抗性平板篩選、菌落PCR驗證，確認啟動子和起始密碼子替換框整合成功，得到重組枯草芽孢桿菌BSGNKAP2。
實施例3
重組芽孢桿菌BSGNKAP2發(fā)酵生產(chǎn)乙酰氨基葡萄糖
種子培養(yǎng)基的成分包括：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、和10g/L氯化鈉。
發(fā)酵培養(yǎng)基的成分包括：20g/L葡萄糖、6g/L蛋白胨、12g/L酵母粉、6g/L硫酸銨、12.5g/L磷酸氫二鉀、2.5g/L磷酸二氫鉀、5g/L碳酸鈣10ml/L微量元素溶液。
其中微量元素溶液以其重量為基準，包括如下成分：1.0g/L硫酸錳、0.4g/L氯化鈷、0.2g/L鉬酸鈉、0.2g/L硫酸鋅、0.1g/L氯化鋁、0.1g/L氯化銅、0.05g/L硼酸和5mol/L鹽酸。
使用高效液相色譜法檢測乙酰氨基葡萄糖的含量，高效液相色譜法測試條件：儀器型號Agilent 1200，RID檢測器，柱子：NH2柱(250×4.6mm，5μm)，流動相：70％乙腈，流速0.75mL/min，柱溫30℃，進樣體積為10μL。
發(fā)酵液中葡萄糖濃度的檢測：SBA生物傳感分析儀。
在種子培養(yǎng)基中將重組枯草芽孢桿菌BSGNKAP1于37℃、220rpm下培養(yǎng)8h，然后將種子以5％的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于500mL搖瓶中37℃、220rpm條件下培養(yǎng)48h。發(fā)酵結(jié)束時，檢測發(fā)酵上清液中乙酰氨基葡萄糖的含量。
發(fā)酵結(jié)束時，BSGNKAP2發(fā)酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量達到12.1g/L，與對照菌株BSGNKAP相比提高了15.4％(結(jié)果如表1所示)，實現(xiàn)了乙酰氨基 葡萄糖在重組枯草芽孢桿菌胞外產(chǎn)量的提高。此外，本發(fā)明的BSGNKAP2菌株的乙酰氨基葡萄糖比合成速率達到0.0154g/g DCW/h，與對照菌株BSGNKAP相比，比合成速率提高了22.1％。發(fā)酵上清液中乙偶姻的產(chǎn)量為10.83g/L，而出發(fā)菌株中的乙偶姻的產(chǎn)量為12.18g/L，副產(chǎn)物乙偶姻的產(chǎn)量僅為對照菌株的88.8％。因此通過加強表達丙酮酸羧化酶編碼基因pycA，可以有效提高乙酰氨基葡萄糖的積累，減少副產(chǎn)物的生成，提高碳源的利用效率。
表1 兩種菌株各產(chǎn)物比較
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并不用于限制本發(fā)明，應當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變型也應視為本發(fā)明的保護范圍。
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