本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，具體涉及一種用于減肥降脂的轉(zhuǎn)化體及其構(gòu)建方法與應用。

背景技術(shù)：

肥胖是當今世界倍受關注的一個健康問題。歐美發(fā)達國家，超過半數(shù)的人體重超標，其中的20～30％是肥胖患者。肥胖不僅影響行動和生活質(zhì)量，并且可引發(fā)心血管疾病、2型糠尿病和腎臟疾病等一系列疾病，對人體健康危害極大。調(diào)查統(tǒng)計表明，體重指數(shù)(body mass index，BMI)每增加1個單位，高血壓病的發(fā)病風險就增加10％。

雖然肥胖的發(fā)病原因有多種，遺傳、內(nèi)分泌失調(diào)、飲食結(jié)構(gòu)和生活方式等因素都可以誘發(fā)肥胖。但是絕大多數(shù)肥胖患者屬于不良的飲食結(jié)構(gòu)和生活習慣所致的單純性肥胖。目前，肥胖癥的治療方法主要有飲食行為療法、藥物治療和手術(shù)治療等。節(jié)食和增加運動量等飲食行為療法減肥效果不好，容易反復，一般人難于長期堅持。手術(shù)治療創(chuàng)傷大，風險高，不易被患者接受。因此，多數(shù)肥胖患者傾向于接受藥物治療。

目前的減肥藥物有化學藥物和中草藥。其中化學藥物一般是通過作用于神經(jīng)中樞抑制食欲來達到減肥的目的，如芬特明(Phentermine)、芬氟拉明(Dexfenfluramine)和鹽酸西布曲明(Sibntramine)等，但是這些藥物有導致5-羥色胺綜合征，出現(xiàn)精神狀態(tài)改變(如焦慮不安、躁狂等)副作用，甚至會引發(fā)高血壓和心絞痛。胰脂肪酶抑制劑奧利司他(orlistat，商品名xenical，賽尼可)也是一種化學減肥藥物，可阻斷脂肪酶對三酰甘油的水解，抑制脂肪吸收，但有引起脂肪腹瀉和導致脂溶性維生素缺乏的副作用。減肥中草藥多以植物提取物和膳食纖維為主，主要通過潤腸通便、限食促排來達到減肥目的，長期服用會引起營養(yǎng)失衡、水電解質(zhì)紊亂和乏力等癥狀。

胃泌酸調(diào)節(jié)素(Oxyntomodulin,OXM)是腸上皮L－細胞分泌的一種短肽腸激素。它由胰高血糖素原(proglucagon)基因編碼，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過多種不同的剪接，可以形成OXM、腸高血糖素(licentin)、胰高血糖素樣肽－1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)和GLP-2等多種活性腸肽激素。人OXM含37個氨基酸殘基，具有抑制食物吸收和食欲、動員脂肪的作用。OXM的表達與肥胖發(fā)病有密切的關系。肥胖患者OXM分泌下降，而厭食癥(如熱帶腹瀉，空腸切除術(shù)后)OXM的分泌則增加。OXM可以通過三條途徑調(diào)節(jié) 食欲和能量攝?。阂皇侵苯幼饔糜谖改c道粘膜上皮細胞GLP-1受體，抑制糖和脂肪的吸收；二是作用于迷走神經(jīng)，下調(diào)胃生長素的分泌，抑制食欲；研究顯示，皮下注射OXM可使嚙齒動物血液中的胃生長素下降20％，而人類可下降到44％；三是通過甲狀腺途徑刺激甲狀腺素的合成分泌，增加能量消耗，動員脂肪。嚙齒動物腦室注射或皮下注射OXM可降低食物吸收和體重，減少脂肪。在英國對26名肥胖患者進行雙盲試驗，受試者餐前30分鐘皮下注射OXM，為期4周。結(jié)果顯示，治療組體重減輕了2.3kg，而對照組只減輕了0.5kg，對受試者食性和味覺沒有影響。英國的菲亞克斯(Thiakis)公司化學合成了OXM類似肽TKS1225，已進入到臨床Ⅲ期研究階段，美國的惠氏(Wyeth)醫(yī)藥公司出資購買了TKS1225的獨占使用權(quán)，有望近年內(nèi)將TKS1225開發(fā)成減肥新藥。但是，TKS1225等OXM類似肽一般通過化學合成或生物工程生產(chǎn)，產(chǎn)品多為粉針劑，通過注射途徑給藥。這種生產(chǎn)和給藥方式存在生產(chǎn)成本高、體內(nèi)半衰期短和用藥不便的缺點，不易被肥胖患者接受。

已授權(quán)的中國專利(200910041386.X)—表達人胃泌酸調(diào)節(jié)素基因的雙歧桿菌，雖然在減肥降脂方面已取得很好的效果。但是，此表達系統(tǒng)存在不能成藥的重大缺陷。所用質(zhì)粒載體pBBADs攜帶氨芐青霉素抗性基因，會在人體內(nèi)引入氨芐蛋白過敏原。如果長期服用，可能會造成宿主腸道菌群紊亂，也會引起宿主產(chǎn)生耐藥性。而本專利使用的乳酸乳球菌株不含有抗生素基因，是一個全新的藥物構(gòu)成，不會引入外來過敏原，生物安全性高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種用于減肥降脂的轉(zhuǎn)化體，該轉(zhuǎn)化體具有更高的人胃泌酸調(diào)節(jié)素表達量，且不含抗生素，對人體更加安全。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述轉(zhuǎn)化體的構(gòu)建方法。

本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是提供上述轉(zhuǎn)化體的應用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種用于減肥降脂的轉(zhuǎn)化體，該轉(zhuǎn)化體是通過將經(jīng)密碼子優(yōu)化的人胃泌酸調(diào)節(jié)素基因通過同源重組替換乳酸乳球菌胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，thyA)基因得到。

其中，所述的人OXM基因，其核酸序列可在不改變其編碼的氨基酸序列的前提下，根據(jù)所選宿主的偏好密碼子對其核酸序列進行優(yōu)化調(diào)整，使人胃泌酸調(diào)節(jié)素基因在轉(zhuǎn)化體中提高人胃泌酸調(diào)節(jié)素表達量，優(yōu)選的其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

其中，所述的乳酸乳球菌為L.lactis NZ9000、L.lactis NZ3900或L.lactis MG1363

上述用于減肥降脂的轉(zhuǎn)化體的構(gòu)建方法，該方法包括如下步驟：

(1)將乳酸乳球菌thyA基因上游序列、經(jīng)密碼子優(yōu)化的人胃泌酸調(diào)節(jié)素基因、乳酸乳球菌thyA基因下游序列依次拼接，人工化學合成整個基因片段；

(2)將新構(gòu)建的重組基因片段用電轉(zhuǎn)化進入乳酸乳球菌進行同源重組，篩選出thyA^-OXM⁺菌株。

本發(fā)明是利用人OXM基因與乳酸乳球菌thyA基因同源重組，從而替換掉乳酸乳球菌基因組中的thyA基因，使人胃泌酸調(diào)節(jié)素可以在乳酸乳球菌中組成型表達。

上述用于減肥降脂的轉(zhuǎn)化體在制備減肥降脂藥品和食品中的應用也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。其中，所述的藥品為口服液、活菌粉劑、片劑或膠囊口服藥，所述的食品為固體食品或者飲料。

上述用于減肥降脂的轉(zhuǎn)化體在制備肥胖病人降血糖藥物中的應用也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。其中，所述的藥品為口服液、活菌粉劑、片劑或膠囊口服藥。

上述用于減肥降脂的轉(zhuǎn)化體在制備脂肪肝病人降脂藥物中的應用也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。其中，所述的藥品為口服液、活菌粉劑、片劑或膠囊口服藥。

本發(fā)明的突出特點是利用乳酸乳球菌能在腸道內(nèi)長期生長、定植的特性，通過基因同源重組，篩選獲得組成型表達胃泌酸調(diào)節(jié)素的乳酸菌，發(fā)揮胃泌酸調(diào)節(jié)素調(diào)節(jié)食欲和能量吸收、減肥降脂的生物學作用。此法不需要進行胃泌酸調(diào)節(jié)素多肽的分離和純化，生產(chǎn)工藝簡單、成本低，可以口服，用藥方便，克服了化學合成或基因工程生產(chǎn)胃泌酸調(diào)節(jié)素類似肽生產(chǎn)成本高、用藥不便的缺點。

有益效果：本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)勢：

1、本發(fā)明制備了組成型表達人OXM的乳酸乳球菌，而且是胸腺嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株。因為胸腺嘧啶(thymidine)是乳酸乳球菌生長所必須的營養(yǎng)成份，當基因組中缺失thyA基因，將不能提供胸腺嘧啶。所以，改造后的乳酸菌不能在外界環(huán)境中繁殖生長，對環(huán)境不存在任何污染，也不會對環(huán)境中的其他微生物產(chǎn)生影響。

2、本發(fā)明構(gòu)建的菌株不涉及任何對人體和環(huán)境有害的元素，包括抗生素、質(zhì)粒以及可能產(chǎn)生毒性蛋白的基因等，因此可以安全用于人體。中國專利200910041386.X發(fā)明的表達OXM的轉(zhuǎn)基因雙歧桿菌含有氨芐青霉素抗性基因，人長期服用會導致耐藥性， 而且這種菌株隨糞便排出體外后，會與環(huán)境中的其他菌株發(fā)生重組，導致產(chǎn)生“超級菌”的可能性增大；而且現(xiàn)在有很多人對氨芐青霉素過敏，使適用人群受限。

3、該菌對肥胖小鼠的減重效果優(yōu)于中國專利200910041386.X報道表達OXM的轉(zhuǎn)基因雙歧桿菌。在相同的時間內(nèi)，使用相同的劑量，雙歧桿菌使體重減少21.4％，而乳酸乳球菌使體重減少了31.1％。而且，血液、肝臟中的膽固醇含量明顯降低，接近正常水平。動物實驗顯示，小鼠體重在喂食OXM轉(zhuǎn)基因乳酸乳球菌1個月之后，不僅體重降至正常值，而且空腹血糖含量也趨于正常。

4、該菌對糖尿病小鼠同樣具有減肥降脂的效果，受益人群將擴展至肥胖患者、糖尿病患者、脂代謝紊亂的代謝綜合征患者。

附圖說明

圖1是PCR鑒定基因型結(jié)果圖。

圖2是乳酸乳球菌表達OXM的免疫印跡檢測結(jié)果。

圖3是乳酸乳球菌喂食肥胖小鼠后5小時后，檢測血清中OXM的含量。

圖4是乳酸乳球菌喂食肥胖小鼠后體重變化曲線圖。

圖5是乳酸乳球菌喂食肥胖小鼠6周后攝食量曲線。

圖6是與雙歧桿菌效果對比圖。

圖7是乳酸乳球菌喂食肥胖小鼠6周后腹部CT掃描圖。A是正常小鼠；B是肥胖小鼠喂食NZ9000；C是肥胖小鼠喂食NZ9000-OXM(白線內(nèi)淺色區(qū)域為脂肪分布區(qū))。

圖8是乳酸乳球菌喂食肥胖小鼠6周后小鼠全身體脂肪重量示意圖。

圖9是乳酸乳球菌喂食肥胖小鼠6周后小鼠空腹血糖含量。

圖10是乳酸乳球菌喂食肥胖小鼠6周后小鼠血清里膽固醇的含量。

圖11是乳酸乳球菌喂食糖尿病小鼠5周后體重變化曲線圖

圖12是乳酸乳球菌喂食糖尿病小鼠5周后小鼠血清里膽固醇的含量。

具體實施方式

根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。

實施例1：OXM基因轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌的制備。

(1)、同源重組片段的構(gòu)建：

根據(jù)已發(fā)表的乳酸菌L.lactis全基因組中thyA基因序列，分別找出起始密碼子上游1000bp和終止密碼子下游1000bp的序列。

根據(jù)人OXM氨基酸及核酸序列，參考乳酸乳球菌密碼子使用頻率，優(yōu)化OXM核酸序列，得到的序列如SEQ ID NO:1所示。

人工化學合成基因片段OXM-M：乳酸乳球菌thyA基因起始密碼子上游1000bp+人OXM基因序列+乳酸菌thyA終止密碼子下游1000bp的序列。

(2)、OXM轉(zhuǎn)基因乳酸乳球菌的制備和篩選：

將人胃泌酸調(diào)節(jié)素片段OXM-M電轉(zhuǎn)化至菌株L.lactis NZ9000，命名為L.lactis OXM。

取2ul OXM-M，加入到40μl乳酸乳球菌感受態(tài)細菌懸液中混勻，置冰上5分鐘，然后轉(zhuǎn)移到0.4cm電擊杯中。

將電擊杯置電穿孔儀的電擊盒中，啟動電源進行電轉(zhuǎn)化。電擊條件：電壓2000V，電容25μF，電阻200Ω，電擊時間約4毫秒。

電擊完成后，迅速取出菌液，加入1ml M17培養(yǎng)基，冰上5min后，30℃培養(yǎng)1h，然后涂布于含有胸腺嘧啶脫氧核苷的固體培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)。次日，挑取單克隆分別接種缺乏以及添加胸腺嘧啶脫氧核苷的固體培養(yǎng)基，若在含有胸腺嘧啶脫氧核苷的固體培養(yǎng)基生長，在不含胸腺嘧啶脫氧核苷的固體培養(yǎng)基上不能生長的的菌株為陽性菌。

(3).OXM基因轉(zhuǎn)化菌的基因型鑒定。

設計3對基因型鑒定的PCR引物。

引物1：1F(SEQ ID No：2)5’-GGTTTTATTGTTTCATTAGT-3’，位于thyA上游序列；

1R(SEQ ID No：3)5’-GAGATAATCTTTTTTTTCAT-3’，位于OXM基因序列起始。

引物2：2F(SEQ ID No：4)5’-GGAATAACATTGCCTAATGA-3’，位于OXM基因序列末尾；

2R(SEQ ID No：5)5’-TTTATTATTAGGGAAAGCAA-3’，位于thyA下游序列。

引物3：3F(SEQ ID No：6)5’-ATGACTTACGCAGATCAAGT-3’，位于thyA基因序列起始；

3R(SEQ ID No：7)5’-TTAAATTGCTAAATCAAATT-3’，位于thyA基因序列末尾。

吸取2ul過夜培養(yǎng)的菌液，進行標準PCR反應。

PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示，菌株NZ9000未實施基因重組，僅能用引物3擴增出thyA的序列。重組菌株NZ9000-OXM缺失thyA基因，因此用引物3進行PCR就沒有產(chǎn)物，引物1和2分別都能擴增出含有OXM基因序列的片段。

(4).OXM表達鑒定

接種5ml培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)過夜。

次日離心菌液，上清樣品中加入1/3體積的100三氯醋酸(TCA)混勻，冰上靜置20-30分鐘，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘沉淀蛋白，棄上清；加原樣品三倍體積的丙酮，室溫靜置10分鐘溶解TCA，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘沉淀蛋白，棄上清；加1×SDS上樣緩沖液溶解蛋白。細菌沉淀加入溶菌酶于37℃溫育30分鐘，混勻后加入500ul RIPA裂解液于冰上超聲，離心12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘棄上清，加入1×SDS上樣緩沖液溶解蛋白。

所有樣品于95℃煮5分鐘后，進行18％SDS-PAGE電泳，再穩(wěn)壓冰浴電轉(zhuǎn)至PVDF膜，BSA室溫封閉1h后，TBST漂洗3×5min，加入兔抗OXM抗體(1：500)，4℃孵育過夜。TBST漂洗3次，每次5min再加HRP標記的抗兔二抗(1：5000)，室溫孵育1h，TBST漂洗3次，每次5min，ECL化學發(fā)光法顯影。

結(jié)果如圖2所示，L.lactis NZ9000未檢測到OXM表達，而L.lactis NZ9000-OXM的菌體和培養(yǎng)基上清都能檢測到OXM的表達，說明L.lactis NZ9000-OXM成功表達了OXM，并且能分泌到細胞外。

實施例2：OXM轉(zhuǎn)化乳酸菌減肥降脂藥效學實驗。

(1)準備剛斷乳B6小鼠若干只，高脂喂食直至肥胖小鼠造模成功。肥胖標準為：(實驗組體重-正常小鼠平均體重)/正常小鼠平均體重>20％。將肥胖小鼠分成2組，每組10只，繼續(xù)高脂飲食喂飼。一組為對照組，喂食乳酸乳球菌L.lactis NZ9000。另一組為實驗組，喂食乳酸乳球菌L.lactis NZ9000-OXM。同時設立正常對照組，即正常飲 食B6小鼠不喂食乳酸乳球菌。

(2)每只小鼠以灌胃的方式給予5*10⁹CFU乳酸乳球菌，每2天灌胃1次。跟蹤觀測小鼠體重、進食量及其他生命體征。首次灌胃5小時后，取小鼠血清，用質(zhì)譜檢測OXM含量。結(jié)果如圖3，灌胃NZ9000-OXM之后，小鼠血清中OXM含量顯著上升了近2.5倍，達到約497ng/ml。這結(jié)果進一步說明L.lactis NZ9000-OXM在小鼠體內(nèi)也能分泌表達OXM。對比實驗發(fā)現(xiàn)喂食等量OXM重組雙岐桿菌(專利授權(quán)200910041386.X)，小鼠血清中OXM含量約380ng/ml，低于OXM重組乳酸乳球菌。體重監(jiān)測數(shù)據(jù)如圖4所示，L.lactis NZ9000-OXM喂食肥胖小鼠4周后，其體重顯著性下降。到5周時，體重接近于正常小鼠。直到9周實驗結(jié)束，體重仍維持在24g左右。而L.lactis NZ9000小鼠到實驗結(jié)束時，體重只是略有減少。與已獲得專利授權(quán)(200910041386.X)的OXM重組雙歧桿菌對比后發(fā)現(xiàn)，相同時間內(nèi)乳酸乳球菌L.lactis OXM能使肥胖小鼠體重下降31.1％，而OXM重組雙岐桿菌只能使小鼠體重下降21.4％(圖6)。由此可見，L.lactis NZ9000-OXM具有更好的減重效果。

(3)持續(xù)喂食乳酸乳球菌6周后，用代謝籠實驗檢測小鼠24小時進食量。結(jié)果顯示(圖5)，喂食L.lactis NZ9000-OXM的小鼠進食量顯著降低，約為L.lactis NZ9000對照組的1/2。NZ3900-OXM使小鼠進食量比對照組下降42.1％，與中國專利200910041386.X報道的OXM轉(zhuǎn)基因雙歧桿菌對比后發(fā)現(xiàn)，而OXM轉(zhuǎn)基因雙歧桿菌只能使小鼠進食量比對照組下降28.2％(圖6)。由此可見，L.lactis NZ9000-OXM能更好的抑制食欲，減少進食量，從而控制體重。

(4)持續(xù)喂食乳酸乳球菌6周后，用小動物CT掃描分析小鼠腹部脂肪分布情況。圖7是腹腔橫斷面掃描圖，白線圈出的淺灰色區(qū)域為脂肪組織。A圖為普通飲食對照組小鼠，B圖為喂食L.lactis NZ9000組小鼠，C圖為喂食L.lactis NZ9000-OXM組小鼠。可以看出NZ9000-OXM組小鼠的體內(nèi)脂肪含量明顯下降。用CT分析軟件計算出脂肪占總體積的比例，然后換算成每只小鼠所含脂肪重量，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析后如圖8所示。結(jié)果顯示，喂食乳酸乳球菌L.lactis NZ9000的小鼠仍存在大量腹部脂肪，而L.lactis OXM小鼠腹部脂肪明顯減少，降至正常小鼠水平。說明L.lactis NZ9000-OXM具有降低體內(nèi)脂肪的作用。

(5)用高脂飲食誘導小鼠肥胖之后，其空腹血糖升高至7mmol/L左右(圖9)，明顯高于正常小鼠。但是喂食乳酸乳球菌6周后，L.lactis NZ9000組小鼠空腹血糖含量為 6.5mmol/L左右，L.lactis OXM組小鼠空腹血糖含量恢復到正常水平，約5mmol/L左右。對比實驗表明，申請?zhí)枮?00910041386.X的中國專利報道的OXM轉(zhuǎn)基因雙歧桿菌不能調(diào)節(jié)小鼠空腹血糖。因此，OXM重組乳酸乳球菌優(yōu)于OXM重組雙歧桿菌，具有降低空腹血糖的作用。

(6)用高脂飲食誘導小鼠肥胖之后，其血清中膽固醇的含量為2.42mol/l。實驗結(jié)束小鼠處死后，取血檢測血清膽固醇含量。如圖10所示，正常小鼠血清膽固醇含量為2.167mol/l，喂食L.lactis NZ9000的小鼠血清膽固醇含量為3.478mol/l，喂食L.lactis NZ9000-OXM之后小鼠的血清膽固醇含量下降至1.83mol/l，顯著低于喂食L.lactis NZ9000的小鼠。而在相同時間里申請?zhí)枮?00910041386.X的中國專利報道的OXM重組雙歧桿菌僅能使膽固醇含量降至2.4mol/l左右。因此，本發(fā)明提供的乳酸乳球菌L.lactis NZ9000-OXM能明顯降低血清中的膽固醇。

實施例3：OXM轉(zhuǎn)化乳酸菌對基因缺陷型糖尿病小鼠的減肥降脂藥效學實驗。

1.準備8周大小db/db小鼠20只，將肥胖小鼠分成2組，每組10只。一組為對照組，喂食乳酸乳球菌L.lactis NZ9000。另一組為實驗組，喂食乳酸乳球菌L.lactis NZ9000-OXM。同時設立正常對照組，即正常飲食B6小鼠不喂食乳酸乳球菌。

2.每只小鼠以灌胃的方式給予5*10⁹CFU乳酸乳球菌，每天灌胃。體重監(jiān)測數(shù)據(jù)如圖11所示，喂食OXM組的小鼠的體重與給藥之前自身體重相比，能夠維持不變。而NZ9000組小鼠體重仍持續(xù)增加，5周約增加了8％。通過本實驗可以發(fā)現(xiàn)，L.lactis NZ9000-OXM能夠有效控制糖尿病小鼠的體重增長。

3.同時，取血檢測血清膽固醇含量(圖12)，喂食OXM組的小鼠血清膽固醇含量顯著下降至5.58mol/l，顯著低于對照組。這一結(jié)果提示，L.lactis NZ9000-OXM能夠顯著降低糖尿病小鼠的血脂。

上述結(jié)果表明，OXM轉(zhuǎn)化乳酸菌可在小鼠腸道內(nèi)表達分泌OXM，表達的OXM可通過作用于體內(nèi)相應的受體，抑制食欲和能量吸收。說明OXM重組乳酸乳球菌有顯著的減肥、降脂、降糖生物學作用。