識別癌細胞上表達的CD-43和CEA的含糖表位的抗體及其使用方法對相關(guān)申請的交叉引用本申請要求于2006年6月7日提交的美國臨時申請序列號60/811,850的優(yōu)先權(quán)，所述美國臨時申請整體引入本文作為參考。技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及識別非造血系統(tǒng)腫瘤或癌(non-hematopoietictumororcancer)細胞上表達的CD-43和癌胚抗原（CEA）的含糖表位的新單克隆抗體。這些抗體具有在不存在細胞毒素綴合和免疫效應(yīng)子功能的情況下，在這些非造血系統(tǒng)腫瘤或癌細胞中誘導(dǎo)細胞死亡（例如，凋亡）的性質(zhì)。這些單克隆抗體可以用作診斷和治療劑。

背景技術(shù)：
CD43（也稱為涎福林或白涎蛋白）——一種高唾液酸化的分子——在大多數(shù)人白細胞，包括所有T細胞和血小板，上以高水平表達，具有115,000-135,000的分子量。CD43表達在具有威-奧二氏綜合征的男性的T細胞上有缺陷，所述威-奧二氏綜合征是X染色體連鎖的隱性遺傳免疫缺陷病癥（Remold-O'Donnell等人（1987）Blood70（1）：104-9；Remold-O'Donnel等人（1984）J.Exp.Med.159：1705-23）。功能研究證實抗CD43單克隆抗體刺激外周血T淋巴細胞的增殖（Mentzer等人（1987）J.Exp.Med.1；165（5）：1383-92；Park等人（1991）Nature，350：706-9）和單核細胞的激活（Nong等人（1989）J.Exp.Med.l：170（l）：259-67）。單克隆抗CD43抗體L11阻斷T細胞與淋巴結(jié)和淋巴集結(jié)HEV結(jié)合?？贵wL11抑制T細胞從血液外溢到集結(jié)的次級淋巴組織內(nèi)（McEvoy等人（1997）J.Exp.Med.185：1493-8）。識別CD43分子的單克隆抗體誘導(dǎo)以高密度表達CD34的譜系標記陰性骨髓造血祖細胞（HPCs）（Bazil等人（1996）Blood，87（4）：1272-81.）和人T類淋巴母細胞（Brown等人（1996）J.Biol.Chem.271：27686-95）的凋亡。近期研究進一步指出CD43可以充當人T細胞上的E-選擇蛋白的配體（Matsumoto等人（2005）J.Immunol.175：8042-50；Fuhlbrigge等人（2006）Blood，107：1421-6）。有趣的是，科學家也已發(fā)現(xiàn)某些非造血系統(tǒng)腫瘤細胞，特別是結(jié)腸直腸癌，在細胞表面上的確表達CD43分子。Santamaria等人（1996）CancerResearch，56：3526-9：Baeckstrom等人（1995）J.Biol.Chem.270：13688-92；Baeckstrom等人（1997）J.Biol.Chem.272：11503-9；Sikut等人（1997）Biochem.Biophy.Res.Commun.238：612-6。已顯示在結(jié)腸癌細胞系（COLO205）中表達的CD43上的聚糖與白細胞CD43上的聚糖不同（Baeckstrom等人（1997）J.Biol.Chem.272：l1503-9）。盡管已暗示CD43的過表達引起腫瘤抑制蛋白p53的激活（Kadaja等人（2004）Oncogene23：2523-30）和抑制NF-κB靶基因的子集（部分地經(jīng)由對p65轉(zhuǎn)錄活性的抑制（Laos等人（2006）Int.J.Oncol.28：695-704），但仍缺乏證示CD43在結(jié)腸腫瘤發(fā)生中的原因性作用的直接證據(jù)。由于常規(guī)抗CD43抗體與腫瘤和免疫T細胞均有強結(jié)合，故其作為非造血系統(tǒng)腫瘤細胞的治療劑的用途是不實際的。還需要產(chǎn)生與非造血系統(tǒng)腫瘤或癌細胞上表達的CD43特異性結(jié)合，但不與造血系統(tǒng)起源的白細胞或其他細胞上表達的CD43結(jié)合的抗體。這些抗體作為用于治療表達CD43的非造血系統(tǒng)癌癥的治療劑可能是有用的。CEA通常表達于各種腺上皮組織（例如胃腸道、呼吸道和泌尿生殖道）中，在其中它看起來位于細胞的頂端表面(apicalsurface)（Hammarstrom，S.（1999）Semin.CancerBiol.9，67—81.）。在起于這些組織的腫瘤中，存在從頂膜區(qū)域延伸到整個細胞表面的遞增水平的CEA表達，以及該蛋白質(zhì)向血液內(nèi)的分泌（Hammarstrom，S.（1999）Semin.CancerBiol.9，67-81.）。CEA的過量表達在許多類型的癌癥中觀察到，包括結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、肝細胞瘤、乳腺癌和甲狀腺癌。因此，CEA已用作腫瘤標記，并且測量癌癥患者血液中升高量的CEA的免疫學測定法長久以來已在臨床上用于癌癥的預(yù)后和控制（GoldP,等人（1965）J.Expl.Med.122：467-81；Chevinsky，A.H.（1991）Semin.Surg.Oncol.7，162-166；Shively，J.E.等人，（1985）Crit.Rev.Oncol.Hematol.2，355-399）。更重要的是，CEA已成為用于靶向治療的潛在有用的腫瘤相關(guān)抗原（KurokiM,等人（2002）AnticancerRes22：4255-64）。已開發(fā)了使用CEA作為癌癥免疫治療的靶的2種主要策略。一種方法是通過抗CEA抗體使自殺基因（一氧化氮合酶（iNOS）基因）（KurokiM.等人，（2000）AnticancerRes.20（6A）：4067-71）或同位素（WilkinsonRW.等人，（2001）PNASUSA98，10256-60，Goldenberg，D.M.（1991）Am.J.Gastroenterol.，86：1392-1403，OlafsenT.等人，ProteinEngineering，Design&Selection，17，21-27，2004）特異性靶向表達CEA的腫瘤細胞。這種方法已擴展至與治療劑綴合的抗體或抗體片段的使用，所述治療劑例如藥物、毒素、放射性核苷酸、免疫調(diào)節(jié)劑或細胞因子。另一種方法使用免疫細胞溶解活性，特別是通過抗體依賴性細胞毒性（ADCC）或補體依賴性細胞毒性（CDC），以消除表達CEA的腫瘤細胞（ImakiireT等人，（2004）Int.J.Cancer：108，564-570）。這些方法通常造成細胞因子釋放，導(dǎo)致全身性副作用。本文公開的所有參考文獻、出版物和專利申請在此整體引入作為參考。發(fā)明概述在一個方面，本發(fā)明提供新的抗體，該抗體與非造血系統(tǒng)癌細胞表達的CD43和CEA上的表位特異性結(jié)合，但不與白細胞（例如，人外周T細胞）或Jurkat細胞（或類淋巴母細胞性(lymphoblastoid)白血病細胞）表達的CD43特異性結(jié)合。與該抗體結(jié)合的表位包含糖。這些抗體在不存在與抗體的細胞毒素綴合和免疫效應(yīng)子功能的情況下，在這些非造血系統(tǒng)癌細胞中能夠誘導(dǎo)細胞死亡。本發(fā)明提供了抗體，所述抗體與非造血系統(tǒng)癌細胞表達的CD43和/或CEA上的表位特異性結(jié)合，但不與白細胞或Jurkat細胞表達的CD43特異性結(jié)合，并且所述抗體在不存在細胞毒素綴合和免疫效應(yīng)子功能的情況下，在與非造血系統(tǒng)癌細胞的細胞表面上表達的表位結(jié)合后，能夠誘導(dǎo)該非造血系統(tǒng)癌細胞凋亡，其中所述表位包含糖，并且抗體與表位的結(jié)合被包含Lea結(jié)構(gòu)、Lea-乳糖結(jié)構(gòu)、LNDFHII結(jié)構(gòu)、或LNT結(jié)構(gòu)的糖抑制。在某些實施方案中，與抗體結(jié)合的表位是巖藻糖敏感性的。非造血系統(tǒng)癌細胞包括但不限于來自結(jié)腸直腸癌和胃癌的細胞。在某些實施方案中，本文描述的抗體是單克隆抗體。在某些實施方案中，本文描述的抗體是鼠類、人、人源化、或嵌合抗體。在某些實施方案中，本文描述的抗體在與非造血系統(tǒng)癌細胞的細胞表面上表達的表位結(jié)合后，減少癌細胞的數(shù)目、和/或抑制癌細胞的生長或增殖。例如，與不存在抗體的情況下的細胞數(shù)目或細胞生長比較，抗體存在下的細胞數(shù)目的減少或細胞生長的抑制是至少約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約65％、約75％或更高。在某些實施方案中，本文描述的抗體識別由非造血系統(tǒng)癌細胞表達的CD43和CEA的胞外域上的構(gòu)象表位，其中該構(gòu)象表位包括與三肽N'-Trp-Pro-Ile-C'形成的結(jié)構(gòu)具有等價的物理和化學特征的結(jié)構(gòu)。在某些實施方案中，本文描述的抗體與在N端包含N'-Trp-Pro-Ile-C'的氨基酸序列的多肽結(jié)合。在某些實施方案中，本文描述的抗體與包含如下重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體競爭結(jié)合非造血系統(tǒng)癌細胞的細胞表面上呈現(xiàn)的表位，所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：1的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：2的氨基酸序列。在某些實施方案中，本文描述的抗體與包含如下重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體競爭結(jié)合非造血系統(tǒng)癌細胞的細胞表面上呈現(xiàn)的表位，所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：3的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：4的氨基酸序列。在某些實施方案中，本文描述的抗體與包含如下重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的抗體競爭結(jié)合非造血系統(tǒng)癌細胞的細胞表面上表達的表位，所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：5的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：6的氨基酸序列。在某些實施方案中，抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含來自SEQIDNO：1的氨基酸序列的3個CDRs，所述輕鏈可變區(qū)包含來自SEQIDNO：2的氨基酸序列的3個CDRs。在某些實施方案中，抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：1的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：2的氨基酸序列。在某些實施方案中，抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含來自SEQIDNO：3的氨基酸序列的3個CDRs，所述輕鏈可變區(qū)包含來自SEQIDNO：4的氨基酸序列的3個CDRs。在某些實施方案中，抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：3的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：4的氨基酸序列。在某些實施方案中，抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含來自SEQIDNO：5的氨基酸序列的3個CDRs，所述輕鏈可變區(qū)包含來自SEQIDNO：6的氨基酸序列的3個CDRs。在某些實施方案中，抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：5的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：6的氨基酸序列。在某些實施方案中，抗體是包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的人源化抗體，所述重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：7的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO：8的氨基酸序列。在另一個方面，本發(fā)明提供了包含本文描述的抗體的重鏈和/或輕鏈或片段的多肽。本發(fā)明還提供了衍生自本文描述的任何抗體的多肽，其中所述多肽與非造血系統(tǒng)癌細胞表達的CD43和CEA上的表位特異性結(jié)合，但不與白細胞或Jurkat細胞表達的CD43特異性結(jié)合，并且在不存在細胞毒素綴合和免疫效應(yīng)子功能的情況下，在與非造血系統(tǒng)癌細胞的細胞表面上表達的CD43結(jié)合后，能夠誘導(dǎo)非造血系統(tǒng)癌細胞凋亡。在另一個方面，本發(fā)明提供了編碼本文描述的任何抗體或多肽的多核苷酸。本發(fā)明還提供了包含本文描述的任何多核苷酸的載體（例如，表達載體）。本發(fā)明還提供了包含本文描述的任何多核苷酸或載體的宿主細胞。在另一個方面，本發(fā)明提供了包含本文描述的任何抗體或多肽的組合物。在某些實施方案中，抗體或多肽與試劑連接。在某些實施方案中，試劑是治療劑（例如，放射性部分、細胞毒素和化學治療劑）。在某些實施方案中，試劑是標記物（例如，酶、熒光分子和生物素）。本發(fā)明還提供了藥物組合物，其包含有效量的本文描述的任何抗體或多肽、或編碼抗體或多肽的多核苷酸，和藥學上可接受的載體。在某些實施方案中，抗體或多肽與治療劑連接。在某些實施方案中，組合物配制用于通過腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下和肌內(nèi)注射，以及其他施用形式，例如口服、粘膜、經(jīng)由吸入、舌下等施用。在某些實施方案中，組合物可以包含一種以上的本發(fā)明抗體、或一種本發(fā)明抗體與一種或多種其他抗癌抗體或其他抗癌劑。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生本文描述的抗體或多肽的方法，其包括在允許抗體或多肽生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)宿主細胞或其后代，其中宿主細胞包含編碼抗體或多肽的表達載體。在某些實施方案中，該方法進一步包括純化抗體或多肽。在另一個方面，本發(fā)明提供了通過下述來產(chǎn)生本文描述的任何抗體的方法：在合適的細胞中表達編碼抗體（其可以作為單個輕或重鏈分開表達，或輕和重鏈可以由1個載體表達）的一種或多種多核苷酸，一般地隨后回收和/或分離目的抗體或多肽。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于在細胞表面表達表位的非造血系統(tǒng)癌細胞中誘導(dǎo)凋亡的方法，其包括使癌細胞與本文描述的抗體或多肽接觸。在某些實施方案中，癌細胞在個體中。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于治療個體中的非造血系統(tǒng)癌癥的方法，其包括給個體施用有效量的包含本文描述的抗體或多肽的組合物，其中抗體或多肽與個體中的癌細胞結(jié)合。在某些實施方案中，癌癥是結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、胃癌或肺癌。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于治療個體中的非造血系統(tǒng)癌癥的方法，其包括給個體施用一定量的本文描述的抗體或多肽，和一定量的另一種抗癌劑，其中抗體或多肽與個體中的癌細胞結(jié)合，并且由此抗體或多肽和抗癌劑聯(lián)合提供對個體中的癌癥的有效治療。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于治療個體中的非造血系統(tǒng)癌癥的試劑盒，其包含本文描述的抗體或多肽。這些試劑盒可以進一步包含用于給個體施用抗體或多肽以治療癌癥的說明書。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于檢測或診斷非造血系統(tǒng)癌癥、鑒定可以治療的患有非造血系統(tǒng)癌癥的個體、或監(jiān)控非造血系統(tǒng)癌癥的進展的方法，其包括使樣品與本文描述的抗體或多肽接觸；和檢測抗體或多肽與樣品中的細胞有無結(jié)合、或結(jié)合水平?？贵w和樣品中的細胞之間的結(jié)合的存在指示樣品可能包含癌細胞，和/或患有癌癥的個體可以用本文描述的抗體進行治療。該方法可以進一步包括與對照的結(jié)合水平相比較的步驟。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于檢測或診斷非造血系統(tǒng)癌癥、鑒定可用于治療的患有非造血系統(tǒng)癌癥的個體、或鑒定非造血系統(tǒng)癌癥的進展的試劑盒，其包含本文描述的抗體或多肽、和用于檢測抗體或多肽與樣品中的細胞的結(jié)合的試劑。附圖簡述圖1顯示5F1的靶蛋白的鑒定結(jié)果。來自COLO205裂解物（泳道1和3）或COLO320裂解物（泳道2和4）的5F1免疫親和柱的洗脫物中的蛋白質(zhì)用商業(yè)抗CD43抗體AF2038（泳道1和2）或抗體5F1（泳道3和4）進行免疫印跡。圖2A顯示抗體5F1與3種癌細胞系結(jié)合的流式細胞術(shù)分析結(jié)果：結(jié)腸直腸癌細胞（COLO205和DLD-1）、和胃癌細胞（NCI-N87）。圖2B顯示抗體5F1與正常內(nèi)皮細胞（HUVEC）、正常（胚胎）肺細胞（MRC-5）、正常乳腺上皮細胞（MCF-10A）、正常結(jié)腸直腸細胞（CCD841-CoN）、激活的T淋巴細胞（激活7天）、或正常外周血單核細胞（PBMC）結(jié)合的流式細胞術(shù)分析結(jié)果。圖3顯示在抗體5F1或9E10（抗myc抗體）、或?qū)φ张囵B(yǎng)基的存在下溫育6、24和48小時后在COLO205細胞的細胞質(zhì)中核小體的富集。圖4顯示在與抗體5F1、9E10或疊氮化物在體外溫育72小時后通過WST-1測定法測量的COLO205的細胞生長結(jié)果。圖5顯示通過WST-1測定法測量的細胞生長結(jié)果。結(jié)腸直腸癌細胞COLO205和正常結(jié)腸直腸細胞系CCD841-CoN未經(jīng)處理，或與9E10、5F1（稱為“m133-5F1”）或0.5％疊氮化物溫育。圖6顯示在與各種濃度的5F1（0、2、4、8、16、32、64ug/ml）、9E10（64ug/ml）或0.5％疊氮化物溫育后COLO205細胞的MTT染色結(jié)果。圖7顯示抗體5F1（也稱為“m133-5F1”）對SCID小鼠中的人COLO205腫瘤的體內(nèi)效應(yīng)（對腫瘤大?。??？贵w5F1（以500μg/注射）、或?qū)φ湛贵w9E10（以500μg/注射）、或PBS（未經(jīng)處理的）在第0、3、5、7、10、12、14和17天時進行注射。圖8顯示抗體5F1與化學藥品5FU/LV對SCID小鼠中的人COLO205腫瘤的體內(nèi)效應(yīng)（對腫瘤大小）。在COLO205細胞接種后，5FU/LV用一周4次25mg/kg的劑量每隔一天進行靜脈內(nèi)注射?？贵w5F1在腫瘤植入后7天以0、6.25mg/kg、12.5mg/kg和25mg/kg每周2次進行腹膜內(nèi)注射，共3周。圖9A顯示嵌合抗體5F1與COLO205細胞結(jié)合的流式細胞術(shù)結(jié)果。圖9B顯示在COLO205細胞與對照培養(yǎng)基（未加處理的）、疊氮化鈉（0.5％）、小鼠抗體5F1（m5F1，2-32μg/ml）、或嵌合抗體5F1（c5F1，2-32μg/ml）溫育后，膜聯(lián)蛋白V和PI陽性細胞的百分比。圖10顯示在與各種抗體溫育后就凋亡細胞的死亡而言對COLO205和NCI-N87細胞的染色。COLO205和NCI-N87細胞與對照、9E10（30ug/ml）、m5F1（10ug/ml）、或m5F1（30ug/ml）溫育過夜。細胞隨后用YO-PRO-1（A）或組合的膜聯(lián)蛋白V和PI（B）進行染色。關(guān)于每種條件的染色百分比顯示于柱形圖中。圖11顯示m5F1與COLO205細胞上表達的重組人CEA（rhCEA）結(jié)合，但不識別COS-7細胞上表達的rhCEA。在圖11A中，表達flag標簽的人CEA的COLO205的細胞裂解物用抗Flag抗體M2進行免疫沉淀，免疫沉淀的蛋白質(zhì)在SDS-PAGE上進行電泳且隨后轉(zhuǎn)移至NC紙上。如所示的，NC紙與抗FlagM2、m5F1、51-41、138-10或CEA/Ab-3溫育。在圖11B中，表達flag標簽的人CEA的COS-7細胞（+）或不表達CEA的COS-7細胞（-）的細胞裂解物用抗Flag抗體M2進行免疫沉淀，免疫沉淀的蛋白質(zhì)在SDS-PAGE上進行電泳且隨后轉(zhuǎn)移至NC紙上。如所示的NC紙與抗FlagM2、m5F1或CEA/Ab-3溫育。圖12顯示m5F1與COLO205細胞上表達的重組CD43（rhCD43）結(jié)合，但不識別COS-7細胞上表達的rhCD43。在圖12A中，用蛋白A瓊脂糖珠純化的由COLO205細胞表達的可溶性CD43在SDS-PAGE上進行電泳且轉(zhuǎn)移至NC紙，并且NC紙用抗體m5F1、51-41或138-10進行蛋白質(zhì)印跡。在圖12B中，用hCD43、hCD43/myc-His轉(zhuǎn)染的COS-7細胞或未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞的細胞裂解物在SDS-PAGE上進行電泳且隨后轉(zhuǎn)移至NC紙，并且NC紙與抗CD43（MEM59）（左圖）或m5F1（右圖）進行蛋白質(zhì)印跡。圖13顯示m5F1抗體識別巖藻糖依賴性糖表位。由COLO205細胞表達的rhCEA用0、0.01、0.03、0.1mUα-1→（2,3,4）-巖藻糖苷酶進行處理。處理后，蛋白質(zhì)在SDS-PAGE上進行電泳，然后進行考馬斯藍染色（右圖）或用m5F1抗體進行蛋白質(zhì)印跡。圖14顯示路易斯（Lewis）a-乳糖（Lea-乳糖）、路易斯b-乳糖（Leb-乳糖）、路易斯x-乳糖（Lex-乳糖）、乳糖、路易斯y（Ley）、唾液酸-路易斯x（Sialyl-Lex）、路易斯a（Lea）、Lacto-N-四糖（Lacto-N-tetraose）（LNT）、和Lecto-N-二巖藻糖六糖（Lecto-N-difucohexaose）II（LNDFHII）的結(jié)構(gòu)。圖15顯示通過添加寡糖以與m5F1、138-10和51-41競爭結(jié)合COLO205細胞的結(jié)合抑制試驗的結(jié)果。將寡糖（LNDFHII、LNT、sLe（x）、Le（y）、乳糖、Le（x）-乳糖、Le（b）-乳糖、Le（a）-乳糖或Le（a）；各自為1mM）加入包含2x105COLO205細胞的不同孔內(nèi)，隨后添加抗體（138-10、51-41或m5F1）或不添加抗體作為對照?？贵w與COLO205細胞的結(jié)合通過流式細胞術(shù)分析進行測量。對于每種抗體通過寡糖的結(jié)合抑制在圖中顯示為由熒光平均值測定的抑制百分比。發(fā)明詳述定義“抗體”是通過位于免疫球蛋白分子的可變區(qū)中的至少一個抗原識別位點而能夠與靶特異性結(jié)合的免疫球蛋白分子，所述靶例如糖、多核苷酸、脂質(zhì)、多肽等。如本文所使用的，該術(shù)語不僅包括完整的多克隆或單克隆抗體，還包括其片段（例如Fab、Fab'、F（ab'）2、Fv）、單鏈（ScFv）、突變體、包含抗體部分的融合蛋白、以及包含抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他經(jīng)修飾的構(gòu)型?？贵w包括任何類型的抗體，例如IgG、IgA或IgM（或其亞類），并且抗體無需是任何特定類型。依賴其重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域的抗體氨基酸序列，免疫球蛋白可以分為不同類。存在5大類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中的幾類可以進一步分成亞類（同種型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應(yīng)不同類的免疫球蛋白的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是眾所周知的。本發(fā)明的抗體還旨在包括具有抗體的至少一個CDR區(qū)域所賦予的多肽親和力的雙特異性、多特異性、單鏈、以及嵌合和人源化分子。本發(fā)明的抗體還包括單結(jié)構(gòu)域抗體，其是抗體重鏈的可變結(jié)構(gòu)域或抗體輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域。Holt等人，TrendsBiotechnol.21：484-490，2003。制備結(jié)構(gòu)域抗體的方法也是本領(lǐng)域已知的，所述結(jié)構(gòu)域抗體包含抗體重鏈的可變結(jié)構(gòu)域或抗體輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域，包含來自抗體的6個天然互補決定區(qū)中的3個。參見例如，Muyldermans，Rev.Mol.Biotechnol.74：277-302，2001。如本文所使用的，“單克隆抗體”指基本上均質(zhì)的抗體中的抗體，即該群體中包含的各單個抗體除了可能以小量存在的可能天然突變外，都是相同的。單克隆抗體一般是高特異性的，針對單個抗原位點。此外，與一般包括針對不同決定簇（表位）的不同抗體的多克隆抗體制品不同，每個單克隆抗體針對抗原上的單個決定簇。修飾詞“單克隆”指抗體具有得自基本上均質(zhì)的抗體群體的特征，而不應(yīng)解釋為需要通過任何特定方法生產(chǎn)抗體。例如，待依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可以通過首先由Kohler和Milstein，1975，Nature，256：495描述的雜交瘤方法進行制備，或可以通過例如在美國專利號4,816,567中描述的重組DNA方法進行制備。單克隆抗體還可以從使用例如McCafferty等人，1990，Nature，348：552-554中描述的技術(shù)產(chǎn)生的噬菌體文庫中分離。如本文所使用的，“嵌合抗體”指具有來自第一物種的可變區(qū)或可變區(qū)的一部分和來自第二物種的恒定區(qū)的抗體。完整的嵌合抗體包含嵌合輕鏈的2個拷貝和嵌合重鏈的2個拷貝。嵌合抗體的生產(chǎn)是本領(lǐng)域已知的（Cabilly等人（1984），Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：3273-3277；Harlow和Lane（1988），Antibodies：aLaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory）。一般地，在這些嵌合抗體中，輕和重鏈的可變區(qū)模擬源自一個哺乳動物物種的抗體的可變區(qū)，而恒定區(qū)部分與源自另一哺乳動物種的抗體的序列同源。關(guān)于此類嵌合形式的一個明顯優(yōu)點是例如，可變區(qū)可以通過使用容易獲得的雜交瘤或來自非人宿主生物的B細胞而方便地源自目前已知的來源，并與源自例如人細胞制品的恒定區(qū)組合。盡管可變區(qū)具有容易制備和特異性不受其來源影響的優(yōu)點，但當抗體注射時，與來自非人來源的恒定區(qū)比較，人的恒定區(qū)較不可能在人受試者中引起免疫應(yīng)答。然而，該定義不限于這個具體例子。“分離的”抗體是已得到鑒定且與其天然環(huán)境的組分分離和/或從其中回收的抗體。如本文所使用的，“基本上純的”指至少50％純（即，不含污染物）、更優(yōu)選至少90％純、更優(yōu)選至少95％純、更優(yōu)選至少98％純、更優(yōu)選至少99％純的材料。如本文所使用的，“人源化”抗體指包含最少衍生自非人免疫球蛋白的序列的非人（例如鼠類）抗體形式，其是特異性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈、或其片段（例如，抗體的Fv、Fab、Fab'、F（ab'）2或其他抗原結(jié)合子序列）。就大部分而言，人源化抗體是人免疫球蛋白（受體抗體），其中來自受體的互補決定區(qū)（CDR）的殘基由來自具有所需特異性、親和力和能力的非人物種（供體抗體）例如小鼠、大鼠或兔的CDR的殘基替換。在某些情況下，人免疫球蛋白的Fv構(gòu)架區(qū)（FR）殘基由相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可以包含這樣的殘基，其在受體抗體和導(dǎo)入的CDR或構(gòu)架序列中均不存在，但被包括以進一步改善和最優(yōu)化抗體性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個、和一般2個可變結(jié)構(gòu)域的基本上全部，其中所有或基本上所有的CDR區(qū)對應(yīng)非人免疫球蛋白的那些CDR區(qū)，而所有或基本上所有的FR區(qū)是具有人免疫球蛋白共有序列的那些FR區(qū)。人源化抗體最佳地還將包含至少部分免疫球蛋白（典型地，人免疫球蛋白）恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域（Fc）。抗體可以具有如WO99/58572中所述修飾的Fc區(qū)。其他形式的人源化抗體具有就原始抗體而言改變了的一個或多個CDRs（1、2、3、4、5、6個），其也稱為“衍生自”原始抗體的一個或多個CDRs的一個或多個CDRs。如本文所使用的，“人抗體”意指具有對應(yīng)于人生產(chǎn)的抗體的氨基酸序列的抗體，和/或已使用本領(lǐng)域已知的或本文公開的用于制備人抗體的任何技術(shù)進行制備的抗體。人抗體的這個定義包括包含至少一個人重鏈多肽或至少一個人輕鏈多肽的抗體。一個此類例子是包含鼠類輕鏈和人重鏈多肽的抗體。人抗體可以使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)進行生產(chǎn)。在一個實施方案中，人抗體選自噬菌體文庫，其中所述噬菌體文庫表達人抗體（Vaughan等人，1996，NatureBiotechnology，14：309-314；Sheets等人，1998，PNAS,（USA）95：6157-6162；Hoogenboom和Winter，1991，J.Mol.Biol.，227：381；Marks等人，1991，J.Mol.Biol.，222：581）。人抗體還可以通過將人免疫球蛋白基因座引入轉(zhuǎn)基因動物內(nèi)例如小鼠內(nèi)進行制備，在所述轉(zhuǎn)基因動物中內(nèi)源性免疫球蛋白基因已被部分或完全滅活。這種方法在美國專利號5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；和5,661,016中得到描述?？商娲?，人抗體可以通過使產(chǎn)生抗靶抗原的抗體的人B淋巴細胞永生化（此類B淋巴細胞可以從個體中回收或可以已在體外被免疫）而制備。參見例如，Cole等人，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，AlanR.Liss，第77頁（1985）；Boerner等人，1991，J.Immunol.，147（l）：86-95；和美國專利號5,750,373。抗體的“可變區(qū)”指單獨或組合的抗體輕鏈的可變區(qū)或抗體重鏈的可變區(qū)。重和輕鏈的可變區(qū)各自由通過3個互補決定區(qū)（CDRs）連接的4個構(gòu)架區(qū)（FR）組成，所述CDRs也稱為高變區(qū)。每條鏈中的CDRs通過FRs緊靠在一起，并且與來自另一條鏈的CDRs一起促成抗體的抗原結(jié)合位點的形成。存在用于確定CDRs的至少2種技術(shù)：（1）基于交叉物種序列變異性的方法（即，Kabat等人SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,（第5版，1991，NationalInstitutesofHealth，BethesdaMD））；和（2）基于抗原-抗體復(fù)合物的晶體學研究的方法（Al-lazikani等人（1997）J.Molec.Biol.273：927-948））。如本文所使用的，CDR可以指由任一方法或2種方法的組合定義的CDRs?？贵w的“恒定區(qū)”指單獨或組合的抗體輕鏈的恒定區(qū)或抗體重鏈的恒定區(qū)。抗體的恒定區(qū)一般提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和其他生物學功能，例如抗體鏈結(jié)合、分泌、跨胎盤的移動和補體結(jié)合，但不參與和抗原的結(jié)合。恒定區(qū)基因中的氨基酸序列和相應(yīng)的外顯子序列將取決于其所來源自的物種；但是，在一個物種中對于特定的恒定區(qū)，導(dǎo)致同種異型的氨基酸序列變異是相對有限的。每條鏈的可變區(qū)通過連接多肽序列與恒定區(qū)連接。連接序列由輕鏈基因中的“J”序列，以及重鏈基因中的“D”序列和“J”序列的組合編碼。如本文所使用的，“抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性”和“ADCC”指細胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達Fc受體（FcRs）的非特異性細胞毒性細胞（例如，自然殺傷（NK）細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞）識別靶細胞上結(jié)合的抗體，且隨后引起靶細胞的裂解。目的分子的ADCC活性可以使用體外ADCC測定法進行評估，例如美國專利號5,500,362或5,821,337中描述的ADCC測定法。對于此類測定法有用的效應(yīng)細胞包括外周血單核細胞（PBMC）和NK細胞。可替代地，或另外地，目的分子的ADCC活性可以在體內(nèi)例如在動物模型中進行評估，所述動物模型例如在Clynes等人，1998，PNAS（USA），95：652-656中公開的。“補體依賴性細胞毒性”和“CDC”指在補體存在下對靶的裂解。補體激活途徑由補體系統(tǒng)的第一組分（C1q）與復(fù)合了關(guān)聯(lián)抗原的分子（例如抗體）的結(jié)合來起始。為了評估補體激活，可以執(zhí)行例如如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods，202：163（1996）中描述的CDC測定法。術(shù)語“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指任何長度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是線性的或分支的，它可以包含經(jīng)修飾的氨基酸，并且它可以由非氨基酸間斷。該術(shù)語還包含已天然或通過干預(yù)進行修飾的氨基酸聚合物；例如二硫鍵形成、糖基化、脂質(zhì)化、乙?；⒘姿峄?、或任何其他操作或修飾，例如與標記組分綴合。這個定義內(nèi)還包括的是例如包含氨基酸的一種或多種類似物（包括例如，非天然氨基酸等）的多肽，以及本領(lǐng)域已知的其他修飾。應(yīng)當理解，因為本發(fā)明的多肽基于抗體，所以該多肽可以以單鏈或結(jié)合的鏈的形式存在。如本文可互換使用的，“多核苷酸”或“核酸”指任何長度的核苷酸的聚合物，且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經(jīng)修飾的核苷酸或堿基、和/或其類似物、或可以通過DNA或RNA聚合酶摻入聚合物內(nèi)的任何底物。多核苷酸可以包含經(jīng)修飾的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及其類似物。如果存在對核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾，則該修飾可以在聚合物裝配前或后賦予。核苷酸的序列可以由非核苷酸組分間斷。多核苷酸可以在聚合后進一步修飾，例如通過與標記組分綴合。其他類型的修飾包括例如，“加帽”、用類似物置換一個或多個天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾，例如具有不帶電荷的鍵（例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯（phosphoamidate）、氨基甲酸酯等）和具有帶電荷的鍵（例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）的那些修飾，包含懸掛部分例如蛋白質(zhì)（例如，核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚L-賴氨酸等）的那些修飾，具有嵌合劑（例如吖啶、補骨脂素等）的那些修飾，包含螯合劑（例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等）的那些修飾，包含烷化劑的那些，具有經(jīng)修飾的鍵（例如，α異頭核酸等）的那些修飾，以及未經(jīng)修飾的多核苷酸形式。此外，糖中通常存在的任何羥基可以例如由膦酸酯基團、磷酸酯基置換，由標準保護基團保護，或激活以制備與另外的核苷酸的另外連接，或可以與固體載體綴合。5'和3'末端OH可以進行磷酸化，或用1-20個碳原子的胺或有機封端基團部分進行置換。其他羥基也可以衍生化成標準保護基團。多核苷酸還可以包含本領(lǐng)域一般已知的核糖或脫氧核糖的類似形式，包括例如2'--O-甲基-，2'-O-烯丙基，2'-氟-或2'-疊氮基-核糖，碳環(huán)糖類似物，糖的α-異頭物，糖的差向異構(gòu)體例如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖，無環(huán)類似物和無堿基核苷類似物例如甲基核苷。一個或多個磷酸二酯鍵可以由可替代的連接基團替換。這些可替代的連接基團包括但不限于，其中磷酸酯由P（O）S（“硫代酯”）、P（S）S（“二硫代酯”）、"（O）NR2（“酰胺酯”）、P（O）R、P（O）OR'、CO或CH2（亞甲基縮醛“formacetal”）替換的實施方案，其中每個R或R'獨立地是H或取代的或未取代的烷基（1-20C），所述烷基任選包含醚（-O-）鍵、芳基、鏈烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或araldyl。多核苷酸中的所有鍵不必都相同。先前描述適用于本文提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。如本文所使用的，“載體”意指能夠在宿主細胞中遞送和優(yōu)選表達一種或多種目的基因或序列的構(gòu)建體。載體的例子包括但不限于病毒載體、裸DNA或RNA表達載體、質(zhì)粒、粘?；蚴删w載體、與陽離子縮合劑（condensingagent）結(jié)合的DNA或RNA表達載體、包封在脂質(zhì)體中的DNA或RNA表達載體、和某些真核細胞例如生產(chǎn)細胞。如本文所使用的，“表達控制序列”意指指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的核酸序列。表達控制序列可以是啟動子，例如組成型或誘導(dǎo)型啟動子，或增強子。表達控制序列與待轉(zhuǎn)錄的核酸序列可操作地連接。如本文所使用的，藥物、化合物或藥物組合物的“有效劑量”或“有效量”是足以實現(xiàn)有利或期望結(jié)果的量。對于預(yù)防用途，有利或期望結(jié)果包括這樣的結(jié)果，例如消除或減少疾病的危險、減輕疾病的嚴重度、或延遲疾病的發(fā)作，所述疾病包括疾病的生物化學、組織學和/或行為癥狀、其并發(fā)癥和在疾病發(fā)展期間呈現(xiàn)的中間病理表型。對于治療用途，有利或期望結(jié)果包括臨床結(jié)果，例如減少起因于疾病的一種或多種癥狀，增加患有疾病的個體的生活質(zhì)量，減少治療疾病所需的其他藥物的劑量，例如經(jīng)由靶向作用增強另一種藥物的效果，延遲疾病的進展，和/或延長存活。在癌癥或腫瘤的情況下，藥物的有效量可以在下述方面具有作用：減少癌細胞數(shù)目；減少腫瘤大??；抑制（即，一定程度地減慢和優(yōu)選終止）癌細胞向外周器官的浸潤；抑制（即，一定程度地減慢和優(yōu)選終止）腫瘤轉(zhuǎn)移；一定程度地抑制腫瘤生長；和/或一定程度地減輕與病癥相關(guān)的一種或多種癥狀。有效劑量可以在一次或多次施用中給予。為了本發(fā)明的目的，藥物、化合物或藥物組合物的有效劑量是足以直接或間接地實現(xiàn)預(yù)防或治療的量。如臨床中所理解的，藥物、化合物或藥物組合物的有效劑量可以通過與另一種藥物、化合物或藥物組合物聯(lián)合或不聯(lián)合而達到。因此，在施用一種或多種治療劑的情況下可以考慮“有效劑量”，并且如果單個活性劑聯(lián)合一種或多種其它活性劑達到了或者可以達到期望結(jié)果，則可以認為該單個活性劑是以有效量給予的。如本文所使用的，“與……聯(lián)合”指除了一種治療形式外還施用另一種治療形式。由此，“與……聯(lián)合”指一種治療形式在另一種治療形式施用于個體之前、之時或之后施用。如本文所使用的，“治療”是用于獲得有利或期望結(jié)果，包括和優(yōu)選臨床結(jié)果的方法。為了本發(fā)明的目的，有利或所需臨床結(jié)果包括但不限于，下述中的一種或多種：減少（或破壞）癌細胞的增殖、減少起于疾病的癥狀、增加患有疾病的個體的生活質(zhì)量、減少治療疾病所需的其他藥物的劑量，延遲疾病的進展，和/或延長個體的存活。如本文所使用的，“延遲疾病的進展”意指推遲、阻礙、減慢、延遲、穩(wěn)定、和/或推遲疾?。ɡ绨┌Y）的進展。依賴于待治療的個體和/或疾病史，這種延遲可以具有不同的時間長度。如對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的，足夠或顯著的延遲事實上可以包含預(yù)防，即個體不出現(xiàn)該疾病。例如，晚期癌癥，例如轉(zhuǎn)移的發(fā)生，可以被延遲。“個體”或“受試者”是哺乳動物，更優(yōu)選人。哺乳動物還包括但不限于，家畜、運動動物、寵物（例如貓、犬、馬）、靈長類動物、小鼠和大鼠。如本文所使用的，術(shù)語“特異性識別”或“特異性結(jié)合”指靶和抗體之間的可測量和可再現(xiàn)的相互作用，例如吸引或結(jié)合，這可以在異質(zhì)分子（包括生物分子）群體存在下確定靶的存在。例如，與表位特異性或優(yōu)先結(jié)合的抗體是這樣的抗體，該抗體與該表位的結(jié)合，相比較于該抗體與靶的其他表位或非靶表位的結(jié)合，具有更大的親和性、親合力、更為容易、和/或持續(xù)更長的時間。通過閱讀此定義，也應(yīng)當理解，例如，與第一靶特異性或優(yōu)先結(jié)合的抗體（或部分或表位）可能可以或可能不可以與第二靶特異性或優(yōu)先結(jié)合。由此，“特異性結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”不一定要求（盡管它可以包括）專一結(jié)合。與靶特異性結(jié)合的抗體可以具有至少約103M–l或104M-l，有時約105M-l或106M-l，在其他情況下約106M–l或107M-l、約108M–l至109M-l、或約1010M–l至1011M-l或更高的結(jié)合常數(shù)。各種免疫測定法形式均可以用于選擇與特定蛋白質(zhì)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體。例如，固相ELISA免疫測定法常規(guī)用于選擇與蛋白質(zhì)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的單克隆抗體。關(guān)于可以用于測定特定免疫反應(yīng)性的免疫測定法形式和條件的描述，參見例如，Harlow和Lane（1988）Antibodies，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborPublications，NewYork。如本文所使用的，術(shù)語“癌癥”、“腫瘤”、“癌性”和“惡性”指或描述哺乳動物中典型特征在于不受調(diào)節(jié)的細胞生長的生理情況。癌癥的例子包括但不限于，癌，包括腺癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、黑素瘤和肉瘤。此類癌癥的更具體的例子包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、胃腸癌、何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤、胰腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、宮頸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、卵巢癌、肝臟癌癥例如肝癌和肝細胞瘤、膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌例如腎細胞癌和腎胚細胞瘤、基底細胞癌、黑素瘤、前列腺癌、甲狀腺癌、睪丸癌、食管癌、和各種類型的頭頸癌。如本文和后附權(quán)利要求中所使用的，除非上下文另有明確說明，單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括對復(fù)數(shù)的提及。例如，提及“an”“抗體”是提及一個至多個抗體，例如摩爾量，且包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等價形式等等。應(yīng)當理解本文描述的本發(fā)明的方面和變化包括由方面和變化“組成”和/或基本上由方面和變化“組成”。與非造血系統(tǒng)癌細胞上表達的CD43和CEA上的糖表位特異性結(jié)合的抗體和多肽本發(fā)明提供了分離的抗體和衍生自抗體的多肽，所述抗體和多肽與非造血系統(tǒng)癌細胞表達的CD43和/或CEA上的表位特異性結(jié)合，但不與白細胞（例如外周T細胞）或Jurkat細胞表達的CD43特異性結(jié)合。本發(fā)明的抗體和多肽還可以具有一個或多個下述特征：（a）如果包含表位的分子用α-1→（2,3,4）-巖藻糖苷酶處理，那么抗體或多肽與表位的結(jié)合將減少；（b）抗體或多肽與表位的結(jié)合受包含Lea結(jié)構(gòu)、Lea-乳糖結(jié)構(gòu)、LNDFHII結(jié)構(gòu)、和/或LNT結(jié)構(gòu)的糖抑制；（c）在不存在細胞毒素綴合和免疫效應(yīng)子功能的情況下，在與癌細胞的細胞表面上表達的表位結(jié)合后，誘導(dǎo)非造血系統(tǒng)癌細胞死亡（例如通過凋亡）；（d）在與癌細胞的細胞表面上表達的表位結(jié)合后，抑制非造血系統(tǒng)癌細胞的細胞生長或增殖；和（e）治療或預(yù)防個體中在細胞表面上表達表位的非造血系統(tǒng)癌癥，例如結(jié)腸直腸癌和胃癌。如本文所使用的，術(shù)語“抑制”包括部分和完全抑制。例如，抗體或多肽與CD43和CEA上的表位的結(jié)合被包含Lea結(jié)構(gòu)、Lea-乳糖結(jié)構(gòu)、LNDFHII結(jié)構(gòu)、和/或LNT結(jié)構(gòu)的糖抑制至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、或至少約90％?？贵w與表位的結(jié)合可以被直接競爭或被其他機制抑制。表達表位的非造血系統(tǒng)癌細胞的例子包括但不限于，結(jié)腸直腸癌細胞（例如COLO205和DLD-1）和胃癌細胞（例如NCI-N87）。本發(fā)明的抗體和多肽可以識別非造血系統(tǒng)癌細胞上存在的CD43的胞外域，但不與白細胞CD43（例如，外周T細胞）的胞外域、或Jurkat細胞（類淋巴母細胞性白血病細胞）上表達的CD43的胞外域結(jié)合。在某些實施方案中，本發(fā)明的新抗體或多肽不與造血系統(tǒng)起源的細胞表達的CD43特異性結(jié)合。本發(fā)明的抗體可以包括單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段（例如Fab、Fab'、F（ab'）2、Fv、Fc等）、嵌合抗體、單鏈（ScFv）、它們的突變體、包含抗體部分的融合蛋白、以及包含所需特異性的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他經(jīng)修飾的構(gòu)型。抗體可以是小鼠、大鼠、駱駝、人、或任何其他起源（包括人源化抗體）。多肽（包括抗體）與CD43或CEA的結(jié)合親和力可以小于約500nM、約400nM、約300nM、約200nM、約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM或約50pM中的任何一個。如本領(lǐng)域眾所周知的，結(jié)合親和力可以表示為KD、或解離常數(shù)，增加的結(jié)合親和力對應(yīng)減少的KD。測定抗體與CD43或CEA的結(jié)合親和力的一種方法是測量抗體的單功能Fab片段的結(jié)合親和力。為了獲得單功能Fab片段，抗體（例如，IgG）可以用木瓜蛋白酶進行切割或重組表達?？贵w的Fab片段的親和力可以通過表面等離子體共振（BlAcore3000TM表面等離子體共振（SPR）系統(tǒng)，BIAcore，INC，PiscawayNJ）和ELISA進行測定。獲得動力學結(jié)合速率（Kon）和解離速率（Koff）（一般在25℃測量）；并且平衡解離常數(shù)（KD）值計算為Koff/Kon。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體和多肽減少癌細胞數(shù)目，和/或抑制具有表位的腫瘤或癌細胞的細胞生長或增殖。優(yōu)選地，與未用抗體或多肽處理的細胞比較，細胞數(shù)目中的減少或者細胞生長或增殖的抑制是至少約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約65％、約75％或更高。癌細胞包括但不限于結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、肺癌、胃癌。在某些實施方案中，在與非造血系統(tǒng)癌細胞的細胞表面上表達的表位結(jié)合后，本發(fā)明的抗體和多肽能夠單獨誘導(dǎo)細胞死亡，例如通過凋亡途徑。如本文所使用的，術(shù)語“誘導(dǎo)細胞死亡”意指本發(fā)明的抗體或多肽可以與細胞表面上表達的分子直接相互作用，并且該結(jié)合/相互作用單獨足以在細胞中誘導(dǎo)細胞死亡而無需其他因素例如細胞毒素綴合或其他免疫效應(yīng)子功能（即補體依賴性細胞毒性（CDC）、抗體依賴性細胞毒性（ADCC）、或吞噬作用）的幫助。如本文所使用的，術(shù)語“凋亡”指由基因指導(dǎo)的細胞內(nèi)細胞毀壞過程。凋亡不同于壞死；它包括細胞骨架破壞、細胞質(zhì)收縮和濃縮、磷脂酰絲氨酸在細胞膜的外表面上的表達和起泡，從而導(dǎo)致細胞膜結(jié)合性小泡或凋亡小體的形成。該過程也稱為“程序性細胞死亡”。在凋亡期間，觀察到特征性現(xiàn)象例如彎曲的細胞表面、核染色質(zhì)的濃縮、染色體DNA的斷裂、和線粒體功能的喪失。各種已知的技術(shù)可以用于檢測凋亡，例如用膜聯(lián)蛋白V、碘化丙啶、DNA斷裂測定法和YO-PRO-1（Invitrogen）染色細胞。檢測細胞死亡（例如凋亡）的方法包括但不限于檢測形態(tài)、DNA斷裂、酶活性、和多肽降解等。參見引入本文作為參考的Siman等人，美國專利號6,048,703；Martin和Green（1995），Cell，82：349-52；Thomberry和Lazebnik（1998），Science，281：1312-6；Zou等人，美國專利號6,291,643；Scovassi和Poirier（1999），Mol.CellBiochem.，199：125-37；Wyllie等人，（1980），Int.Rev.Cytol，68：251-306；Belhocine等人（2004），Technol.CancerRes.Treat.，3（1）：23-32。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體和多肽識別在非造血系統(tǒng)癌細胞上表達的構(gòu)象表位，這種表位包括與三肽N'-Trp-Pro-Ile-C'所形成的結(jié)構(gòu)具有等價的物理和化學特征的結(jié)構(gòu)。如本文所使用的，“表位包括與肽所形成的結(jié)構(gòu)具有等價的物理和化學特征的結(jié)構(gòu)”意指2種結(jié)構(gòu)具有相似的與抗體結(jié)合相關(guān)的物理和化學性質(zhì)，從而使得與一種結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合的抗體將與2種結(jié)構(gòu)均可以發(fā)生結(jié)合。在某些實施方案中，抗體和多肽與在N端包含N'-Trp-Pro-Ile-C'氨基酸序列的多肽結(jié)合。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體和多肽與抗體5F1、138-10或51-41競爭結(jié)合癌細胞的細胞表面上表達的表位。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體或多肽與抗體5F1、138-10和51-41中的至少一種所結(jié)合的CD43或CEA上的表位結(jié)合。競爭測定法可以用于確定2種抗體是否可以通過識別相同或空間上重疊的表位而結(jié)合相同表位，或一種抗體是否可以競爭性抑制另一種抗體與抗原的結(jié)合。這些測定法是本領(lǐng)域已知的，并且在實施例中詳細描述。一般地，將抗原或抗原表達細胞固定在多孔板上，并且測量未標記的抗體阻斷標記抗體結(jié)合的能力。用于此類競爭測定法的常用標記是放射性標記或酶標記。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體是抗體5F1或衍生自5F1的抗體。5F1的重鏈和輕鏈可變序列分別在SEQIDNO：1和SEQIDNO：2中闡述。本發(fā)明提供了包含抗體5F1的片段或區(qū)域的抗體或多肽。在一個實施方案中，片段是抗體5F1的輕鏈。在另一個實施方案中，片段是抗體5F1的重鏈。在另外一個實施方案中，片段包含來自抗體5F1的輕鏈和/或重鏈的一個或多個可變區(qū)。在另外一個實施方案中，片段包含來自抗體5F1的輕鏈和/或重鏈的1、2或3個CDRs。在某些實施方案中，抗體是5F1的人源化抗體，例如包含SEQIDNO：7中所示的重鏈可變區(qū)和SEQIDNO：8中所示的輕鏈可變區(qū)的h5F1。在某些實施方案中，衍生自抗體5F1的一個或多個CDRs與5F1的至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、或至少6個CDRs具有至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、或至少約99％的同一性。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體是抗體138-10或衍生自138-10的抗體。138-10的重鏈和輕鏈可變序列分別在SEQIDNO：3和SEQIDNO：4中闡述。本發(fā)明提供了包含抗體138-10的片段或區(qū)域的抗體或多肽。在一個實施方案中，片段是抗體138-10的輕鏈。在另一個實施方案中，片段是抗體138-10的重鏈。在另外一個實施方案中，片段包含來自抗體138-10的輕鏈和/或重鏈的一個或多個可變區(qū)。在另外一個實施方案中，片段包含來自抗體138-10的輕鏈和/或重鏈的1、2或3個CDRs。在某些實施方案中，抗體是138-10的人源化抗體。在某些實施方案中，衍生自抗體138-10的一個或多個CDRs與138-10的至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、或至少6個CDRs具有至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、或至少約99％的同一性。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體是抗體51-41或衍生自51-41的抗體。51-41的重鏈和輕鏈可變序列分別在SEQIDNO：5和SEQIDNO：6中闡述。本發(fā)明提供了包含抗體51-41的片段或區(qū)域的抗體或多肽。在一個實施方案中，片段是抗體51-41的輕鏈。在另一個實施方案中，片段是抗體51-41的重鏈。在另外一個實施方案中，片段包含來自抗體51-41的輕鏈和/或重鏈的一個或多個可變區(qū)。在另外一個實施方案中，片段包含來自抗體51-41的輕鏈和/或重鏈的1、2或3個CDRs。在某些實施方案中，抗體是51-41的人源化抗體。在某些實施方案中，衍生自抗體51-41的一個或多個CDRs具有與51-41的至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、或至少6個CDRs具有至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、或至少約99％的同一性。在某些實施方案中，CDR是KabatCDR。在其他實施方案中，CDR是ChothiaCDR。在其他實施方案中，CDR是Kabat和ChothiaCDR的組合（也稱為“組合的CDR”或“擴展的CDR”）。換言之，對于包含超過一個CDR的任何給定實施方案，CDRs可以是Kabat、Chothia和/或組合的CDR中的任何一種。制備抗體和衍生自抗體的多肽的方法是本領(lǐng)域已知的且在本文中公開。本發(fā)明的單克隆抗體可以使用已充分建立的方法進行制備。例如，單克隆抗體可以使用雜交瘤技術(shù)進行制備，例如由Kohler和Milstein（1975），Nature，256：495描述的那些。在雜交瘤方法中，小鼠、倉鼠、或其他合適的宿主動物一般用免疫劑（例如，表達CD43或CEA的癌細胞，可以使用本文描述的抗體純化的CD43或CEA（包括由癌細胞表達的胞外域及其片段），或在N端包含氨基酸序列N'-Trp-Pro-IIe-C'的多肽）免疫，以引起產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生與免疫劑特異性結(jié)合的抗體的淋巴細胞。可替代地，淋巴細胞可以在體外進行免疫。淋巴細胞隨后使用合適的融合試劑例如聚乙二醇與永生化細胞系融合，以形成雜交瘤細胞（Goding，MonoclonalAntibodies：PrinciplesandPractice，AcademicPress,（1986）第59-1031頁）。永生化細胞系通常是轉(zhuǎn)化的哺乳動物細胞，特別是嚙齒類動物、兔、牛和人起源的骨髓瘤細胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞系。雜交瘤細胞可以在合適的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選包含抑制未融合的永生化細胞的生長或存活的一種或多種物質(zhì)。例如，如果親本細胞缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（HGPRT或HPRT），那么用于雜交瘤的培養(yǎng)基一般將包括次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷（“HAT培養(yǎng)基”），所述物質(zhì)阻止HGPRT缺陷型細胞的生長。優(yōu)選的永生化細胞系是可以有效融合、能支持所選擇的抗體生產(chǎn)細胞穩(wěn)定地高水平表達抗體，且對培養(yǎng)基例如HAT培養(yǎng)基敏感的那些細胞系。更優(yōu)選的永生化細胞系是鼠類骨髓瘤細胞系，其可以例如得自SalkInstituteCellDistributionCenter，SanDiego，Calif，和美國典型培養(yǎng)物保藏中心Manassas，Va。人骨髓瘤和小鼠-人種間骨髓瘤（heteromyeloma）細胞系也已描述用于生產(chǎn)人單克隆抗體（Kozbor，J.Immunol.（1984），133：3001；Brodeur等人，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications，MarcelDekker，Inc.，NewYork,（1987）第51-63頁）。用于培養(yǎng)雜交瘤細胞的培養(yǎng)基隨后可以就單克隆抗體的存在進行測定。抗體可以就與非造血系統(tǒng)癌癥或腫瘤細胞表達的CD-43或CEA上的表位具有特異性結(jié)合、但與表達CD43的白細胞、Jurkat細胞、和/或其他造血系統(tǒng)起源的CD43表達細胞無特異性結(jié)合而進行篩選。包含表位的癌細胞或胞外域（包括其片段）可以用于篩選。例如，實施例10中描述的由COLO205細胞表達的CEA-N-A2可以用于篩選。Jurkat細胞系是類淋巴母細胞性白血病細胞，由Schneider等人從14歲男孩的外周血建立。Schneider等人，Int.J.Cancer19：621-626，1977。各種Jurkat細胞系可以例如從美國典型培養(yǎng)物保藏中心商購獲得（例如，ATCCTIB-152、ATCCTIB-153、ATCCCRL-2678）。優(yōu)選地，由雜交瘤細胞生產(chǎn)的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測定法，例如放射性免疫測定法（RIA）或酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）進行測定。此類技術(shù)和測定法是本領(lǐng)域已知的。單克隆抗體的結(jié)合親和力可以例如通過Munson和Pollard（1980），Anal.Biochem.，107：220的Scatchard分析進行測定。鑒定的抗體可以使用本領(lǐng)域已知的和本文描述的方法就其誘導(dǎo)細胞死亡（例如，凋亡）、和/或抑制細胞生長或增殖的能力進行進一步測試。鑒定到期望的雜交瘤細胞后，克隆可以通過有限稀釋法進行亞克隆，且通過標準方法（Goding，同上）進行培養(yǎng)。用于這個目的的合適的培養(yǎng)基包括例如，Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基或RPMI-1640培養(yǎng)基?？商娲?，雜交瘤細胞可以在哺乳動物中在體內(nèi)作為腹水生長。單克隆抗體可以通過培養(yǎng)雜交瘤細胞來產(chǎn)生，并且由雜交瘤細胞分泌的抗體可以進行進一步分離或純化。抗體可以通過常規(guī)免疫球蛋白純化操作由培養(yǎng)基或腹水中分離或純化，所述純化操作例如蛋白A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析或親和層析法。本發(fā)明的抗體還可以通過重組DNA方法進行制備，例如在此引入作為參考的美國專利號4,816,567和6,331,415中描述的那些，例如編碼本發(fā)明的單克隆抗體的DNA可以使用常規(guī)操作容易地分離和測序（例如，通過使用能夠與編碼鼠類抗體的重和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針）。本發(fā)明的雜交瘤細胞充當此類DNA的優(yōu)選來源。分離后，DNA可以置入表達載體內(nèi)，所述表達載體隨后轉(zhuǎn)染到原本不生產(chǎn)免疫球蛋白的宿主細胞內(nèi)，例如猴COS細胞、中國倉鼠卵巢細胞（CHO）細胞或骨髓瘤細胞，以在重組宿主細胞中獲得單克隆抗體的合成。DNA還可以例如通過用人重和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列代替同源鼠類序列（美國專利號4,816,567），或通過將非免疫球蛋白多肽的所有或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價連接，而進行修飾。此類非免疫球蛋白多肽可以替換本發(fā)明的抗體的恒定結(jié)構(gòu)域，或可以替換本發(fā)明抗體的一個抗原結(jié)合部位的可變結(jié)構(gòu)域，以產(chǎn)生嵌合雙價抗體。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體由2種表達載體表達。第一種表達載體編碼抗體（例如，人源化抗體）的重鏈，包含編碼抗體重鏈可變區(qū)的第一部分，和編碼抗體重鏈恒定區(qū)的第二部分。在某些實施方案中，第一部分編碼具有SEQIDNO：7所示氨基酸序列的可變區(qū)。第二種表達載體編碼抗體的輕鏈，包含編碼抗體輕鏈可變區(qū)的第一部分，和編碼抗體輕鏈恒定區(qū)的第二部分。在某些實施方案中，第一部分編碼具有SEQIDNO：8所示氨基酸序列的可變區(qū)?？商娲?，本發(fā)明的抗體（例如，人源化抗體）由單種表達載體表達。該單種表達載體編碼本發(fā)明抗體的重鏈和輕鏈。在某些實施方案中，該表達載體包含多核苷酸序列，其編碼具有SEQIDNO：7氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，和具有SEQIDNO：8氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。通常表達載體具有源自與宿主細胞相容的物種的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列。此外，載體通常攜帶能夠在轉(zhuǎn)化細胞中提供表型選擇的特定基因。大量的用于真核細胞的重組宿主載體表達系統(tǒng)是已知的且可以在本發(fā)明中使用。例如，釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）或通常的面包酵母是真核微生物中最常用的，但許多其他菌株例如巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）也是可用的。衍生自多細胞生物例如可從ATCC獲得的Sp2/0或中國倉鼠卵巢細胞（CHO）的細胞系也可以用作宿主。適合于真核細胞轉(zhuǎn)化的一般載體質(zhì)粒是例如pSV2neo和pSV2gpt（ATCC），pSVL和pSVK3（Pharmacia），和pBPV-1/pML2d（InternationalBiotechnology，Inc.）。在本發(fā)明中有用的真核宿主細胞優(yōu)選是雜交瘤、骨髓瘤、漿細胞瘤或淋巴瘤細胞。然而，可以適宜地使用其他真核宿主細胞，條件是哺乳動物宿主細胞能夠識別用于表達蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄和翻譯DNA序列；通過前導(dǎo)序列的切割來加工前導(dǎo)肽和分泌蛋白質(zhì)；且提供蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，例如糖基化。因此，本發(fā)明提供了真核宿主細胞，其被包含本文公開的DNA構(gòu)建體的重組表達載體轉(zhuǎn)化，并且能夠表達本發(fā)明的抗體或多肽。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的宿主細胞包含至少一種DNA構(gòu)建體，其包含本文描述的輕和重鏈DNA序列、以及相對于輕和重鏈編碼DNA序列放置以指導(dǎo)抗體或多肽表達的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列。本發(fā)明中使用的宿主細胞可以通過本領(lǐng)域眾所周知的標準轉(zhuǎn)染方法以各種方式進行轉(zhuǎn)化。在可以使用的標準轉(zhuǎn)染方法中有電穿孔技術(shù)、原生質(zhì)體融合和磷酸鈣沉淀技術(shù)。此類技術(shù)由F.Toneguzzo等人（1986），Mol.CellBiol，6：703-706；G.Chu等人，NucleicAcidRes.（1987），15：1311-1325；D.Rice等人，Proc.Natl.Acad.SclUSA（1979），79：7862-7865；和V.Oi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1983），80：825-829作了一般描述。在2種表達載體的情況下，2種表達載體可以一個一個分開地或一起（共轉(zhuǎn)移或共轉(zhuǎn)染）轉(zhuǎn)移到宿主細胞內(nèi)。本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)抗體或多肽的方法，其包括培養(yǎng)包含編碼抗體或多肽的表達載體的宿主細胞，和通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法從培養(yǎng)物中回收抗體或多肽。此外，所需抗體可以在轉(zhuǎn)基因動物中進行生產(chǎn)。合適的轉(zhuǎn)基因動物可以根據(jù)標準方法來獲得，所述方法包括將合適的表達載體顯微注射到卵內(nèi)，將卵轉(zhuǎn)移到假孕的雌性體內(nèi)且選擇表達所需抗體的后代。本發(fā)明還提供了特異性識別癌細胞表達的CD43和CEA上的表位的嵌合抗體。例如，嵌合抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)來自不同的物種。在某些實施方案中，重鏈和輕鏈的可變區(qū)來自本文描述的鼠類抗體。在某些實施方案中，可變區(qū)包含SEQIDNO：1和SEQIDNO：2中所示的氨基酸序列。在某些實施方案中，可變區(qū)包含SEQIDNO：3和SEQIDNO：4中所示的氨基酸序列。在某些實施方案中，可變區(qū)包含SEQIDNO：5和SEQIDNO：6中所示的氨基酸序列。在某些實施方案中，重鏈和輕鏈的恒定區(qū)來自人抗體。本發(fā)明的嵌合抗體可以通過本領(lǐng)域充分建立的技術(shù)進行制備。參見例如美國專利號6,808,901、美國專利號6,652,852、美國專利號6,329,508、美國專利號6,120,767和美國專利號5,677,427，所述專利各自在此引入作為參考。一般而言，嵌合抗體可以通過下述進行制備：獲得編碼抗體的重和輕鏈可變區(qū)的cDNAs，將cDNAs插入表達載體內(nèi)，隨后將所述表達載體引入真核宿主細胞內(nèi)，表達本發(fā)明的嵌合抗體。優(yōu)選地，表達載體攜帶功能上完全的恒定重或輕鏈序列，從而使得可以容易地將任何可變重或輕鏈序列插入表達載體內(nèi)。本發(fā)明提供了特異性識別由非造血系統(tǒng)癌細胞表達的CD43和CEA上的表位的人源化抗體。人源化抗體一般是人抗體，其中來自CDRs的殘基由來自具有所需特異性、親和力和能力的非人物種例如小鼠、大鼠或兔的CDR的殘基替代。在某些情況下，人抗體的Fv構(gòu)架殘基由相應(yīng)的非人殘基替代。使單克隆抗體人源化有4個一般步驟。它們是：（1）測定起始抗體輕和重可變結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列和預(yù)測的氨基酸序列，（2）設(shè)計人源化抗體，即決定何種抗體構(gòu)架區(qū)在人源化過程中使用，（3）實際的人源化方法/技術(shù)，和（4）人源化抗體的轉(zhuǎn)染和表達。參見例如，美國專利號4,816,567；5,807,715；5,866,692；6,331,415；5,530,101；5,693,761；5,693,762；5,585,089；6,180,370；和6,548,640。例如，如果抗體在人的臨床試驗和治療中使用，那么恒定區(qū)可以改造成更類似于人恒定區(qū)，以避免免疫應(yīng)答。參見例如，美國專利號5,997,867和5,866,692。重要的是抗體在進行人源化時保留對于抗原的高親和力和其他有利的生物性質(zhì)。為了達到這個目的，人源化抗體可以通過使用親本序列和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念上的人源化產(chǎn)物而制備。三維免疫球蛋白模型是通常可得的且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的?？梢垣@得計算機程序用于描述和展示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)。對這些展示的檢查使得可以分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基。以這種方式，可以從共有序列和輸入序列選擇FR殘基并組合，以便獲得所需的抗體特征，例如對于靶抗原增加的親和力。一般而言，CDR殘基直接且大多數(shù)基本上參與影響抗原結(jié)合。人源化抗體還可以包含在鉸鏈區(qū)中的修飾以改善抗體的一種或多種特征。在另一種可替代方案中，可以通過噬菌體展示技術(shù)篩選和重組制備抗體。參見例如，美國專利號5,565,332；5,580,717；5,733,743和6,265,150；和Winter等人，Annu.Rev.Immunol12：433-455（1994）。可替代地，噬菌體展示技術(shù)（McCafferty等人，Nature348：552-553（1990））可以用于由來自未免疫的供體的免疫球蛋白可變（V）結(jié)構(gòu)域基因庫在體外生產(chǎn)人抗體和抗體片段。根據(jù)這種技術(shù)，將抗體V結(jié)構(gòu)域基因以符合讀框的方式克隆到絲狀噬菌體例如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因內(nèi)，且作為功能抗體片段展示在噬菌體顆粒的表面上。因為絲狀顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，所以基于抗體的功能性質(zhì)的選擇也導(dǎo)致編碼顯示那些性質(zhì)的抗體的基因的選擇。因此，噬菌體模擬了B細胞的某些性質(zhì)。噬菌體展示可以以各種方式來進行；關(guān)于綜述參見例如，Johnson，KevinS.和Chiswell，DavidJ.，CurrentOpinioninStructuralBiology3，564-571（1993）。幾種來源的V基因片段可以用于噬菌體展示。Clackson等人，Nature352：624-628（1991）從衍生自免疫小鼠脾的V基因的小型隨機組合文庫中分離了一系列多樣的抗噁唑酮抗體。可以構(gòu)建來自未免疫人供體的V基因庫，且可以基本上根據(jù)Mark等人，J.Mol.Biol.222：581-597（199.1）或Griffith等人，EMBOJ.12：725-734（1993）描述的技術(shù)分離針對一系列多樣抗原（包括自身抗原）的抗體。在天然免疫應(yīng)答中，抗體基因以高速率積聚突變（體細胞高變）。引入的某些改變將賦予更高的親和力，且顯示高親和力表面免疫球蛋白的B細胞在隨后的抗原攻擊過程中將優(yōu)先復(fù)制和分化。這種天然過程可以通過使用稱為“鏈改組”的技術(shù)進行模擬。Marks,等人，Bio/Technol.10：779-783（1992））。以這種方法，通過噬菌體展示獲得的“初級”人抗體的親和力可以通過下述得到改善：用得自未免疫個體的V結(jié)構(gòu)域基因的天然變體（庫）順次替代重和輕鏈V區(qū)基因。這種技術(shù)允許產(chǎn)生具有pM-nM范圍中的親和力的抗體和抗體片段。用于制備極大型噬菌體抗體庫（也稱為“所有文庫之母”）的策略已由Waterhouse等人，Nucl.AcidsRes.21：2265-2266（1993）描述?；蚋慕M也可以用于由嚙齒類動物抗體獲得人抗體，其中人抗體具有與起始嚙齒類動物抗體相似的親和力和特異性。根據(jù)也稱為“表位印跡”的方法，通過噬菌體展示技術(shù)獲得的嚙齒類動物抗體的重或輕鏈V結(jié)構(gòu)域基因由人V結(jié)構(gòu)域基因的庫替代，產(chǎn)生嚙齒類動物-人嵌合體。對抗原的選擇導(dǎo)致能夠恢復(fù)功能抗原結(jié)合位點的人可變區(qū)的分離，即表位控制（印跡）配偶體的選擇。當重復(fù)該過程以替代其余的嚙齒類動物V結(jié)構(gòu)域時，獲得人抗體（參見1993年4月1日公開的PCT公開號WO93/06213）。與通過CDR嫁接的嚙齒類動物抗體的常規(guī)人源化不同，這種技術(shù)提供了全人抗體，其不具有嚙齒類動物起源的構(gòu)架或CDR殘基。顯然盡管上述討論涉及人源化抗體，但所討論的一般原則可應(yīng)用于定制用于例如在犬、貓、靈長類動物、馬和牛動物中使用的抗體。在某些實施方案中，抗體是全人抗體。特異性結(jié)合抗原的非人抗體可以用于生產(chǎn)與該抗原結(jié)合的全人抗體。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用鏈交換技術(shù)，其中非人抗體的重鏈與表達不同人輕鏈的表達文庫共表達。包含1條人輕鏈和1條非人重鏈的所得到的雜合抗體隨后就抗原結(jié)合進行篩選。參與抗原結(jié)合的輕鏈隨后與人抗體重鏈文庫共表達。所得到的人抗體再一次就抗原結(jié)合進行篩選。諸如此類的技術(shù)在美國專利5,565,332中進一步描述。此外，抗原可以用于接種人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動物。參見例如，美國專利5,661,016?？贵w可以是雙特異性抗體，即對于至少2種不同抗原具有結(jié)合特異性的單克隆抗體，其可以使用本文公開的抗體進行制備。用于制備雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的（參見例如Suresh等人，1986，MethodsinEnzymology121：210）。通常，雙特異性抗體的重組生產(chǎn)基于2個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達，其中2條重鏈具有不同的特異性（Millstein和Cuello，1983，Nature305，537-539）。根據(jù)制備雙特異性抗體的一種方法，使具有所需結(jié)合特異性（抗體-抗原結(jié)合部位）的抗體可變結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列融合。融合物優(yōu)選具有免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，包含至少部分的鉸鏈、CH2和CH3區(qū)域。優(yōu)選具有包含輕鏈結(jié)合所需位點的第一重鏈恒定區(qū)（CH1），存在于融合物的至少一個中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和如期望的話免疫球蛋白輕鏈的DNAs插入分開的表達載體內(nèi)，且共轉(zhuǎn)染到合適的宿主生物中。當構(gòu)建體中使用的3條多肽鏈的不等比率提供最優(yōu)產(chǎn)量時，這提供了調(diào)整3個多肽片段的相互比例的極大靈活性。然而當至少2條多肽鏈以相同比率表達導(dǎo)致高產(chǎn)量時或當比例沒有特別意義時，可以將2條或所有3條多肽鏈的編碼序列插入一個表達載體中。在一種方法中，雙特異性抗體由在一條臂中具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和在另一條臂中的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對（提供第二結(jié)合特異性）組成。在雙特異性分子的僅一半中具有免疫球蛋白輕鏈的這種不對稱結(jié)構(gòu)，將有利于所需雙特異性化合物與不需要的免疫球蛋白鏈組合的分離。這種方法在1994年3月3日公開的PCT公開號WO94/04690中得到描述。包含2個共價連接的抗體的雜綴合抗體（heteroconjugateantibody）也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此類抗體已用于使免疫系統(tǒng)細胞靶向不需要的細胞（美國專利號4,676,980）和用于治療HIV感染（PCT公開號WO91/00360和WO92/200373；和EP03089）。雜綴合抗體可以使用任何方便的交聯(lián)法進行制備。合適的交聯(lián)試劑和技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，且在美國專利號4,676,980中得到描述。單鏈Fv片段還可以例如如Iliades等人，1997，F(xiàn)EBSLetters，409：437-441中描述的進行生產(chǎn)。此類單鏈片段使用各種接頭的偶聯(lián)在Kortt等人，1997，ProteinEngineering，10：423-433中得到描述。用于抗體的重組生產(chǎn)和處理的各種技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。本發(fā)明旨在不僅包括上文描述的單克隆抗體，還包括其含有抗體的活性結(jié)合區(qū)域的任何片段，例如Fab、F（ab'）2、scFv、Fv片段等。此類片段可以使用本領(lǐng)域充分建立的技術(shù)由本文描述的單克隆抗體進行生產(chǎn)（Rousseaux等人（1986），inMethodsEnzymol，121：663-69AcademicPress）。制備抗體片段的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，抗體片段可以通過用胃蛋白酶酶促切割抗體來生產(chǎn)，以提供命名為F（ab'）2的100Kd片段。這個片段可以使用硫醇還原劑和任選地保護基團（用于因二硫鍵斷裂形成的巰基），進行進一步斷裂，以產(chǎn)生50KdFab'單價片段?？商娲?，使用木瓜蛋白酶的酶促切割直接產(chǎn)生2個單價Fab片段和Fc片段。這些方法例如由美國專利號4,036,945和4,331,647以及其中包含的參考文獻進行描述，所述專利引入本文作為參考。同樣，參見Nisonoff等人（1960），ArchBiochem.Biophys.89：230；Porter（1959），Biochem.J.73：119，Edelman等人，inMETHODSINENZYMOLOGYVOL.1，第422頁（AcademicPress1967）。可替代地，F(xiàn)ab可以通過下述產(chǎn)生：將編碼抗體Fab的DNA插入用于原核生物的表達載體或用于真核生物的表達載體內(nèi)，并且將載體引入原核生物或真核生物內(nèi)以表達Fab。本發(fā)明包含對本文描述的抗體或多肽的修飾，包括不會顯著影響其性質(zhì)的功能上等價的抗體，和具有增強的或減少的活性和/或親和力的變體。例如，抗體5F1或人源化抗體的氨基酸序列可以進行突變，以獲得對于癌細胞表達的CD43或CEA具有所需結(jié)合親和力的抗體。多肽的修飾是本領(lǐng)域的常規(guī)實踐，無需在本文中詳細描述。經(jīng)修飾的多肽的例子包括如下多肽，所述多肽具有氨基酸殘基的保守置換，不會顯著不利地改變功能活性的一個或多個氨基酸的刪除或添加、或化學類似物的使用。氨基酸序列插入包括長度從1個殘基到包含100個或更多殘基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰殘基的抗體或與表位標簽融合的抗體?？贵w分子的其他插入變體包括抗體的N或C末端與酶或增加抗體的血清半衰期的多肽的融合。置換變體在抗體分子中去除了至少一個氨基酸殘基并在其位置上插入了不同殘基。對于置換誘變具有最大意義的位點包括高變區(qū)，但FR改變也可以考慮。保守置換在下表中的“保守置換”標題下顯示。如果此類置換導(dǎo)致生物活性的改變，那么可以引入在下表中命名為“示例性置換”，或如下文就氨基酸類別而言進一步描述的更實質(zhì)的變化，且篩選產(chǎn)物。氨基酸置換抗體生物學性質(zhì)的實質(zhì)性修飾可以通過選擇在維持下述方面的作用上具有顯著不同的置換來完成：（a）置換區(qū)域中的多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如作為片層或螺旋構(gòu)象，（b）分子在靶位點上的電荷或疏水性，或（c）側(cè)鏈的體積。天然存在的殘基基于共同的側(cè)鏈性質(zhì)分成以下組：（1）非極性：正亮氨酸，Met，Ala，VaI，Leu，Ile；（2）不帶電荷的極性：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；（3）酸性（帶負電荷）：Asp，Glu；（4）堿性（帶正電荷）：Lys，Arg；（5）影響鏈取向的殘基：Gly，Pro；和（6）芳香族：Trp，Tyr，Phe，His。非保守置換通過將這些類別之一的成員換成另一個類別來實現(xiàn)。不涉及抗體的正確構(gòu)象維持的任何半胱氨酸殘基也可以一般用絲氨酸進行置換，以改善分子的抗氧化性且阻止異常交聯(lián)。相反，半胱氨酸鍵可以加入抗體中以改善其穩(wěn)定性，特別是當抗體是抗體片段例如Fv片段時。氨基酸修飾可以從變化或修飾一個或多個氨基酸到完全重新設(shè)計區(qū)域例如可變區(qū)?？勺儏^(qū)中的變化可以改變結(jié)合親和力和/或特異性。在某些實施方案中，在CDR結(jié)構(gòu)域內(nèi)進行不超過1-5個保守氨基酸置換。在其他實施方案中，在CDR結(jié)構(gòu)域內(nèi)進行不超過1-3個保守氨基酸置換。在另外其他的實施方案中，CDR結(jié)構(gòu)域是CDRH3和/或CDRL3。修飾還包括糖基化和非糖基化的多肽，以及具有其他翻譯后修飾的多肽，例如具有不同糖的糖基化、乙?；土姿峄??？贵w在其恒定區(qū)中在保守位置上進行糖基化（Jefferis和Lund，1997，Chem.Immunol.65：111-128；Wright和Morrison，1997，TibTECH15：26-32）。免疫球蛋白的寡糖側(cè)鏈影響蛋白質(zhì)的功能（Boyd等人，1996，Mol.Immunol.32：1311-1318；Wittwe和Howard，1990，Biochem.29：4175-4180）和糖蛋白的部分之間的分子內(nèi)相互作用，這可以影響糖蛋白的構(gòu)象和呈現(xiàn)的三維表面（Hefferis和Lund，同上；Wyss和Wagner，1996，CurrentOpin.Biotech.7：409-416）?；谔禺愖R別結(jié)構(gòu)，寡糖也可以用于使給定糖蛋白靶向某些分子?？贵w的糖基化已報道影響抗體依賴性細胞毒性（ADCC）。特別地，具有四環(huán)素調(diào)節(jié)的β（1,4）-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III（GnTIII）表達的CHO細胞被報道具有改善的ADCC活性（Umana等人，1999，MatureBiotech.17：176-180），所述GnTIII是催化平分型（bisecting）GlcNAc形成的糖基轉(zhuǎn)移酶。抗體的糖基化一般是N聯(lián)或O聯(lián)的。N聯(lián)指糖部分與天冬酰胺殘基的側(cè)鏈附著。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸、天冬酰胺-X-蘇氨酸、和天冬酰胺-X-半胱氨酸是糖部分與天冬酰胺側(cè)鏈進行酶促附著的識別序列，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸。因此，這些三肽序列之任一在多肽中的存在都將造成潛在糖基化位點。O聯(lián)糖基化指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一與羥基氨基酸的附著，最常見地絲氨酸或蘇氨酸，盡管5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸也可以使用。給抗體添加糖基化位點可以通過改變氨基酸序列，使得它包含上述三肽序列中的一個或多個（對于N聯(lián)糖基化位點）而方便地完成。改變還可以通過給原始抗體的序列添加或置換一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來完成（對于O聯(lián)糖基化位點）。也可以改變抗體的糖基化模式而不改變基礎(chǔ)核苷酸序列。糖基化在很大程度上依賴用于表達抗體的宿主細胞。因為用于表達重組糖蛋白例如抗體作為潛在治療劑的細胞類型很少是天然細胞，所以可以預(yù)期抗體的糖基化模式的變化（參見例如Hse等人，1997，J.Biol.Chem.272：9062-9070）。除了宿主細胞的選擇外，在抗體的重組生產(chǎn)過程中影響糖基化的因素還包括生長方式、培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)密度、氧合、pH、純化方案等。已提出改變特定宿主生物中的糖基化模式的各種方法，包括引入或過表達參與寡糖生產(chǎn)的某些酶（美國專利號5,047,335；5,510,261和5.278,299）。糖基化或某些類型的糖基化可以例如使用內(nèi)切糖苷酶H（EndoH）、N糖苷酶F、內(nèi)切糖苷酶F1、內(nèi)切糖苷酶F2、內(nèi)切糖苷酶F3從糖蛋白中酶促去除。此外，重組宿主細胞可以進行遺傳改造以在加工某些類型的多糖方面產(chǎn)生缺陷。這些和類似技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。其他修飾方法包括使用本領(lǐng)域已知的偶聯(lián)技術(shù)，包括但不限于酶促手段、氧化置換（oxidativesubstitution）和螯合。修飾可以例如用于標記物的附著以用于免疫測定法。經(jīng)修飾的多肽可以使用本領(lǐng)域建立的方法來制備，并且可以使用本領(lǐng)域已知的標準測定法進行篩選，其中某些在下文和實施例中描述。本發(fā)明的抗體或多肽可以與試劑例如治療劑和標記物綴合（例如，連接）。治療劑的例子是放射性結(jié)構(gòu)部分、細胞毒素、或化學治療分子。本發(fā)明的抗體（或多肽）可以與標記物連接，所述標記物例如熒光分子、放射性分子、酶、或本領(lǐng)域已知的任何其他標記物。如本文所使用的，術(shù)語“標記物”指可以檢測的任何分子。在某一實施方案中，抗體可以通過摻入放射性標記的氨基酸進行標記。在某一實施方案中，可以通過標記的抗生物素蛋白（例如，包含可以通過光學或比色法進行檢測的熒光標記或酶促活性的鏈霉抗生物素蛋白）進行檢測的生物素部分可以與抗體附著。在某些實施方案中，標記物可以摻入另一種試劑內(nèi)或與另一種試劑附著，所述另一種試劑又可以與目的抗體結(jié)合。例如，標記物可以摻入抗體內(nèi)或與抗體附著，所述抗體又可以特異性結(jié)合目的抗體。在某些實施方案中，標簽或標記物也可以是治療性的。標記多肽和糖蛋白的各種方法是本領(lǐng)域已知的且可以使用。某些一般種類的標記物包括但不限于，酶、熒光、化學發(fā)光和放射性標記物。用于多肽的標記物的例子包括但不限于：放射性同位素或放射性核苷酸（例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I），熒光標記物（例如，異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明、鑭系元素磷光體、藻紅蛋白（PE）），酶標記物（例如，辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、醇脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、青霉素酶、螢光素酶），化學發(fā)光物，生物素基，由第二報道分子（例如，亮氨酸拉鏈對序列、二級抗體的識別位點、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表位標簽）識別的預(yù)定的多肽表位。在某些實施方案中，標記物與各種長度的間隔臂連接以減少潛在的空間位阻。本發(fā)明還提供了包含本文描述的抗體或多肽、和藥學上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。藥學上可接受的賦形劑是本領(lǐng)域已知的，并且是有利于藥理學有效物質(zhì)的施用的相對惰性物質(zhì)。例如，賦形劑可以造成形狀或稠度，或充當稀釋劑。合適的賦形劑包括但不限于穩(wěn)定劑、濕潤劑和乳化劑、用于改變摩爾滲透壓濃度的鹽、囊化劑、緩沖劑和皮膚穿透促進劑。用于腸胃外和非腸胃外藥物遞送的賦形劑以及制劑在Remington，TheScienceandPracticeofPharmacy第20版，MackPublishing（2000）中闡述。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了用于在本文描述的任何方法中使用的組合物（本文描述的），無論是在作為藥物使用的情況中和/或用于制備藥物的用途中。多核苷酸、載體和宿主細胞本發(fā)明還提供了包含編碼本文描述的任何單克隆抗體和多肽的核苷酸序列的多核苷酸。在某些實施方案中，多肽包含輕鏈和重鏈可變區(qū)的序列。在某些實施方案中，多核苷酸包含編碼SEQIDNO：1中所示的重鏈可變區(qū)的核酸序列，和/或編碼SEQIDNO：2中所示的輕鏈可變區(qū)的核酸序列。在某些實施方案中，多核苷酸包含編碼重鏈可變區(qū)的核酸序列和/或編碼輕鏈可變區(qū)的核酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含來自SEQIDNO：1的1、2或3個CDRs，所述輕鏈可變區(qū)包含來自SEQIDNO：2的1、2或3個CDRs。在某些實施方案中，多核苷酸包含SEQIDNO：9中所示的核酸序列，和/或SEQIDNO：10中所示的核酸序列。在某些實施方案中，多核苷酸包含編碼SEQIDNO：3中所示的重鏈可變區(qū)的核酸序列，和/或編碼SEQIDNO：4中所示的輕鏈可變區(qū)的核酸序列。在某些實施方案中，多核苷酸包含編碼重鏈可變區(qū)的核酸序列和/或編碼輕鏈可變區(qū)的核酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含來自SEQIDNO：3的1、2或3個CDRs，所述輕鏈可變區(qū)包含來自SEQIDNO：4的1、2或3個CDRs。在某些實施方案中，多核苷酸包含SEQIDNO：11中所示的核酸序列，和/或SEQIDNO：12中所示的核酸序列。在某些實施方案中，多核苷酸包含編碼SEQIDNO：5中所示的重鏈可變區(qū)的核酸序列，和/或編碼SEQIDNO：6中所示的輕鏈可變區(qū)的核酸序列。在某些實施方案中，多核苷酸包含編碼重鏈可變區(qū)的核酸序列和/或編碼輕鏈可變區(qū)的核酸序列，所述重鏈可變區(qū)包含來自SEQIDNO：5的1、2或3個CDRs，所述輕鏈可變區(qū)包含來自SEQIDNO：6的1、2或3個CDRs。在某些實施方案中，多核苷酸包含SEQIDNO：13中所示的核酸序列，和/或SEQIDNO：14中所示的核酸序列。在某些實施方案中，多核苷酸包含編碼SEQIDNO：7中所示的重鏈可變區(qū)的核酸序列，和/或編碼SEQIDNO：8中所示的輕鏈可變區(qū)的核酸序列。在某些實施方案中，多核苷酸包含SEQIDNO：15中所示的核酸序列，和/或SEQIDNO：16中所示的核酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，作為遺傳密碼簡并的結(jié)果，存在編碼如本文所描述的多肽的許多核苷酸序列。這些多核苷酸中的一些與任何天然基因的核苷酸序列都具有極小的同源性。因此，由于密碼子使用的差異而不同的多核苷酸是本發(fā)明特別考慮的。此外，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。等位基因是作為一個或多個核苷酸的突變例如缺失、添加和/或置換的結(jié)果而改變的內(nèi)源基因。所得到的mRNA和蛋白質(zhì)可以但無需具有改變的結(jié)構(gòu)或功能。等位基因可以使用標準技術(shù)（例如雜交、擴增和/或數(shù)據(jù)庫序列比較）進行鑒定。本發(fā)明的多核苷酸可以使用化學合成、重組方法或PCR來獲得。化學多核苷酸合成的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且無需在本文中詳細描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用本文提供的序列和商業(yè)DNA合成儀生產(chǎn)所需DNA序列。如本文進一步討論的，對于使用重組方法制備多核苷酸，可以將包含所需序列的多核苷酸插入合適的載體內(nèi)，而載體可以引入合適的宿主細胞內(nèi)進行復(fù)制和擴增。多核苷酸可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法插入宿主細胞內(nèi)。細胞通過直接攝取、胞吞作用、轉(zhuǎn)染、F交配或電穿孔引入外源多核苷酸而轉(zhuǎn)化。引入后，外源多核苷酸可以以非整合載體（例如質(zhì)粒）形式維持在細胞內(nèi)或整合到宿主細胞基因組內(nèi)。如此擴增的多核苷酸可以通過本領(lǐng)域眾所周知的方法從宿主細胞中分離。參見例如，Sambrook等人（1989）?？商娲?，PCR允許DNA序列的復(fù)制。PCR技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，并且在美國專利號4,683,195、4,800,159、4,754,065和4,683,202以及PCR：ThePolymeraseChainReaction,Mullis等人編輯,BirkauswerPress,Boston（1994）中得到描述。本發(fā)明還提供了包含編碼本文描述的任何多肽（包括抗體）的核酸序列的載體（例如，克隆載體、表達載體）。合適的克隆載體可以根據(jù)標準技術(shù)進行構(gòu)建，或可以選自本領(lǐng)域可得的大量克隆載體。盡管所選擇的克隆載體可以依預(yù)期使用的宿主細胞而變，但有用的克隆載體一般具有自我復(fù)制的能力，可以具有特定限制性內(nèi)切酶的單一靶位點，和/或可以攜帶能用于選擇包含載體的克隆的標志基因。合適的例子包括質(zhì)粒和細菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript（例如pBSSK+）及其衍生物、mpl8、mpl9、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNAs，以及穿梭載體pSA3和pAT28。這些和許多其他克隆載體可從商業(yè)廠商例如BioRad、Strategene和Invitrogen獲得。表達載體一般是包含本發(fā)明多核苷酸的可復(fù)制的多核苷酸構(gòu)建體。表達載體可以在宿主細胞中作為附加體或作為染色體DNA的一個組成部分進行復(fù)制。合適的表達載體包括但不限于質(zhì)粒，病毒載體，包括腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒，粘粒和PCT公開號WO87/04462中公開的表達載體。載體組分一般可以包括但不限于，下述中的一種或多種：信號序列；復(fù)制起點；一種或多種標志基因；合適的轉(zhuǎn)錄控制元件（例如啟動子、增強子和終止子）。對于表達（即翻譯），通常還需要一種或多種翻譯控制元件，例如核糖體結(jié)合位點、翻譯起始位點和終止密碼子。包含目的多核苷酸的載體可以通過許多合適的方法中的任何一種引入宿主細胞內(nèi)，包括電穿孔，使用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質(zhì)的轉(zhuǎn)染；微粒轟擊；脂轉(zhuǎn)染；和感染（例如，當載體是感染劑例如痘苗病毒時）。引入載體或多核苷酸的選擇通常依賴宿主細胞的特征。本發(fā)明還提供了包含本文描述的任何多核苷酸或載體的宿主細胞。能夠過表達異源DNAs的任何宿主細胞均可以用于分離編碼目的抗體、多肽或蛋白質(zhì)的基因的用途。哺乳動物宿主細胞的非限制性例子包括但不限于COS、HeLa和CHO細胞。還參見PCT公開號WO87/04462。合適的非哺乳動物宿主細胞包括原核生物（例如，大腸桿菌（E.coli）或枯草芽孢桿菌（B.subtillis））和酵母（例如釀酒酵母、粟酒裂殖酵母（S.pombe）；或乳酸克魯維酵母（K.lactis））。診斷用途本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的抗體、多肽和多核苷酸用于檢測、診斷和監(jiān)控與表位表達（相對于正常樣品增加或減少，和/或不合適的表達，例如在通常缺乏表位表達的組織和/或細胞中表達的存在）相關(guān)的疾病、病癥或病狀的方法。在某些實施方案中，該方法包括在得自疑似患有癌癥的受試者的樣品中檢測表位表達，所述癌癥例如結(jié)腸直腸、胰腺、胃和肺的癌。優(yōu)選地，檢測方法包括使樣品與本發(fā)明的抗體、多肽或多核苷酸接觸，和測定與對照或比較樣品相比結(jié)合水平是否不同。該方法還可用于確定本文描述的抗體或多肽是否是患者的合適治療劑。如本文所使用的，術(shù)語“樣品”或“生物樣品”指完整生物或其組織、細胞或組分（例如，體液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、腦脊髓液、唾液、羊膜液、羊膜臍帶血、尿液、陰道液和精液）的子集?！皹悠贰被颉吧飿悠贰边€指由完整生物或其組織、細胞或組分的子集、或其級分或部分（包括但不限于例如，血漿，血清，脊髓液，淋巴液，皮膚外部、呼吸道、腸道和泌尿生殖道，淚，唾液，乳，血細胞，腫瘤，器官）制備的勻漿物、裂解物或提取物。最通常地，樣品已從動物中取出，但術(shù)語“樣品”或“生物樣品”還可以指在體內(nèi)分析的細胞或組織，即無需從動物中取出。一般地，“樣品”或“生物樣品”將包含來自動物的細胞，但該術(shù)語還可以指可以用于測量癌癥相關(guān)多核苷酸或多肽水平的非細胞生物材料，例如血液、唾液或尿液的非細胞級分?！皹悠贰被颉吧飿悠贰边M一步指培養(yǎng)基，例如生物已在其中進行繁殖的營養(yǎng)肉湯或凝膠，其包含細胞組分，例如蛋白質(zhì)或核酸分子。在一個實施方案中，使細胞或細胞/組織裂解物與抗體接觸，并且測定抗體和細胞之間的結(jié)合。當與相同組織類型的對照細胞比較，測試細胞顯示結(jié)合活性時，這可以指示測試細胞是癌性的。在某些實施方案中，測試細胞來自人組織。可以使用本領(lǐng)域已知用于檢測特異性抗體-抗原結(jié)合的各種方法?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明進行的示例性免疫測定法包括熒光偏振免疫測定法（FPIA）、熒光免疫測定法（FIA）、酶免疫測定法（EIA）、比濁抑制免疫測定法（NIA）、酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）和放射免疫測定法（RIA）。指示劑結(jié)構(gòu)部分或標記物基團可以與目的抗體附著，并且可以經(jīng)選擇以便符合方法的各種應(yīng)用的需要，這通常取決于試驗設(shè)備和相容的免疫測定法的可得性。合適的標記物包括但不限于放射性核酸（例如，125I、131I、35S、3H或32P），酶（例如，堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、螢光素酶或β-半乳糖苷酶），熒光部分或蛋白質(zhì)（例如，熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、GFP或BFP），或發(fā)光部分（例如，由QuantumDotCorporation,PaloAlto,CA供應(yīng)的QdotTM納米顆粒）。用于執(zhí)行上文所述的各種免疫測定法的一般技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。為了診斷目的，多肽（包括抗體）可以用可檢測部分進行標記，包括但不限于放射性同位素、熒光標記物、和本領(lǐng)域已知的各種酶-底物標記物。使標記物與抗體綴合的方法是本領(lǐng)域已知的。在某些實施方案中，多肽（包括本發(fā)明的抗體）無需是標記的，并且它的存在可以使用與本發(fā)明的抗體結(jié)合的標記抗體進行檢測。本發(fā)明的抗體可以在任何已知的測定方法中使用，例如競爭結(jié)合測定法、直接和間接夾心測定法、和免疫沉淀測定法。Zola,MonoclonalAntibodies：AManualofTechniques,第147-158頁（CRCPress,Inc.1987）?？贵w和多肽還可以用于體內(nèi)診斷測定法，例如體內(nèi)成像。一般地，抗體或多肽用放射性核素（例如111In、99Tc、14C、131I、125I或3H）進行標記，從而使得目的細胞或組織可以使用免疫閃爍成像法進行定位?？贵w還可以使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)在病理學中用作著色試劑。治療用途本發(fā)明抗體的一個顯著的和令人驚訝的特征涉及其有效誘導(dǎo)非造血系統(tǒng)癌細胞死亡的能力。因此，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗體和多肽在治療癌癥中的治療用途，所述癌癥例如結(jié)腸直腸癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、肝細胞癌和甲狀腺癌?？梢灾委熑魏伟┌Y，包括結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、乳腺癌、腦瘤、惡性黑素瘤、腎細胞癌、膀胱癌、淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、胃癌、胰腺癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、食管癌、肝癌、頭與頸鱗狀細胞癌、皮膚癌、泌尿道癌、前列腺癌、絨毛膜癌、咽癌、喉癌、泡膜細胞增生癥、男性細胞瘤、子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜異位癥、胚胎瘤、纖維肉瘤、卡波西肉瘤、血管瘤、海綿狀血管瘤、成血管細胞瘤、成視網(wǎng)膜細胞瘤、星形細胞瘤、神經(jīng)纖維瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、神經(jīng)節(jié)神經(jīng)母細胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、橫紋肌肉瘤、錯構(gòu)胚細胞瘤、骨原性肉瘤、平滑肌肉瘤、甲狀腺肉瘤和腎胚細胞瘤，條件是癌細胞表達由本文描述的抗體識別的表位。該方法可以進一步包括檢測本文描述的抗體或多肽和待治療的個體中的腫瘤或癌細胞之間的結(jié)合的步驟。一般地，將包含抗體或多肽的組合物的有效量施用于需要治療的受試者，從而抑制癌細胞的生長和/或誘導(dǎo)癌細胞的死亡。優(yōu)選地組合物用藥學上可接受的載體進行配制。在一個實施方案中，組合物配制用于通過腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下和肌內(nèi)注射，以及其他施用形式，例如口、粘膜、經(jīng)由吸入、舌下等施用。在另一個實施方案中，本發(fā)明還考慮包含與其他分子綴合的本發(fā)明抗體或多肽的組合物的施用，所述其他分子例如可檢測標記物、或治療性或細胞毒性劑。這些試劑可以包括但不限于放射性同位素、毒素、類毒素、炎性因子、酶、反義分子、肽、細胞因子或化學治療劑。使抗體與此類分子綴合的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員一般已知的。參見例如PCT公開WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美國專利號5,314,995；和EP396,387；所述專利的公開內(nèi)容整體引入本文作為參考。在一個實施方案中，組合物包含與細胞毒性劑綴合的抗體或多肽。細胞毒性劑可以包括對細胞有害的任何試劑?？梢耘c抗體或片段綴合的細胞毒性劑的優(yōu)選類別可以包括但不限于紫杉醇(paclitaxol)、細胞松弛素B(cytochalasinB)、短桿菌肽D(gramicidinD)、溴化乙啶、依米丁(emetine)、絲裂霉素、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、秋水仙堿(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、道諾紅霉素(daunorubicin)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracindione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝霉素(mithramycin)、放線菌素D(actinomycinD)、1-去氫睪甾酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)、和嘌呤霉素以及其類似物或同系物。治療所需的劑量依賴施用途徑的選擇，制劑性質(zhì)，受試者疾病的性質(zhì)，受試者的大小、重量、表面積、年齡和性別；施用的其他藥物，和主治醫(yī)師的判斷。合適的劑量在0.01—1000.0mg/kg的范圍內(nèi)。一般地，可以使用任何下述劑量：施用至少約50mg/kg體重；至少約10mg/kg體重；至少約3mg/kg體重；至少約1mg/kg體重；至少約750μg/kg體重；至少約500μg/kg體重；至少約250μg/kg體重；至少約100μg/kg體重；至少約50μg/kg體重；至少約10μg/kg體重；至少約1μg/kg體重或更少的劑量。對于經(jīng)過數(shù)天或更長時間的重復(fù)施用，依賴病狀，治療持續(xù)直至疾病癥狀出現(xiàn)期望的抑制。示例性給藥方案包括施用約6mg/kg抗體的每周劑量。然而，依賴于醫(yī)師所希望達到的藥代動力學衰減模式，其他給藥方案可能是有用的。經(jīng)驗性考慮例如半衰期一般將有助于劑量的確定。這種療法的進程通過常規(guī)技術(shù)和測定法可以容易地監(jiān)控。在某些受試者中，可能需要超過一次劑量。施用頻率可以在治療過程中進行確定和調(diào)整。例如，基于待治療的癌癥的類型和階段、藥劑施用是用于預(yù)防還是治療目的、先前療法，患者的臨床病史和對藥劑的應(yīng)答，以及主治醫(yī)師的判斷，可以確定或調(diào)整施用頻率。一般地臨床醫(yī)生將施用治療性抗體（例如，人源化5F1），直至達到合適劑量以實現(xiàn)期望結(jié)果。在某些情況下，抗體的持續(xù)緩釋制劑可能是合適的。用于達到持續(xù)釋放的各種制劑和裝置是本領(lǐng)域已知的。在一個實施方案中，抗體或多肽的劑量可以在已給予一次或多次施用的受試者中按經(jīng)驗確定?？梢越o予受試者遞增劑量的抗體或多肽。為了評估抗體或多肽的功效，可以監(jiān)控疾病癥狀的標志例如CD43或CEA。體內(nèi)功效還可以通過評估腫瘤負荷或體積、疾病進展時間（TDP）和/或測定應(yīng)答率（RR）進行測量。依照本發(fā)明方法的抗體或多肽的施用可以是連續(xù)的或間斷的，這依賴于例如受體的生理條件，施用的目的是預(yù)防還是治療性的，和有經(jīng)驗的醫(yī)師已知的其他因素?？贵w或多肽的施用可以在預(yù)選的時間段基本上連續(xù)或可以是一系列間隔劑量。其他制劑包括本領(lǐng)域已知的合適的遞送形式，包括但不限于載體例如脂質(zhì)體。參見例如，Mahato等人（1997）Pharm.Res.14：853-859。脂質(zhì)體制劑包括但不限于細胞轉(zhuǎn)染劑、多層脂質(zhì)體和單層脂質(zhì)體。在另一個實施方案中，組合物可以包含一種或多種抗癌劑，本文描述的一種或多種抗體，或連同與不同抗原結(jié)合的抗體或多肽。此類組合物可以包含至少1種、至少2種、至少3種、至少4種、至少5種不同抗體?？贵w和其他抗癌劑可以在相同制劑中（例如，在混合物中，如在本領(lǐng)域中通常指出的），或在分開制劑中但同時或順次施用，這在治療更廣泛范圍的個體群體時特別有用。編碼本發(fā)明的任何抗體或多肽（例如抗體5F1或人源化形式）的多核苷酸也可以用于在所需細胞中遞送和表達本發(fā)明的任何抗體或多肽。顯而易見的是表達載體可以用于指導(dǎo)抗體或多肽的表達。表達載體可以通過本領(lǐng)域已知的任何方式施用，例如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)口、腸內(nèi)、腸胃外、鼻內(nèi)、真皮、舌下或通過吸入。例如，表達載體的施用包括局部或全身施用，包括注射、口服、粒子槍或插管施用，和局部施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉表達載體的施用以獲得外源蛋白質(zhì)在體內(nèi)的表達。參見例如，美國專利號6,436,908；6,413,942；和6,376,471。還可以使用包含編碼本發(fā)明任何抗體或多肽的多核苷酸的治療組合物的靶向遞送。受體介導(dǎo)的DNA遞送技術(shù)在例如下述參考文獻中得到描述：Findeis等人，TrendsBiotechnol.（1993）11：202；Chiou等人，GeneTherapeutics：MethodsAndApplicationsOfDirectGeneTransfer（J.A.Wolff,編輯）（1994）；Wu等人，J.Biol.Chem.（1988）263：621；Wu等人，J.Biol.Chem.（1994）269：542；Zenke等人（1990）,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87：3655；Wu等人（1991）,J.Biol.Chem.266：338。在基因治療方案中包含多核苷酸的治療組合物可以以約100ng至約200mgDNA的范圍施用，用于局部施用。在基因治療方案期間還可以使用約500ng-約50mg、約1μg-約2mg、約5μg-約500μg、和約20μg-約100μgDNA的濃度范圍。本發(fā)明的治療性多核苷酸和多肽可以使用基因遞送載體進行遞送?；蜻f送載體可以是病毒或非病毒來源的（一般參見，Jolly（1994）,CancerGeneTherapy1：51；Kimura（1994）,HumanGeneTherapy5：845；Connelly（1985）,HumanGeneTherapy1：185；和Kaplitt（1994）,NatureGenetics6：148）。此類編碼序列的表達可以使用內(nèi)源哺乳動物或異源啟動子進行誘導(dǎo)。編碼序列的表達可以是組成性或受調(diào)節(jié)的。用于在所需細胞中遞送所需多核苷酸和表達的基于病毒的載體是本領(lǐng)域眾所周知的。示例性基于病毒的載體包括但不限于，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如，PCT公開號WO90/07936；WO94/03622；WO93/25698；WO93/25234；WO93/11230；WO93/10218；WO91/02805；美國專利號5,219,740；4,777,127；GB專利號2,200,651；和EP專利號0345242；基于甲病毒的載體，例如，辛德畢斯病毒載體，塞姆利基森林病毒（ATCCVR-67；ATCCVR-1247），羅斯河病毒（ATCCVR-373；ATCCVR-1246）和委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒（ATCCVR-923；ATCCVR-1250；ATCCVR1249；ATCCVR-532）），和腺伴隨病毒（AAV）載體，例如，PCT公開號WO94/12649,WO93/03769；WO93/19191；WO94/28938；WO95/11984和WO95/00655。還可以施用如Curiel（1992）,Hum.GeneTher.3：147中所述的與處死的腺病毒連接的DNA。還可以使用非病毒遞送載體和方法，包括但不限于與處死的腺病毒連接或未連接的單獨聚陽離子濃縮的DNA（參見例如，Curiel（1992）,Hum.GeneTher.3：147）；配體連接的DNA（參見例如，Wu（1989）,J.Biol.Chem.264：16985）；真核細胞遞送載體細胞（參見例如，美國專利號5,814,482；PCT公開號WO95/07994；WO96/17072；WO95/30763；和WO97/42338）以及核電荷中和或與細胞膜融合。還可以使用裸DNA。示例性裸DNA引入方法在PCT公開號WO90/11092和美國專利號5,580,859中得到描述?？梢猿洚敾蜻f送載體的脂質(zhì)體在美國專利號5,422,120；PCT公開號WO95/13796；WO94/23697；WO91/14445；和EP專利號0524968中得到描述。另外的方法在Philip（1994）,Mol.CellBiol.14：2411和Woffendin（1994）,Proc.Natl.Acad.Sci，91：1581中得到描述。包含本發(fā)明的抗體的組合物可以與一種或多種其他治療劑順次或同時施用，所述其他治療劑例如化學治療劑（例如，5-FU、5-FU/MTX、5-FU/甲酰四氫葉酸(leucovorin)、左旋咪唑(levamisole)、依立替康(irinotecan)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、卡培他濱(capecitabin)或尿嘧啶/替加氟(tegafur)），免疫佐劑，生長抑制劑，細胞毒性劑和細胞因子等?？贵w和治療劑的量依賴使用何種類型的藥物、待治療的病理狀態(tài)、以及施用的時間安排和途徑，但一般將小于各自單獨施用時。包含本文描述的抗體的組合物施用后，組合物的功效可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的各種方法在體外和體內(nèi)進行評估。用于測試候選組合物的抗癌活性的各種動物模型是眾所周知的。這些包括異種移植到無胸腺裸鼠或scid/scid小鼠內(nèi)的人腫瘤，或遺傳鼠類腫瘤模型例如p53敲除小鼠。這些動物模型的體內(nèi)性質(zhì)使得它們特別可以預(yù)示在人患者中的應(yīng)答。此類模型可以通過使用標準技術(shù)，例如皮下注射、尾靜脈注射、脾植入、腹膜內(nèi)植入和在腎小囊下植入等，將細胞引入同基因小鼠內(nèi)來產(chǎn)生。試劑盒本發(fā)明還提供了用于在本發(fā)明方法中使用的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包括一個或多個容器和用于依照本文描述的本發(fā)明的任何方法使用的說明書，所述容器包含本文描述的純化抗體或多肽。在某些實施方案中，這些說明書包含根據(jù)本文描述的任何方法施用抗體以治療非造血系統(tǒng)癌癥例如結(jié)腸直腸癌的描述。試劑盒可以進一步包含基于鑒定個體是否患有疾病和疾病的階段、或表位是否在個體的癌細胞上表達，選擇適合于治療的個體的描述。在某些實施方案中，用于檢測樣品中的癌細胞的試劑盒包含本文描述的抗體或多肽，和用于檢測抗體或多肽與樣品中的細胞的結(jié)合的試劑。涉及抗體或多肽治療癌癥的用途的說明書一般包括有關(guān)劑量、給藥方案和施用途徑用于預(yù)期治療的信息。容器可以是單位劑量、大包裝（例如，多劑量包裝）或亞單位劑量。在本發(fā)明的試劑盒中提供的說明書一般是在標簽或包裝插頁上的書面說明書（例如包括在試劑盒中的紙頁），但機讀說明書（例如在磁盤或光盤上攜帶的說明書）也是可應(yīng)用的。標簽或包裝插頁說明組合物用于治療本文描述的癌癥。可以提供說明書用于實踐本文描述的任何方法。本發(fā)明的試劑盒可以在合適的包裝中。合適的包裝包括但不限于，小瓶、瓶、罐、軟包裝（例如密封的Mylar或塑料袋）等。還可以考慮用于與特定裝置組合使用的包裝，所述裝置例如吸入器、鼻施用裝置（例如，噴霧器）或輸注裝置例如微型泵。試劑盒可以具有無菌獲取口（例如容器可以是具有可被皮下注射針頭穿透的塞子的靜脈溶液袋或小瓶）。容器也可以具有無菌獲取口（例如容器可以是具有可被皮下注射針頭穿透的塞子的靜脈溶液袋或小瓶）。組合物中的至少一種活性劑是本文描述的抗體。容器可以進一步包含第二藥學活性劑。試劑盒可以任選提供另外組分例如緩沖劑和解釋信息。通常，試劑盒包含容器和在容器上或伴隨容器的標簽或包裝插頁。實施例提供下述實施例以舉例說明而不是限制本發(fā)明。實施例1：與癌細胞上表達的CD43特異性結(jié)合的單克隆抗體的產(chǎn)生和表征單克隆抗體的產(chǎn)生人結(jié)腸直腸腺癌細胞系COLO205（ATCCCCL-222）購自FoodIndustryResearchandDevelopmentInstitute（CCRC60054）,Hsin-chu,Taiwan，且在含10％FBS（Hyclone）、100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素（GIBCOBRL）的RPMI1640培養(yǎng)基（GIBCOBRL）中于37℃在5％CO2的增濕空氣中生長。雌性8周齡Balb/c小鼠用在500μlPBS中的2x107COLO205細胞或在CFA中的10微克部分純化的蛋白質(zhì)每2周一次免疫3次，且最后給予在200μlPBS中2x106COLO205細胞或10微克部分純化的蛋白質(zhì)進行加強。最后的加強后5天，使脾細胞與X63骨髓瘤細胞融合。雜交瘤用補充有10％FBS（Hyclone）和HATSigmaH0262,終濃度為100μM次黃嘌呤、0.4μM氨基蝶呤、16μM胸苷）的DMEM進行選擇。已產(chǎn)生分泌單克隆抗體5F1、51-41和138-10的3種雜交瘤細胞系m5F1、m51-41、m138-10。關(guān)于單克隆抗體5F1的靶抗原的鑒定和表征來自結(jié)腸直腸癌組織或COLO205細胞的膜蛋白質(zhì)用包含蛋白酶抑制劑（Completetabs；RocheMolecularBiochemicals）的提取緩沖液（50mMTris-HCl,pH7.4,150mMNaCl,1％NonidetP-40）進行分離。膜蛋白質(zhì)裂解物首先在包含固定在蛋白G瓊脂糖（AmershamPharmaciaBiotechInc.,N.J.,U.S.A）上的未免疫小鼠IgG的1-ml柱上進行預(yù)清除，將流出部分直接加到與蛋白G瓊脂糖偶聯(lián)的5F1的1-ml柱上。洗滌柱且洗脫5F1的靶蛋白。在8％SDS-PAGE上分離后，分離的蛋白質(zhì)的純度通過銀染進行觀察，并且還通過蛋白質(zhì)印跡進行鑒定。分離的蛋白質(zhì)還用于免疫小鼠以產(chǎn)生其他5F1樣抗體例如138-10或51-41。對于免疫沉淀實驗，使膜蛋白質(zhì)與5F1或抗CD43抗體（AF2038,R&DSystem,Inc.）進行溫育，隨后與蛋白G瓊脂糖（AmershamPharmaciaBiotechInc.,N.J.,U.S.A）進行溫育。沉淀物在8％SDS-PAGE上進行電泳且實施蛋白質(zhì)（或免疫）印跡分析。使蛋白質(zhì)與等體積的樣品緩沖液（50mMTris-HCl,pH6.8,100mMDTT,2％SDS,0.1％溴酚藍,10％甘油）混合，通過8％SDS-PAGE分開，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（Hybond-CSuper,Amersham）。硝酸纖維素膜隨后用在PBS中的5％脫脂乳進行封閉，且與5F1或抗CD43抗體（AF2038）進行溫育。印跡然后用辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠免疫球蛋白（JacksonImmunoResearchLaboratories,WestGrove,Pa.）進行處理，并且用化學發(fā)光試劑（ECL,Amersham,UK）進行顯色。為了測試5F1是否的確識別CD43，使用商購可得的抗CD43mAb（AF2038,R&Dsystem,Inc.），以通過蛋白質(zhì)印跡分析證實來自COLO205裂解物的5F1親和純化的蛋白質(zhì)的身份。來自5F1結(jié)合陰性的細胞系COLO320的裂解物用作對照。結(jié)果（圖1）顯示抗CD43（AF2038）和5F1抗體均與由5F1免疫親和柱捕獲的蛋白質(zhì)反應(yīng)，這強烈暗示5F1的確識別CD43。單克隆抗體5F1特異性識別在非造血系統(tǒng)癌細胞的細胞表面上表達的CD43。將2x105COLO205細胞種植在v型底96孔板的每個孔中，并且于4℃與0.33-1μg/ml的不同濃度的5F1抗體溫育1小時。細胞用200μlFACS緩沖液（1xPBS+1％FBS）洗滌2次，用100μl1μg/ml（在FACS緩沖液中）山羊抗小鼠IgG-PE（SouthernBiotech.）進行染色，然后于4℃溫育30分鐘。細胞用FACS緩沖液洗滌3次且通過流式細胞術(shù)（BDLSR，BDLifeSciences）進行分析。來自流式細胞術(shù)的抗體結(jié)合結(jié)果顯示于下表1中。單克隆抗體例如5F1（同種型：IgG3）、或138-10（同種型IgM）、或51-41（同種型IgM）識別在COLO205結(jié)腸直腸癌細胞和NCI-N87胃癌細胞而非外周T細胞和Jurkat（類淋巴母細胞性白血病細胞系；ATCCTIB-152）的胞質(zhì)膜上表達的表面CD43。參見下表1。流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)（圖2A和圖2B）也顯示5F1與其他類型的癌細胞結(jié)合，例如結(jié)腸直腸癌細胞（DLD-1）、和胃癌細胞（NCI-N87），但不與下述細胞結(jié)合：正常內(nèi)皮細胞（HUVEC）、正常肺細胞（MRC-5）、正常乳腺上皮細胞（MCF-10A）、正常結(jié)腸直腸細胞（CCD841-CoN）、激活的T淋巴細胞（激活7天）、和正常外周血單核細胞（PBMC）。表1顯示抗CD43抗體例如5F1、138-10或51-41與結(jié)腸直腸癌、胃癌細胞、人外周T細胞、和Jurkat（類淋巴母細胞性白血病細胞系）的抗原結(jié)合性質(zhì)。為了檢測COLO205細胞和人結(jié)腸直腸癌組織中5F1的靶蛋白的表達，使用常規(guī)免疫組織化學法。簡言之，將細胞或組織固定以用于由1μg/ml5F1免疫染色，與生物素標記的抗小鼠IgG溫育，然后與抗生物素蛋白-生物素過氧化物酶復(fù)合物（VectorLaboratories,Inc.Burlingame,CA,U.S.A.）溫育，且用色素原3,3'-二氨基聯(lián)苯胺四氯化物進行染色。免疫組織化學研究顯示來自具有結(jié)腸直腸癌的患者的52.5％組織（31/59）為5F1染色陽性。實施例2.與癌細胞上表達的CD43特異性結(jié)合的抗體的凋亡活性通過ELISA測定法檢測COLO205細胞中由5F1誘導(dǎo)的凋亡為了評估由5F1誘導(dǎo)的細胞死亡類型，使結(jié)腸直腸癌細胞在培養(yǎng)板上生長，且與或不與5F1一起溫育。使用細胞死亡檢測ELISAPLUS試劑盒（Roche,目錄#1774425），通過抗體介導(dǎo)的捕獲以及對細胞質(zhì)單核小體和寡核小體相關(guān)的組蛋白-DNA復(fù)合物的檢測，確定核小體間（凋亡）DNA斷裂的水平。ELISA測定法根據(jù)制造商的說明書來進行。簡言之，將1x104COLO205細胞種在96孔板的每個孔中，且與濃度10μg/ml的5F1或9E10（抗myc抗體）或培養(yǎng)基對照溫育。于37℃溫育6、24或48小時后，細胞進行洗滌且與200μl裂解緩沖液溫育30分鐘。沉淀細胞核（200xg,10分鐘）后，將包含斷裂DNA的20μl上清液（細胞質(zhì)級分）轉(zhuǎn)移至鏈霉抗生物素蛋白包被的微量滴定板，所述微量滴定板已與生物素化的單克隆抗組蛋白抗體溫育。與抗組蛋白抗體結(jié)合的核小體的斷裂DNA的量通過辣根過氧化物酶綴合的單克隆抗DNA抗體，使用ABTS（2,2-連氮基-雙[3-乙基苯并二氫噻唑啉磺酸-6-二銨鹽]）作為底物進行評估。最后，與過氧化物酶底物溫育10-20分鐘后，用微板閱讀儀（MolecularDevices,SPECTRAmaxM2）測定在405nm處的吸光度。來自僅包含裂解緩沖液和底物的孔的值作為背景扣除。釋放到細胞質(zhì)內(nèi)的單和寡核小體的比富集數(shù)據(jù)使用以下公式由吸光度值進行分析：富集因子（E.F.）=樣品（瀕死/死亡細胞）樣品的mU/培養(yǎng)基對照（無mAb處理的細胞）的mUmU=吸光度[10-3]圖3中所示的數(shù)據(jù)指出在溫育24小時后5F1誘導(dǎo)核小體在COLO205細胞的細胞質(zhì)中富集。與培養(yǎng)基對照比較，在5F1處理的細胞質(zhì)中檢測到的斷裂DNA增加超過4倍。此富集在用對照抗體9E10（抗myc抗體）或單獨的培養(yǎng)基處理的細胞中未觀察到，說明5F1單獨引起癌細胞經(jīng)歷凋亡。使用膜聯(lián)蛋白V和PI染色檢測COLO205細胞中由5F1、138-10和51-41誘導(dǎo)的凋亡膜聯(lián)蛋白V染色在凋亡過程的早期階段時翻轉(zhuǎn)朝向胞質(zhì)膜的外側(cè)的磷脂。因此，如FACS分析測定的，膜聯(lián)蛋白V的染色指示細胞經(jīng)歷凋亡。將1.2x105COLO205細胞種植到96孔板的每個孔中，然后向細胞中加入在培養(yǎng)基中稀釋的各種濃度（2-16μg/ml）的5F1或新鮮培養(yǎng)基（未處理的對照）。為了測試交聯(lián)劑（CL）是否是5F1誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡所需的，將20μg/ml兔抗小鼠IgG（JacksonImmunoResearch,目錄#315-005-045）加入一組樣品中用于比較。于37℃溫育6小時后，細胞在室溫下用0.25μl在100μl膜聯(lián)蛋白V結(jié)合緩沖液中的FITC綴合的膜聯(lián)蛋白V（StrongBiotechCorporation）染色15分鐘。細胞隨后用碘化丙啶（PI，DNA染色染料）進行染色，且通過流式細胞術(shù)進行分析。流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)顯示在不存在交聯(lián)劑的情況下，濃度4μg/ml或更高的5F1處理6小時引起顯著數(shù)目的結(jié)腸直腸癌細胞經(jīng)歷凋亡，暗示5F1單獨可以有效誘導(dǎo)COLO205細胞凋亡。還測試了由其他抗CD43抗體138-10和51-41誘導(dǎo)COLO205細胞凋亡的效果。下表2顯示5F1、138-10或51-41誘導(dǎo)結(jié)腸直腸癌細胞中的凋亡。COLO205細胞與32微克/ml每種樣品分別溫育6小時，且用膜聯(lián)蛋白V及隨后用PI染色，隨后為FACS分析。表2.COLO205細胞中由5F1、138-10和51-41誘導(dǎo)的凋亡5F1138-1051-41對照Ab（陰性對照）％凋亡（膜聯(lián)蛋白-V+）>40％>30％>30％<15％上文結(jié)果顯示用對表達CD43的癌特異的抗體處理可以誘導(dǎo)癌細胞凋亡。使用YO-PRO-1染色或膜聯(lián)蛋白V和PI染色檢測NCI-87細胞中由m5F1誘導(dǎo)的凋亡將4x105NCI-N87（人胃癌細胞系）細胞或5x105COLO205細胞種植在12孔培養(yǎng)板（Nunc目錄#150628）中。過夜培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)基，并且加入如圖10中所示濃度的抗體或疊氮化物溫育6小時。隨后，細胞用胰蛋白酶消化，并且收集用于由YO-PRO-1（Invitrogen，目錄#Y3603）染色，或由膜聯(lián)蛋白-V-FITC和PI（StrongBiotech,凋亡檢測試劑盒,目錄#AVK250）雙重染色。如圖10A和10B中所示，如由YO-PRO-染色（A）和由膜聯(lián)蛋白-V-FITC和PI雙重染色（B）測量的，抗體m5F1誘導(dǎo)NCI-87和COLO205細胞凋亡。這些數(shù)據(jù)指出m5F1還可以誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡。實施例3.通過5F1抑制癌細胞生長5F1單獨抑制癌細胞的生長種植結(jié)腸直腸癌細胞（COLO205）和正常內(nèi)皮細胞（HUVEC），且與5F1或?qū)φ湛贵w9E10溫育。還包括未處理的細胞作為陰性對照。如本文所述的，細胞存活使用MTT&WST-1測定法進行評估以檢測增殖活性。WST-1測定法基于四氮唑鹽WST-1由細胞線粒體脫氫酶斷裂成甲替。產(chǎn)生的甲替可以經(jīng)由分光光度計通過測量450nm處的吸光度進行定量?；罴毎脑鲋硨?dǎo)致酶總體活性的增加；而酶活性的減少指示細胞生長抑制。因此，WST-1測定法用于評估腫瘤細胞在5F1處理后的存活率。簡言之，將在100μl培養(yǎng)基中的4x103COLO205細胞種植在96孔培養(yǎng)板中，對于每種處理為5個復(fù)本。隨后加入10μg/ml5F1、對照抗體9E10（抗myc抗體）或新鮮培養(yǎng)基（未處理的對照）。0.5％疊氮化鈉（NaN3）的處理也包括在測定法中作為細胞毒性對照。于37℃3天的溫育期后，向每個孔中加入20μlWST-1試劑（Roche,目錄#1664807），隨后混合物于37℃溫育30分鐘。獲得在450nm處的吸光度以反映處理細胞的存活率。關(guān)于COLO205細胞的WST-1測定法結(jié)果顯示于圖4中。數(shù)據(jù)指出COLO205細胞的生長被實質(zhì)上抑制（圖4），而HUVEC的生長（數(shù)據(jù)未顯示）不受5F1處理的影響。與同種型對照抗體9E10處理的結(jié)腸直腸癌細胞比較，在抗體5F1處理的細胞中存活率百分比減少至小于50％。用0.5％疊氮化鈉處理的陽性對照組顯示19％的存活率。在另一種實驗中，將細胞（2x103）種植在96孔培養(yǎng)板的每個孔中，且與10微克/ml單克隆抗體5F1或?qū)φ湛贵w9E10（針對c-myc的抗體）溫育。未處理的細胞用作陰性對照；用0.5％疊氮化鈉處理的細胞用作陽性對照。于37℃2或3天的溫育期后，向每個孔中加入10ulWST-1試劑，并且細胞進一步溫育30分鐘。隨后如上所述進行WST-1細胞存活測定。顯示于圖5中的結(jié)果指出結(jié)腸直腸癌細胞例如COLO205的生長被抗體5F1實質(zhì)上抑制，但正常結(jié)腸直腸癌細胞系（例如CCD841-CoN）不受影響。MTT是用于測量細胞生存力和增殖的另一種基于四氮唑鹽的方法。黃色四氮唑鹽MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物）被代謝活性的細胞還原（部分地通過脫氫酶的作用），以產(chǎn)生還原當量例如NADH和NADPH。所得到的細胞內(nèi)紫色甲替可以溶解且通過分光光度計測量方法進行定量。將細胞（5x103）種植在96孔培養(yǎng)板的每個孔中，且與單克隆抗體5F1（濃度范圍0-64μg/ml）或抗c-myc的對照抗體9E10（64μg/ml）溫育。未處理的細胞用作陰性對照；用0.5％疊氮化鈉處理的細胞用作陽性對照。于37℃72小時的溫育期后，向每個孔中加入10μlMTT試劑，并且細胞進一步溫育2-4小時直至紫色沉淀物可見。加入100ul檢測試劑（DMSO）。記錄樣品在570nm處的吸光度。來自MTT測定法的數(shù)據(jù)證實5F1以劑量依賴方式（從0到64μg/ml）抑制COLO205的細胞增殖，ED50（50％抑制的有效劑量）是8μg/ml（圖6）。如同樣在圖6中所示，當使用64μg/ml5F1時，發(fā)現(xiàn)細胞生長的顯著抑制，而對照抗體9E10在相同濃度時不具有此類效應(yīng)。5F1的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)的評估5F1的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)在腫瘤異種移植小鼠模型中進行分析。在第0天時將5x106COLO205細胞皮下植入SCID小鼠的后側(cè)腹區(qū)。細胞接種后1周，在一個實驗中，小鼠通過腹膜內(nèi)注射用500微克5F1或PBS進行處理。在另一個實驗中，荷有已建立的腫瘤的4組小鼠（每組6只小鼠）每隔一天用25mg/kg5-氟尿嘧啶加甲酰四氫葉酸（5FL/LV）進行靜脈內(nèi)處理，給予4個劑量，并連同或不連同各種劑量的5F1腹膜內(nèi)注射每周2次。在一個實驗中，通過在第0天時以1x107細胞/小鼠皮下注射結(jié)腸直腸癌細胞COLO205，在SCID小鼠中植入腫瘤，然后在第0、3、5、7、10、12、14和17天時通過腹膜內(nèi)注射單克隆抗體5F1（以500μg/劑量）或?qū)φ諉慰寺】贵w9E10（抗c-myc產(chǎn)生的抗體）或PBS進行處理。在實驗的每個組中使用15只小鼠。腫瘤大小通過寬度、寬度和長度（WxWxL）的乘積從第5天開始測量直至第24天且由mm3表示。如圖7中所示，與對照抗體9E10和PBS（未處理的）比較，單克隆抗體5F1有效抑制腫瘤生長。為了察看5F1和化學藥物如5FU/LV的組合效應(yīng)，在腫瘤植入后7天，小鼠用25mg/kg5FU/LV每隔一天進行iv注射，共4個劑量，且連同或不連同各種量的5F1抗體每周ip注射2次，共3周。腫瘤生長通過測徑器每周2次測量腫瘤體積（mm3）進行評估，并且腫瘤大小使用下式進行計算：π/6x較大直徑x（較小直徑）2（KievitE,CancerResearch,60：6649-55）。如圖8中所示，與化學藥物單獨處理比較，5F1抗體和5FU/LV處理的組合顯著抑制人結(jié)腸直腸腫瘤生長（圖8）。實施例4.三種新抗CD43抗體——5F1、138-10和51-41識別癌細胞上表達的相類表位。為了理解3種新抗CD43抗體（5F1、138-10和51-41）的結(jié)合性質(zhì)，使用FACS分析。在各種量的非生物素化的抗體5F1、138-10和51-41的存在下，COLO205細胞（100,000）于4℃用1微克/ml生物素化的5F1染色1小時。洗滌后，細胞在相同條件下用鏈霉抗生物素蛋白-FITC進一步染色30分鐘。細胞進行洗滌，且通過FACS進行分析。下表3中所示的數(shù)據(jù)是來自1個代表性實驗的平均熒光強度。51-41和138-10抗體能夠與生物素化的5F1競爭和COLO205細胞結(jié)合，暗示所有3種抗體結(jié)合在COLO205細胞的表面表達的相似結(jié)合位點上。表3.5F1、138-10和51-41識別COLO205細胞上表達的相類表位。實施例5.抗體5F1的表位確定為了進一步定義由單克隆抗體5F1識別的表位結(jié)構(gòu)，使用此單克隆抗體測試其與不同多肽序列的特異反應(yīng)性。96抗微量滴定板用抗體5F1以50μl/孔以0.1MNaHCO3（pH8.6）包被緩沖液中10μg/ml的濃度于4℃包被過夜。洗滌后，板用包含0.1MNaHCO3（pH8.6）、5mg/mlBSA、0.02％NaN3的封閉緩沖液（150μl/孔）通過于4℃溫育至少1小時進行封閉。板隨后與各種濃度的包含各種多肽片段的融合蛋白在室溫溫育1小時。用包含0.5％Tween的TBS洗滌后，結(jié)合的融合蛋白-多肽用包含1mg/mlBSA的0.2M甘氨酸-HCl（pH2.2）緩沖液進行洗脫，且用1MTris-HCl（pH9.1）進行中和。隨后測定洗脫的融合蛋白-多肽的氨基酸序列?？贵w5F1結(jié)合的多肽包含（從N末端到C末端）Trp-Pro-Ile（WPI）三肽序列。此三肽氨基酸序列不存在于CD43氨基酸序列中。Pallant等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：1328-32,1989；Shelley等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2819-23,1989。為了進一步證實抗體5F1結(jié)合的三肽表位，執(zhí)行夾心ELISA。96孔微量滴定板用抗體（5F1或?qū)φ湛贵w9E10）以50μl/孔以1μg/ml的濃度于4℃包被過夜。板通過與PBS中的0.25％BSA（150μl/孔）于37℃溫育1小時進行封閉。板隨后與（包含與載體蛋白質(zhì)融合的各種多肽片段的）融合蛋白在室溫溫育2小時。用包含0.05％Tween20的PBS洗滌4次后，板隨后與載體蛋白質(zhì)-特異性抗體以2μg/ml在室溫下溫育1.5小時。溫育后，板用PBST洗滌4次。隨后向每個孔中加入50μl的1：3000稀釋的與HRP綴合的山羊抗載體蛋白-特異性抗體，并且板于37℃溫育1小時。酶反應(yīng)通過加入HRP酶的底物來進行，以測定指定多肽與這2種抗體（5F1和9E10）的反應(yīng)性。下表4顯示當5F1或9E10固定在板上時來自ELISA測定法的數(shù)據(jù)?！?”指示指定多肽與單克隆抗體結(jié)合；和“-”指示指定多肽不與單克隆抗體結(jié)合。單克隆抗體5F1識別三肽WPI表位結(jié)構(gòu)。因為三肽WPI序列不存在于CD43中，所以這些數(shù)據(jù)提示5F1識別包括與三肽WPI所形成的結(jié)構(gòu)具有類似或等價的物理和/或化學特征的結(jié)構(gòu)的構(gòu)象表位。表4.由5F1識別的表位結(jié)構(gòu)實施例6.5F1、138-10和51-41的輕和重鏈的可變區(qū)的克隆和抗體人源化5F1輕和重鏈的可變區(qū)cDNAs通過PCR進行擴增，并且將合成的cDNAs亞克隆到peRII(Invitrogen)內(nèi)用于序列測定。核苷酸序列得自幾個獨立克隆且進行分析。選擇來自獨立克隆的相同cDNA序列以表示每個抗體的輕或重鏈V區(qū)。下表5顯示編碼5F1、138—10、5卜41和人源化5F1(h5F1Vc)的輕和重鏈V區(qū)的翻譯的氨基酸序列和核苷酸序列。表5.抗體可變區(qū)的氨基酸序列，和編碼抗體可變區(qū)的核酸序列(CDRs是有下劃線的)5F1重鏈氨基酸序列(SEQIDNO：1)和核苷序列(SEQIDNO：9)1MEWSWIFLFLLSGTAGVHSE1ATGGAATGGAGTTGGATATTTCTCTTTCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTCTGAG21VQLQQSGPELVKPGASVRMS61GTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAGGATGTCC41CTASGYTFTSYVMHWIKQKP121TGCACGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATGCACTGGATAAAGCAGAAGCCT61GQGLDWIGVTNPYNGGTQYN181GGGCAGGGCCTTGACTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGGTGGTACTCAGTACAAT81EKFKGKATLTSDKSSSTAYM241GAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATG101ELSSLTSEDSAVYYCARRTF301GAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGACGGACCTTC121PYYFDYWGQGTTLTVSS361CCGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA5F1輕鏈氨基酸序列(SEQIDNO：2)和核苷酸序列(SEQIDNO：10)1MKLPVRLLVLMFWIPASSSD1ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGAT21VLMTQTPLSLPVSLGDQASI61GTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATC41SCRSSQSILHSNGNTYLEWY121TCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTTTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTAC61LQKPGQSPKLLIYKVSNRFS181CTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCT81GVPDRFSGSGSGTDFTLKIS241GGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGC101RVEAEDLGVYYCFQGSHAPL301AGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTACTACTGCTTTCAAGGTTCACATGCTCCTCTC121TFGAGTKLELK361ACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA138-10重鏈氨基酸序列(SEQIDN0：3)和核苷酸序列(SEQIDNO：11)1MECNWILPFILSVISGVYSE1ATGGAATGTAACTGGATACTTCCTTTTATTCTGTCGGTAATTTCAGGGGTCTACTCAGAG21VQLQQSGTVLARPGASVKMS61GTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGACTGTGCTGGCAAGGCCTGGGGCTTCCGTGAAGATGTCC41CKASGYSFISYWMHWVKQRP121TGCAAGGCTTCTGGCTACAGCTTTATCAGCTACTGGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCT61GQGLEWIGAISPGDSDTTYN181GGACAGGGTCTAGAATGGATTGGTGCTATTTCTCCTGGAGATAGTGATACTACCTACAAC81QRFTGKAKLTAVTSASTAYM241CAGAGGTTCACGGGCAAGGCCAAACTGACTGCAGTCACATCCGCCAGCACTGCCTACATG101ELSSLTNEDSAVYYCIRRDG301GAGCTCAGCAGCCTGACAAATGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTATAAGAAGGGATGGT121NYQVAWFAYWGQGTLVTVSA361AACTACCAAGTTGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA138-10輕鏈氧基酸序列(SEQIDNO：4)和核苷酸序列(SEQIDNO：12)1MKLPVRLLVLMFWIPASSSD1ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGAT21VLMTQTPLSLPVSLGDQASI61GTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATC41SCRSSQSIVHSNGNTYLEWY121TCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTAC61LQKPGQSPKLLIYKVSNRFS181CTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCT81GVPDRFSGSGSGTDFTLKIS241GGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGC101RVEAEDLGVYYCFQGSHVPF301AGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCATTC121TFGSGTKLEIK361ACqTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA51-41重鏈氨基酸序列(SEQIDNO：5)和核苷酸序列(SEQIDNO:13)1MECNWILPFILSVISGVYSE1ATGGAATGTAACTGGATACTTCCTTTTATTCTGTCGGTAATTTCAGGGGTCTACTCAGAG21VQLQQSGTVLARPGASVKMS61GTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGACTGTGCTGGCAAGGCCTGGGGCTTCCGTGAAGATGTCC41CKASGYSFTSYWMHWVKQRT121TGCAAGGeTTCTGGCTAeAGTTTTACCAGCTACTGGATGCACTGGGTAAAACAGAGGACr61GQGLEWIGAISPGDGDTTYN181GGGCAGGGTCTAGAATGGATTGGTGCTATTTCTCCTGGAGATGGTGATACTACCTACAAC81QKFTGKAKLTAVTSASTAYM241CAGAAGTTCACGGGCAAGGCCAAACTGACTGCAGTCACATCCGCCAGCACTGCCTACATG101ELSSLTHEDSAVYYCTRRDG301GAGCTCAGCAGCCTGACACATGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGAAGAGATGGT121SYQVAWFAYWGRGTLVTVSA361AGCTACCAAGTTGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCGAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA51-41輕鏈氨基酸序列(SEQID1NO：6)和核苷酸序列(SEQIDNO：14)1MKLPVRLLVLMFWIPVSSSD1ATGAAATTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGTTTCCAGCAGTGAT21VLMTQTPLSLPVSLGDQASI61GTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATC41SCRSSQSIVHSNGNTYLEWF121TCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTCCATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTTC61LQKPGQSPKLLIYKVSNRFS181CTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCT81GVPDRFSGSGSGTDFTLKIS241GGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGC101RVEAEDLGVYYCFQGSHVPF301AGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCATTC121TFGSGTKLEIK361ACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAAh5F1Vc重鏈氨基酸序列(SEQIDNO：7)和核苷酸序列(SEQIDNO：15)1MGWSWIFLFLLSGTAGVHSQ1ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGGTACCGCGGGCGTGCACTCTCAG21VQLVQSGAEVKKPGSSVKVS61GTCCAGCTTGTCCAGTCTGGGGCTGAAGTCAAGAAACCTGGCTCGAGCGTGAAGGTCTCC41CKASGYTFTSYVMHWVRQAP121TGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGCTATGTTATGCACTGGGTAAGGCAGGCCCCT61GQGLEWIGYINPYNGGT0YN181GGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGGTGGTACTCAGTACAAT81EKFKGKATITADESTNTAYM241GAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACAATTACTGCAGACGAATCCACCAATACAGCCTACATG1O1ELSSLTSEDSAVYYCARRTF301GAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACAGCGCAGTCTATTACTGTGCAAGACGGACCTTC121PYYFDYWGQGTTLTVSS361CCGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCACGCTCACAGTCTCCTCAh5F1Vc輕鏈氨基酸序列(SEQIDNO：8)和核苷酸序列(SEQIDNO:16)1METDTLLLWVLLLWVPGSTG1ATGGAGACCGATACCCTCCTGCTATGGGTCCTCCTGCTATGGGTCCCAGGATCAACCGGA21DIQMTQSPSSLSASVGDRVT61GATATTCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCCTCTCTGCTAGCGTCGGGGATAGGGTCACC41ITCRSSQSILHSNGNTYLEW121ATAACCTGCAGATCTAGTCAGAGCATTTTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGG61YQQKPGKAPKLLIYKVSNRF181TACCAGCAGAAGCCAGGCAAAGCTCCCAAGCTTCTAATCTATAAAGTTTCCAACCGATTT81SGVPSRFSGSGSGTDFTLTI241TCTGGAGTCCCTTCACGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCGATTTCACCCTCACAATC101SSLQPDDFATYYCFQGSHAP301AGCTCTCTGCAGCCAGATGATTTCGCCACTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGCTCCT121LTFGQGTKVELK361CTCACGTTCGGTCAGGGGACCAAGGTGGAGCTGAAA實施例7.嵌合5F1抗體的生產(chǎn)和表征嵌合抗體5F1(c5F1)的構(gòu)建和生產(chǎn)為了構(gòu)建用于表達嵌合抗體的載體，將5F1的輕鏈V區(qū)亞克隆到質(zhì)粒pVk內(nèi)。pVk包含CMV啟動子和人輕鏈恒定區(qū)。關(guān)于人輕鏈恒定區(qū)的序列和生物信息可以在在eter，P.A.，等人(1980)，ClonedhumanandmousekappaimmunoglobulinconstantandJregiongenesconservehomologyinfunctionalsegments.Cell，22(1Pt1)：第197—207頁中找到。將5F1的重鏈V區(qū)亞克隆到質(zhì)粒pVg1內(nèi)。pVg1質(zhì)粒具有CMV啟動子且包含IgG1的人重鏈恒定區(qū)。關(guān)于人IgG1重鏈恒定區(qū)的序列和生物信息可以在Ellison，J.w.，BJ.Berson，和L.E.Hood(1981)，TheNucleotidesequenceofahumanimmunoglobulinCgamma1gene.，NucleicAcidsRes.10：4071中找到。隨后將輕和重鏈表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到Cos一7細胞內(nèi)。收集包含c5F1的上清液且就c5F1的凋亡誘導(dǎo)功能進行分析。c5F1的功能測試包含c5F1的上清液隨后通過表面染色就其與COLO205細胞的結(jié)合進行測試，并通過如上所述的膜聯(lián)蛋白V凋亡測定法就其功能進行測試。對于結(jié)合測定法，使用0.58微克／mlc5F1。對于凋亡試驗，使用2～32微克/mlm5F1、c5F1和9E10（抗myc對照抗體）且溫育16小時。包含c5F1的上清液結(jié)合COLO205細胞，且在COLO205細胞中誘導(dǎo)凋亡，正如其小鼠對應(yīng)物一樣，這證實克隆的cDNA片段事實上編碼5F1的V區(qū)（圖9A和9B）。實施例8.用m5F1的結(jié)腸直腸癌組織免疫組織化學研究用m5F1的組織染色m5F1靶的表達通過免疫組織化學在來自結(jié)腸直腸癌患者（n=59）的石蠟包埋的原發(fā)性腫瘤組織樣品中進行研究。石蠟包埋的人結(jié)腸和直腸癌組織的組織陣列得自SuperBioChipsLaboratories（人組織陣列，目錄號CD1）。標準染色操作根據(jù)制造商的說明書（VECTASTAINEliteABCKit,VectorLaboratories）用于免疫組織化學。所有切片于58℃加熱1小時，用二甲苯脫石蠟5次，且在遞減濃度的一系列乙醇中再水合。用正常血清（VECTASTAIN,PK6102）封閉1小時后，切片與m5F1以1μg/ml的濃度在RT溫育1小時，隨后與二級、生物素化的抗小鼠抗體（VECTASTAIN,PK6102）進行溫育。切片隨后與鏈霉抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物（VECTASTAIN,PK6102）進行溫育。載玻片用二氨基聯(lián)苯胺溶液進行顯色。最后載玻片用蘇木精進行復(fù)染色、脫水、清潔、且在PBS中的50％甘油中封片。降解的評估每個組織切片中的抗原表達由2個獨立的觀察者進行評估，并且用5F1的染色使用經(jīng)驗的半定量系統(tǒng)進行分級：-，陰性；+-，弱染色；+中等染色；++，強染色。結(jié)果在所有切片中，m5F1染色主要在膜上?？偟膩碚f，59個腫瘤樣品中的31個（52.5％）顯示5F1靶的陽性染色，在它們中，27個（45.8％）顯示強表達水平。19個樣品（32.2％）顯示m5F1靶表達的陰性染色。在測試的所有結(jié)腸直腸癌樣品中的染色結(jié)果概括顯示于下表6中。這些數(shù)據(jù)指出抗體m5F1可以用于診斷結(jié)腸直腸癌。表6.在人結(jié)腸直腸癌中5F1靶表達的頻率++：27/59（45.76％）+：4/59（6.78％）+-：9/59（15.25％）-：19/59（32.20％）實施例9.m5F1與COLO205表達的重組人CEA（rhCEA）和CD43（rhCD43）結(jié)合，但不識別COS-7細胞表達的rhCEA或rhCD43。蛋白質(zhì)樣品制備COLO205和COS細胞中重組Flag標簽的CEA的免疫沉淀：將編碼全長CEA蛋白質(zhì)（35～702aa）的cDNA克隆到質(zhì)粒pFlag-CMV-1內(nèi)。改造的質(zhì)粒DNA通過電穿孔引入COLO205內(nèi)（用于穩(wěn)定細胞系改造）或通過lipofectamine2000（Invitrogen,目錄#11668-019）引入COS細胞內(nèi)（用于瞬時表達實驗）。收集抗原表達細胞且在包含蛋白酶抑制劑（Roche,目錄#11836145001）的裂解緩沖液（50mMTris-HCl,pH8.5,150mMNaCl，1％NP40）中進行裂解。使細胞裂解物的上清液與抗Flag（M2,Stratagene,目錄#200472）偶聯(lián)的蛋白G瓊脂糖珠（GEHealthcare,目錄#17-0618-02）于4℃溫育2小時。蛋白G瓊脂糖珠隨后用裂解緩沖液洗滌3次。包含IP產(chǎn)物的蛋白G瓊脂糖珠用作SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡的樣品。COLO205細胞中表達的Cr1標簽的CD43的可溶重組蛋白質(zhì)純化：將編碼CD43蛋白質(zhì)的胞外域的cDNA克隆到經(jīng)修飾的pcDNA3質(zhì)粒內(nèi)，所述pcDNA3質(zhì)粒包含N末端Flag和C末端Cr1標簽。改造的質(zhì)粒DNA通過電穿孔引入COLO205細胞內(nèi)用于形成穩(wěn)定的細胞系。由COLO205表達的可溶性重組hCD4320-253包含N末端3xFlag標簽和C末端Cr1標簽?？扇艿鞍踪|(zhì)通過蛋白A瓊脂糖珠（GEHealthcare,目錄#17-1279-02）進行純化。用甘氨酸緩沖液洗脫且針對PBS透析后，將蛋白質(zhì)樣品貯藏于-20℃用于未來使用。COS細胞中瞬時表達的CD43的全細胞裂解物：包含全長人CD43的構(gòu)建體（在pcDNA3.1myc-His中）通過Lipofectamine2000（Invitrogen,Catalog#11668-019）引入COS細胞內(nèi)。細胞用包含蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液（50mMTris-HCl,pH7.4、150mMNaCl、1mMEDTA、0.25％SDS、1％NP-40）進行裂解，且在21,900于4℃離心10分鐘以收集上清液。Bio-Rad定量后，將足夠量的蛋白質(zhì)裂解物加載到SDS-PAGE上用于蛋白質(zhì)印跡分析。蛋白質(zhì)印跡分析加入樣品緩沖液后，使蛋白質(zhì)樣品于95℃煮沸，加載到SDS-PAGE微型膠上，然后轉(zhuǎn)移至NC紙（GEHealthcare,Hybond-ECL,目錄#RPN303D）。用在TBS中的5％脫脂乳封閉膜后，加入一抗。一抗的結(jié)合通過HRP綴合的二抗（NENLifeScience,HRP-山羊抗小鼠IgG,目錄#NEF822，或SouthernBiotech,HRP-山羊抗小鼠Ig,目錄#1010-05）進行檢測，并且用ECL蛋白質(zhì)印跡檢測試劑（GEHealthcare,目錄#RPN2106）進行顯色。結(jié)果在圖11A中顯示的實驗中，表達rhCEA的COLO205細胞的細胞裂解物用抗Flag抗體進行免疫沉淀，并且免疫沉淀的蛋白質(zhì)在SDS-PAGE上進行電泳，且轉(zhuǎn)移至NC紙。NC紙用各種抗體進行印跡：抗Flag、m5F1、50-14、51-41、138-10、186-14、280-6、或抗CEA抗體（CEA/Ab-3；來自NeoMarkerCat.MS-613-P1ABX的克隆名稱COL-1）。圖11A中的數(shù)據(jù)顯示m5F1、51-41和138-10識別由COLO205細胞表達的rhCEA。在圖11B中顯示的實驗中，表達rhCEA的COS-7細胞的細胞裂解物用抗Flag抗體進行免疫沉淀，并且免疫沉淀的蛋白質(zhì)在SDS-PAGE上進行電泳，且轉(zhuǎn)移至NC紙。NC紙用各種抗體進行印跡：抗Flag、m5F1、或抗CEA抗體（CEA/Ab-3）。圖11B中的數(shù)據(jù)顯示m5F1不與COS-7細胞表達的rhCEA結(jié)合。在圖12A中顯示的實驗中，由COLO205表達的可溶蛋白質(zhì)用蛋白A瓊脂糖珠進行純化，并且在SDS凝膠上進行電泳，且轉(zhuǎn)移至NC紙。NC紙用各種抗體進行印跡：m5F1、51-41或138-10。圖12A中的數(shù)據(jù)顯示m5F1、51-41和138-10識別由COLO205細胞表達的rhCD43。在圖12B中顯示的實驗中，由COLO205表達的可溶蛋白質(zhì)用蛋白A瓊脂糖珠進行純化，并且在SDS-PAGE上進行電泳，且轉(zhuǎn)移至NC紙。NC紙用抗CD43（MEM59）（左圖）或m5F1（右圖）進行印跡。圖12B中的數(shù)據(jù)顯示m5F1不識別由COS-7細胞表達的rhCD43。這些數(shù)據(jù)指出由m5F1識別的表位包括特異于某些細胞類型的翻譯后修飾。實施例10.由m5F1、51-41和138-10識別的表位包括路易斯a（Lea）結(jié)構(gòu)且是巖藻糖依賴性的糖苷酶處理重組人CEA（rhCEA）通過在COLO205細胞中表達人CEA蛋白質(zhì)進行生產(chǎn)。將編碼rhCEA（CEA-N-A2）的cDNA克隆到包含F(xiàn)lag標簽的經(jīng)修飾的pcDNA3質(zhì)粒內(nèi)，所述cDNA是具有CEA的氨基酸35-145（N結(jié)構(gòu)域）和氨基酸324-415（A2結(jié)構(gòu)域）的融合物。CEA的氨基酸殘基位置基于前蛋白中的氨基酸位置。改造的質(zhì)粒DNA通過電穿孔引入COLO205細胞內(nèi)用于穩(wěn)定的細胞系改造。重組CEA蛋白質(zhì)使用抗Flag抗體從表達重組CEA的穩(wěn)定細胞系的細胞培養(yǎng)上清液中進行純化。對于每個反應(yīng)，使約1.8μg重組蛋白質(zhì)（rhCEA）與來自黃單胞菌屬物種（Xanthomonassp.）（Sigma,目錄#F1924）的不同量（0、0.01、0.03或0.1mU）的α-1→（2,3,4）-巖藻糖苷酶溶液于37℃溫育20小時。處理后，將蛋白質(zhì)樣品加載到SDS-PAGE上用于考馬斯藍染色（圖13左圖）或用m5F1進行蛋白質(zhì)印跡檢測（圖13右圖）。如圖13中所示，當抗原用α-1→（2,3,4）-巖藻糖苷酶處理時，m5F1與rhCEA的結(jié)合減少，說明m5F1識別巖藻糖敏感性糖-表位。寡糖競爭試驗為了進一步測試由m5F1識別的糖表位，使用各種寡糖進行競爭試驗。購買寡糖（路易斯a來自Sigma目錄#03499、路易斯b-乳糖來自Sigma目錄#L7033、路易斯x-乳糖來自Sigma目錄#L7777、路易斯y來自Sigma目錄#L7784、唾液酸-路易斯x來自Sigma目錄#S1782、Lacto-N-四糖來自Sigma目錄#L6770、Lecto-N-二巖藻糖六糖II來自Sigma目錄#L6645、路易斯a來自Calbiochem目錄#434626、和β-乳糖來自Sigma目錄#L3750）且溶解于PBS中。這些寡糖的結(jié)構(gòu)顯示于圖14中。將寡糖（以1mM的終濃度）加入包含2x105COLO205細胞的不同孔內(nèi)，隨后加入指示抗體（m5F1,51-41或138-10；各自0.25ug/ml）。于4℃溫育1小時后，棄去上清液且加入二級抗體（SouthernBiotech,RPE-山羊抗小鼠IgG,目錄#1032-09，或SouthernBiotech,RPE-山羊抗小鼠IgM,目錄#1022-09）。并且細胞結(jié)合信號用流式細胞術(shù)分析進行檢測。如圖15中所示，LNDFHII、Le（a）-乳糖和Le（a）在各種水平上均抑制抗體m5F1、51-41和138-10與COLO205細胞的結(jié)合；并且LNT還抑制抗體51-41和138-10的結(jié)合，但不顯著抑制m5F1與COLO205細胞的結(jié)合。這指出由這些抗體識別的表位可能包括Lea或類似結(jié)構(gòu)，并且是巖藻糖敏感性的。此外，m5F1抗體具有比抗體51-41和138-10更高的對巖藻糖的依賴性。盡管為了清楚理解起見本發(fā)明已通過舉例說明和實施例相當詳細地進行了描述，但說明書和實施例不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。參考文獻Laos,S.,Baeckstrom,D,和Hansson,G.C.(2006)，結(jié)腸癌細胞中白細胞糖蛋白CD43對NF-κB激活和趨化因子表達的抑制(InhibitionofNF-kappaBactivationandchemokineexpressionbytheleukocyteglycoprotein,CD43,incoloncancercells).Int.J.Oncol.28(3):695-704.Fuhlbrigge,R.C.,King,S.L.,Sackstein,R.,和Kupper,TS.(2006)CD43是CLA+人T細胞上E-選擇蛋白的配體(CD43isaligandforE-selectinonCLA+humanTcells).Blood.15;107(4):1421-6.Matsumoto,M.,Atarashi,K.,Umemoto,E.,Furukawa,Y.,Shigeta,A.,Miyasaka,M.,和Hirata,T.(2005)活化的T細胞上CD43作為E-選擇蛋白的配體起作用(CD43functionsasaligandforE-SelectinonactivatedTcells).J.Immunol.15;175(12):8042-50.Pimenidou,A.,Madden,L.A.,Topping,K.P.,Smith,K.A.,Monson,J.R.,和Greenman,J.(2004)新CD43特異性噬菌體抗體與早期結(jié)腸直腸腫瘤反應(yīng)(NovelCD43specificphageantibodiesreactwithearlystagecolorectaltumours).Oncol.Rep.11(2):327-31.Kadaja,L.,Laos,S.,和Maimets,T.(2004)過表達白細胞標志CD43造成腫瘤抑制蛋白p53和ARF的激活(OverexpressionofleukocytemarkerCD43causesactivationofthetumorsuppressorproteinsp53andARF).Oncogene.19;23(37):2523-2530.Fernandez-Rodriguez.J.,Andersson.,C.X.,Laos,S.,Baeckstrom,D.,Sikut,A.,Sikut,R.,和Hansson,G.C.(2002)白細胞抗原CD43在非造血系統(tǒng)來源的不同細胞系中表達(TheleukocyteantigenCD43isexpressedindifferentcelllinesofnonhematopoieticorigin).TumourBiol.23(4):193-201.Cermak,L.,Simova,S.,Pintzas,A.,Horejsi,V.,和Andera,L.(2002)，CD43介導(dǎo)的TF-I細胞凋亡的分子機制，轉(zhuǎn)錄Daxx表達和粘附分子的作用(MolecularmechanismsinvolvedinCD43-mediatedapoptosisofTF-Icells.RolesoftranscriptionDaxxexpression,andadhesionmolecules).JBiolChem.8;277(10):7955-61.Carlow,D.A.,Corbel.S.Y.,和Ziltener,H.J.(2001)CD43的缺乏不能改變T細胞的發(fā)育和反應(yīng)性(AbsenceofCD43failstoalterTcelldevelopmentandresponsiveness).JImmunol.166(1):256-61.Nieto,M.,Rodriguez-Fernandez,J.L.,Navarro,F.,Sancho,D.,Frade,J.M.,Mellado,M.,Martinez-A,C,Cabanas,C.和Sanchez-Madrid,F.(1999)通過CD43的信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)天然殺傷細胞活化、趨化因子釋放和PYK-2活化(SignalingthroughCD43inducesnaturalkillercellactivation,chemokinerelease,andPYK-2activation).Blood.94(8):2767-77.Sikut.R.,Andersson,C.X.,Sikut,A.,Fernandez-Rodriguez,J.,Karlsson.N.G.,和Hansson,G.C.(1999)通過抗CD43胞內(nèi)域的新單克隆抗體在結(jié)腸腺瘤和腺癌中檢測CD43(白涎蛋白)(DetectionofCD43(leukosialin)incolonadenomaandadenocarcinomabynovelmonoclonalantibodiesagainstitsintracellulardomain).Int.J.Cancer.82(l):52-8.Lopez,S.,Seveau,S.,Lesavre,P.,Robinson,M.K.,和Halbwachs-Mecarelli,L.(1998)CD43(涎福林,白涎蛋白)脫落是中性粒細胞遷移過程的早期事件——這可能與粘著細胞的散布緊密相關(guān)(CD43(sialophorin,leukosialin)sheddingisaninitialeventduringneutrophilmigration,whichcouldbecloselyrelatedtothespreadingofadherentcells).CellAdhes.Commun.5(2):151-60.Stockton,B.M.,Cheng,G.,Manjunath,N.,Ardman,B.,和vonAndrian,U.H.(1998)CD43對T細胞歸巢的負調(diào)節(jié)(NegativeregulationofTcellhomingbyCD43).Immunity.8(3):373-81.McEvoy,L.M.,Jutila,M.A.,Tsao,P.S.,Cooke,J.P.,和Butcher,E.G.(1997)抗CD43抑制炎癥和動脈粥樣化中的單核細胞-內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