本發(fā)明屬于生物與醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。更具體的說(shuō)它涉及具有腫瘤靶向性載體多肽與蒽環(huán)類(lèi)藥物，通過(guò)多聚N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺共價(jià)連接所形成的偶聯(lián)化合物及其制備方法。這些共價(jià)偶聯(lián)化合物能主動(dòng)靶向性定位于表皮生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性表達(dá)的各種腫瘤。

背景技術(shù)：

阿霉素(doxorubicin，DOX)、表阿霉素(epirubicin，EPI)、吡喃阿霉素(therarubicin，THP)、去甲氧柔紅霉素(idarubicin，IDA)和米托蒽醌(mitoxantrone，DHAQ)等蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤藥物，通過(guò)抑制細(xì)胞DNA和RNA的合成，發(fā)揮藥理作用?，F(xiàn)已成為多種癌癥化療方案中的核心藥物，被全球廣泛使用。然而，由于蒽環(huán)類(lèi)藥物對(duì)腫瘤缺乏選擇性，往往對(duì)正常組織造成非特異性損害，使人體產(chǎn)生骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、脫發(fā)等毒性副反應(yīng)。其中最為顯著和突出的毒性作用是不可逆的劑量累積性心臟損害，使其在臨床上的應(yīng)用受到了嚴(yán)格地限制。

為了提高藥物的療效并克服毒性副作用，利用腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞中有更高表達(dá)和/或異常表達(dá)的受體作為靶點(diǎn)，以配體的活性片段為載體，與蒽環(huán)類(lèi)藥物偶聯(lián)產(chǎn)生新型藥物化合物，借助配體-受體的結(jié)合具有高特異性、高選擇性和高親和力等生物學(xué)特性，配體活性片段攜帶藥物，主動(dòng)識(shí)別細(xì)胞中的靶標(biāo)受體并與其結(jié)合，通過(guò)受體的介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，從而在腫瘤細(xì)胞內(nèi)積聚高濃度的藥物來(lái)發(fā)揮作用。與此同時(shí)，由于該受體在正常組織細(xì)胞中沒(méi)有表達(dá)或是低表達(dá)，與配體活性片段偶聯(lián)的藥物化合物不能或很少與受體結(jié)合，細(xì)胞不攝取或僅攝取少量藥物，從而改變了藥物在體內(nèi)的分布狀態(tài)，完成藥物在體內(nèi)的重分布和重分配。因此，利用上述原理，我們針對(duì)性地將特定的配體活性片段，引入到蒽環(huán)類(lèi)藥物分子中進(jìn)行修飾和改造，設(shè)計(jì)并合成出能使它們靶向性分布于癌細(xì)胞的新型藥物分子，形成了高效、低毒的高選擇性抗腫瘤化合物。

選擇腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)或過(guò)度表達(dá)的受體分子為靶點(diǎn)，是腫瘤靶向治療的基礎(chǔ)?，F(xiàn)已證實(shí)，與非腫瘤細(xì)胞相比，表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)在肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、腦膠質(zhì)瘤以及頭頸部腫瘤等癌細(xì)胞中存在高表達(dá)或過(guò)表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)EGFR的異常過(guò)表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的惡變、粘附、轉(zhuǎn)移以及血管生成等密切相關(guān)。多年來(lái)，針對(duì)EGFR的單克隆抗體和小分子酪氨酸激酶抑制劑已被臨床廣泛用于腫瘤的治療，因此，EGFR作為陽(yáng)性表達(dá)腫瘤的重要靶標(biāo)，已被深入研究和臨床應(yīng)用。

表皮生長(zhǎng)因子(EGF)是EGFR最重要的配體，它與EGFR的結(jié)合具有高特異性、高選擇性和高親和力。研究發(fā)現(xiàn)，EGF中CMYIEALDKYAC序列是與EGFR結(jié)合的活性區(qū)域，故稱該活性肽段為EGFR結(jié)合肽(EGFR-binding peptide，EBP)。鑒于EGFR在許多惡性腫瘤中都存在著陽(yáng)性表達(dá)，以及EBP與EGFR結(jié)合的特異性，本發(fā)明將EBP引入到蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤藥物分子中進(jìn)行分子修飾和改造，形成具有針對(duì)EGFR分子的腫瘤靶向性蒽環(huán)類(lèi)衍生物。

水溶性N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)聚合物作為高分子抗腫瘤藥物材料，具有生物相容性、非免疫原性，以及可根據(jù)使用目的對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾的特點(diǎn)。以HPMA聚合物為骨架而構(gòu)成的多聚HPMA-抗腫瘤藥物偶合物，可以形成以疏水藥物為核心的單分子微團(tuán)，具有較好的穩(wěn)定性和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。因此，多聚HPMA-抗腫瘤藥物偶合物成為當(dāng)前大分子靶向藥物研究的熱點(diǎn)之一。其中，多聚HPMA-阿霉素接合物等幾種抗癌藥物接合物正進(jìn)行臨床研究。但目前研究只局限于具有“增強(qiáng)透過(guò)及滯留效應(yīng)”(enhanced permeability and retention effect，EPR效應(yīng))的被動(dòng)腫瘤靶向藥物。

本發(fā)明涉及具有主動(dòng)腫瘤靶向性的多聚HPMA-蒽環(huán)類(lèi)衍生物及其制備方法。這種主動(dòng)腫瘤靶向性多聚HPMA-蒽環(huán)類(lèi)衍生物是基于配體-受體反應(yīng)特異性的原理，通過(guò)特別設(shè)計(jì)，將含有EBP多肽作為載體，通過(guò)水溶性HPMA聚合物與蒽環(huán)類(lèi)藥物分子偶聯(lián)，合成出含EBP多肽序列的蒽環(huán)類(lèi)衍生物，能主動(dòng)靶向性集聚蒽環(huán)類(lèi)藥物到EGFR陽(yáng)性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮高效、低毒的抗腫瘤藥理效應(yīng)。經(jīng)體外和動(dòng)物體內(nèi)的系列試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)合成的衍生物具有：①.良好的腫瘤選擇性；②.專(zhuān)一的受體介導(dǎo)通路；③.高效的抗腫瘤活性；④.甚低的機(jī)體正常組織毒性；⑤.高度的生物相容性等特點(diǎn)?？梢越鉀Q蒽環(huán)類(lèi)藥物缺乏腫瘤選擇性等難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了提高蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤藥物的治療效果及克服毒性副作用，為惡性腫瘤的治療提供高效、低毒的方案。本發(fā)明涉及的衍生物可與細(xì)胞EGFR結(jié)合，高選擇性地輸送蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤藥物至體內(nèi)EGFR陽(yáng)性表達(dá)的腫瘤靶組織，發(fā)揮靶向治療腫瘤的作用。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：它是含EGFR結(jié)合肽(序列：CMYIEALDKYAC，EBP)，是EBP與蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤藥物，通過(guò)HPMA聚合物結(jié)合而形成的蒽環(huán)型衍生物，它具有識(shí)別細(xì)胞細(xì)胞EGFR并與該受體結(jié)合的能力。其通式如下：AN-HPMA-EBP，AN表示蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤藥物，HPMA表示N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺聚合物，EBP表示EGFR結(jié)合肽(序列：CMYIEALDKYAC)。

本發(fā)明涉及的蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤藥物是阿霉素(doxorubicin，DOX)，通過(guò)N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)聚合物與含EBP的化合物共價(jià)結(jié)合所形成的蒽環(huán)型衍生物，具有識(shí)別細(xì)胞EGFR并與該受體結(jié)合的能力。其通式如下：DOX-HPMA-EBP。

本發(fā)明涉及的蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤藥物是表阿霉素(epirubicin，EPI)，通過(guò)N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)聚合物與含EBP的化合物共價(jià)結(jié)合所形成的蒽環(huán)型衍生物，具有識(shí)別細(xì)胞EGFR并與該受體結(jié)合的能力。其通式如下：EPI-HPMA-EBP。

本發(fā)明涉及的蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤藥物是吡喃阿霉素(pirarubicin，THP)，通過(guò)N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)聚合物與含EBP的化合物共價(jià)結(jié)合所形成的蒽環(huán)型衍生物，具有識(shí)別細(xì)胞EGFR并與該受體結(jié)合的能力。其通式如下：THP-HPMA-EBP。

本發(fā)明涉及的蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤藥物是去甲氧柔紅霉素(idarubicin，IDA)，通過(guò)N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)聚合物與含EBP的化合物共價(jià)結(jié)合所形成的蒽環(huán)型衍生物，具有識(shí)別細(xì)胞EGFR并與該受體結(jié)合的能力。其通式如下：IDA-HPMA-EBP。

本發(fā)明涉及的蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤藥物是米托蒽醌(mitoxantrone，DHAQ)，通過(guò)N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)聚合物與含EBP的化合物共價(jià)結(jié)合所形成的蒽環(huán)型衍生物，具有識(shí)別細(xì)胞EGFR并與該受體結(jié)合的能力。其通式如下：DHAQ-HPMA-EBP。

本發(fā)明提供的腫瘤靶向性多肽-蒽環(huán)型衍生物能與細(xì)胞EGFR結(jié)合，選擇性地輸送蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤藥物到達(dá)體內(nèi)細(xì)胞EGFR高度或過(guò)度表達(dá)的靶組織，以增加病灶局部藥物濃度，提高療效和降低毒副作用，達(dá)到靶向治療的目的。

附圖說(shuō)明

圖1：多肽—阿霉素衍生物對(duì)荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。

圖2：多肽—表阿霉素衍生物對(duì)荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。

圖3：多肽—吡喃阿霉素的衍生物對(duì)荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。

圖4：多肽—去甲氧柔紅霉素衍生物對(duì)荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。

圖5：多肽—米托蒽醌衍生物對(duì)荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。

具體實(shí)施例

實(shí)施例1：N-異丁烯酰基甘氨酰甘氨酸-EBP(Ma-GG-EBP)的合成

取90mg甘氨酸(G)-甘氨酸(G)二肽溶入4mL水中，加400mg NaOH，0℃下邊攪拌邊滴加70μL甲基丙烯酰氯，反應(yīng)1h后用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0，再加2mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，-15℃下加126mg二環(huán)己基碳二酰亞胺(DCC)，攪拌反應(yīng)3h，4℃下過(guò)夜，離心，過(guò)濾除去二環(huán)己基脲晶體，真空干燥得甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酸對(duì)硝基苯酯(Ma-GG-ONp)。另取120mg EBP溶入4mL DMF中，加30mg Ma-GG-ONp和吡啶，室溫下反應(yīng)22h，用0.1N NaOH中止反應(yīng)，加去離子水透析，凍干，得產(chǎn)物甲基丙烯酰甘氨酰甘氨酰-EBP(Ma-GG-EBP)。

實(shí)施例2：DOX-HPMA-EBP的合成

取200mg甘氨酸(G)-苯丙氨酸(F)-亮氨酸(L)-甘氨酸(G)四肽溶入10mL二氯甲烷，加5mg 4-(1,1,3,3-四甲基丁基)鄰苯二酚、和32mg碳酸鈉，0℃下邊攪拌邊滴加110μL甲基丙烯酰氯，再加98mg水合肼反應(yīng)7h，用異丙烷洗脫三次去除未反應(yīng)的水合肼，加二氯甲烷/醋酸乙酯結(jié)晶，得甲基丙烯酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酰肼(Ma-GFLG-NHNH₂)，然后在室溫下加入8mL甲醇溶解，避光加157mg阿霉素(DOX)，邊攪拌邊滴加420μL醋酸，反應(yīng)30h，采用凝膠滲透色譜法純化，得產(chǎn)物甲基丙烯酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酸阿霉素(Ma-GFLG-DOX)。另取148mg HPMA、42mg Ma-GFLG-DOX、30mg Ma-GG-EBP和1mg偶氮二異丁腈，加入2mL 10％丙酮/二甲基亞砜(v/v)，通入氮?dú)猓?0℃下反應(yīng)22h，交替使用過(guò)量的丙酮和二乙醚沖洗，再加甲醇，透析，真空干燥得聚合物DOX-HPMA-EBP。

實(shí)施例3：EPI-HPMA-EBP的合成

取200mg甘氨酸(G)-苯丙氨酸(F)-亮氨酸(L)-甘氨酸(G)四肽溶入10mL二氯甲烷，加5mg 4-(1,1,3,3-四甲基丁基)鄰苯二酚、和32mg碳酸鈉，0℃下邊攪拌邊滴加110μL甲基丙烯酰氯，再加98mg水合肼反應(yīng)7h，用異丙烷洗脫三次去除未反應(yīng)的水合肼，加二氯甲烷/醋酸乙酯結(jié)晶，得甲基丙烯酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酰肼(Ma-GFLG-NHNH₂)，然后在室溫下加入8mL甲醇溶解，避光加157mg表阿霉素(EPI)，邊攪拌邊滴加420μL醋酸，反應(yīng)30h，采用凝膠滲透色譜法純化，得產(chǎn)物甲基丙烯酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酸表阿霉素(Ma-GFLG-EPI)。另取148mg HPMA、42mg Ma-GFLG-EPI、30mg Ma-GG-EBP和1mg偶氮二異丁腈，加入2mL 10％丙酮/二甲基亞砜(v/v)，通入氮?dú)猓?0℃下反應(yīng)22h，交替使用過(guò)量的丙酮和二乙醚沖洗，再加甲醇，透析，真空干燥得聚合物EPI-HPMA-EBP。

實(shí)施例4：THP-HPMA-EBP的合成

取200mg甘氨酸(G)-苯丙氨酸(F)-亮氨酸(L)-甘氨酸(G)四肽溶入10mL二氯甲烷，加5mg 4-(1,1,3,3-四甲基丁基)鄰苯二酚、和32mg碳酸鈉，0℃下邊攪拌邊滴加110μL甲基丙烯酰氯，再加98mg水合肼反應(yīng)7h，用異丙烷洗脫三次去除未反應(yīng)的水合肼，加二氯甲烷/醋酸乙酯結(jié)晶，得甲基丙烯酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酰肼(Ma-GFLG-NHNH₂)，然后在室溫下加入8mL甲醇溶解，避光加150mg吡喃阿霉素(THP)，邊攪拌邊滴加420μL醋酸，反應(yīng)30h，采用凝膠滲透色譜法純化，得產(chǎn)物甲基丙烯酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酸吡喃阿霉素(Ma-GFLG-THP)。另取148mg HPMA、42mg Ma-GFLG-THP、30mg Ma-GG-EBP和1mg偶氮二異丁腈，加入2mL 10％丙酮/二甲基亞砜(v/v)，通入氮?dú)猓?0℃下反應(yīng)22h，交替使用過(guò)量的丙酮和二乙醚沖洗，再加甲醇，透析，真空干燥得聚合物THP-HPMA-EBP。

實(shí)施例5：IDA-HPMA-EBP的合成

取200mg甘氨酸(G)-苯丙氨酸(F)-亮氨酸(L)-甘氨酸(G)四肽溶入10mL二氯甲烷，加5mg 4-(1,1,3,3-四甲基丁基)鄰苯二酚、和32mg碳酸鈉，0℃下邊攪拌邊滴加110μL甲基丙烯酰氯，再加98mg水合肼反應(yīng)7h，用異丙烷洗脫三次去除未反應(yīng)的水合肼，加二氯甲烷/醋酸乙酯結(jié)晶，得甲基丙烯酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酰肼(Ma-GFLG-NHNH₂)，然后在室溫下加入8mL甲醇溶解，避光加160mg去甲氧柔紅霉素(IDA)，邊攪拌邊滴加420μL醋酸，反應(yīng)30h，采用凝膠滲透色譜法純化，得產(chǎn)物甲基丙烯酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酸去甲氧柔紅霉素(Ma-GFLG-IDA)。另取148mg HPMA、42mg Ma-GFLG-IDA、30mg Ma-GG-EBP和1mg 2,2’-偶氮二異丁腈(AIBN)，加入2mL 10％丙酮/二甲基亞砜(v/v)，通入氮?dú)猓?0℃下反應(yīng)22h，交替使用過(guò)量的丙酮和二乙醚沖洗，再加甲醇，透析，真空干燥得聚合物IDA-HPMA-EBP。

實(shí)施例6：DHAQ-HPMA-EBP的合成

取90mg甘氨酸(G)-苯丙氨酸(F)-亮氨酸(L)-甘氨酸(G)四肽溶入4mL水中，加400mg NaOH，0℃下邊攪拌邊滴加70μL甲基丙烯酰氯，反應(yīng)1h后用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0，再加2mL DMF，-15℃下加126mg二環(huán)己基碳二酰亞胺(DCC)，攪拌反應(yīng)3h，4℃下過(guò)夜，離心，過(guò)濾除去二環(huán)己基脲晶體，真空干燥得甲基丙烯酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酸對(duì)硝基苯酯(Ma-GFLG-ONp)。再取150mg米托蒽醌(DHAQ)以適量DMF溶解，4℃下邊攪拌邊緩緩滴加至Ma-GFLG-ONp的DMF溶液，緩慢加入三乙胺，反應(yīng)液通入氮?dú)?，室溫反?yīng)4h后，4℃放置過(guò)夜，減壓除去DMF，甲醇溶解殘?jiān)?，硅膠柱色譜純化，得產(chǎn)物甲基丙烯酰甘氨酰苯丙氨酰亮氨酰甘氨酸米托蒽醌(Ma-GFLG-DHAQ)，真空干燥備用。另取148mg HPMA、42mg Ma-GFLG-DHAQ、30mg Ma-GG-EBP和1mg 2,2’-偶氮二異丁腈(AIBN)，加入2mL 10％丙酮/二甲基亞砜(v/v)，通入氮?dú)猓?0℃下反應(yīng)22h，交替使用過(guò)量的丙酮和二乙醚沖洗，再加甲醇，透析，真空干燥得聚合物DHAQ-HPMA-EBP。

實(shí)施例7：體外DOX-HPMA-EBP細(xì)胞毒性試驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EGFR高表達(dá)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453、人肺癌細(xì)胞HCC97和EGFR低表達(dá)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U13MG，胰酶消化，用含血清的培養(yǎng)液收集細(xì)胞，離心、重懸、計(jì)數(shù)。96孔培養(yǎng)板中間十列的各孔中加入200μL細(xì)胞懸液，每孔細(xì)胞數(shù)為5×10³個(gè)細(xì)胞。將200μL培養(yǎng)液加入第1列和第12列的8個(gè)孔中。第1列為不含細(xì)胞的空白對(duì)照。細(xì)胞在37℃CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后分DOX-HPMA-EBP實(shí)驗(yàn)組和DOX陽(yáng)性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組以DOX-HPMA-EBP中DOX的濃度計(jì)，用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液5倍系列稀釋?zhuān)残纬?個(gè)濃度梯度。陽(yáng)性對(duì)照用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液將DOX進(jìn)行5倍系列稀釋?zhuān)纬?個(gè)濃度，做好標(biāo)記。小心移去第2至11列各孔培養(yǎng)液。在第2列和第11列的8個(gè)孔中加入200μL不含血清的新鮮培養(yǎng)液，這些細(xì)胞作為對(duì)照。而在第3至10列各孔細(xì)胞中加入200μL含不同濃度受試物的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度至少4孔。細(xì)胞繼續(xù)在37℃、CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。加200μL新鮮培養(yǎng)液，在第1-11列所以孔中各加入20μL、5mg/mL四甲基偶氮唑鹽(MTT)。37℃孵育4小時(shí)后，棄去孔中培養(yǎng)液和MTT，在第1-11列所有孔中各加入100μL二甲基亞砜(DMSO)。酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值(檢測(cè)波長(zhǎng)570nm)。第2列和第11列各孔中得出的平均吸光值作為對(duì)照吸光值，對(duì)照組吸光值減少一半時(shí)的藥物濃度為半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)。本發(fā)明以IC₅₀來(lái)判斷各受試物的對(duì)不同EGFR表達(dá)水平的人癌細(xì)胞殺傷敏感性，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示的結(jié)果見(jiàn)下表：

表1：DOX-HPMA-EBP及DOX的體外細(xì)胞毒性(IC₅₀)(單位：μM)

從上表可見(jiàn)，DOX-HPMA-EBP的細(xì)胞毒性在EGFR高表達(dá)細(xì)胞(MDA-MB-453和HCC97)中較DOX高(IC₅₀值低)，而在EGFR低表達(dá)的U13MG細(xì)胞中，DOX-HPMA-EBP的細(xì)胞毒性比DOX低(IC₅₀值高)。

實(shí)施例8：體外EPI-HPMA-EBP細(xì)胞毒性研究

取MDA-MB-453細(xì)胞、HCC97細(xì)胞和U13MG細(xì)胞胰酶消化，用含血清的培養(yǎng)液收集細(xì)胞，離心、重懸、計(jì)數(shù)。96孔培養(yǎng)板中間十列的各孔中加入200μL細(xì)胞懸液，每孔細(xì)胞數(shù)為5×10³個(gè)細(xì)胞。將200μL培養(yǎng)液加入第1列和第12列的8個(gè)孔中。第1列為不含細(xì)胞的空白對(duì)照。細(xì)胞在37℃CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后分EPI-HPMA-EBP實(shí)驗(yàn)組和EPI陽(yáng)性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組以EPI-HPMA-EBP中EPI的濃度計(jì)，也用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液5倍系列稀釋?zhuān)残纬?個(gè)濃度梯度。陽(yáng)性對(duì)照用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液將EPI進(jìn)行5倍系列稀釋?zhuān)纬?個(gè)濃度，做好標(biāo)記。小心移去第2至11列各孔培養(yǎng)液。在第2列和第11列的8個(gè)孔中加入200μL不含血清的新鮮培養(yǎng)液，這些細(xì)胞作為對(duì)照。而在第3至10列各孔細(xì)胞中加入200μL含不同濃度受試物的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度至少4孔。細(xì)胞繼續(xù)在37℃、CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。加200μL新鮮培養(yǎng)液，在第1-11列所以孔中各加入20μL、5mg/mL MTT。37℃孵育4小時(shí)后，棄去孔中培養(yǎng)液和MTT，在第1-11列所有孔中各加入100μL DMSO。酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值(檢測(cè)波長(zhǎng)570nm)。第2列和第11列各孔中得出的平均吸光值作為對(duì)照吸光值，對(duì)照組吸光值減少一半時(shí)的藥物濃度為半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)。本發(fā)明以IC₅₀來(lái)判斷各受試物的對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示的結(jié)果見(jiàn)下表：

表2：EPI-HPMA-EBP及EPI的體外細(xì)胞毒性(IC₅₀)(單位：μM)

EPI在高、低不同EGFR表達(dá)的細(xì)胞中的毒性無(wú)明顯差異。與EPI不同，在EGFR高表達(dá)細(xì)胞(MDA-MB-453和HCC97)中，EPI-HPMA-EBP的毒性比EPI高(IC₅₀值低)，在EGFR低表達(dá)的U13MG細(xì)胞中，EPI-HPMA-EBP的細(xì)胞毒性比EPI低(IC₅₀值高)。

實(shí)施例9：體外THP-HPMA-EBP細(xì)胞毒性研究

取MDA-MB-453、HCC97和U13MG細(xì)胞胰酶消化，用含血清的培養(yǎng)液收集細(xì)胞，離心、重懸、計(jì)數(shù)。96孔培養(yǎng)板中間十列的各孔中加入200μL細(xì)胞懸液，每孔細(xì)胞數(shù)為5×10³個(gè)細(xì)胞。將200μL培養(yǎng)液加入第1列和第12列的8個(gè)孔中。第1列為不含細(xì)胞的空白對(duì)照。細(xì)胞在37℃、CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后分THP-HPMA-EBP實(shí)驗(yàn)組和THP陽(yáng)性對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組以THP-HPMA-EBP中THP的濃度計(jì)，也用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液5倍系列稀釋?zhuān)残纬?個(gè)濃度梯度。陽(yáng)性對(duì)照用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液將THP進(jìn)行5倍系列稀釋?zhuān)纬?個(gè)濃度，做好標(biāo)記。小心移去第2至11列各孔培養(yǎng)液。在第2列和第11列的8個(gè)孔中加入200μL不含血清的新鮮培養(yǎng)液，這些細(xì)胞作為對(duì)照。而在第3至10列各孔細(xì)胞中加入200μL含不同濃度受試物的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度至少4孔。細(xì)胞繼續(xù)在37℃CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。加200μL新鮮培養(yǎng)液，在第1-11列所以孔中各加入20μL、5mg/mL MTT。37℃孵育4小時(shí)后，棄去孔中培養(yǎng)液和MTT，在第1-11列所有孔中各加入100μL DMSO。酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值(檢測(cè)波長(zhǎng)570nm)。第2列和第11列各孔中得出的平均吸光值作為對(duì)照吸光值，對(duì)照組吸光值減少一半時(shí)的藥物濃度為半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)。

在體外培養(yǎng)的高、低不同EGFR表達(dá)的人癌細(xì)胞系中加入THP-HPMA-EBP作用48小時(shí)，采用MTT還原法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)，并與THP組比較，以判斷受試物對(duì)不同EGFR表達(dá)水平的細(xì)胞殺傷敏感性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示的結(jié)果見(jiàn)下表：

表3：THP-HPMA-EBP和THP的體外細(xì)胞毒性(IC₅₀)(單位：μM)

THP在高、低不同EGFR表達(dá)的細(xì)胞中的毒性無(wú)明顯差異，而THP-HPMA-EBP在EGFR高表達(dá)細(xì)胞(MDA-MB-453和HCC97)中的毒性比THP高(IC₅₀值低)，但在EGFR低表達(dá)的U13MG細(xì)胞中，THP-HPMA-EBP的細(xì)胞毒性比THP低(IC₅₀值高)。

實(shí)施例10：體外IDA-HPMA-EBP細(xì)胞毒性研究

96孔培養(yǎng)板孔中，按每孔5×10³個(gè)細(xì)胞數(shù)分別加入MDA-MB-453、HCC97或U13MG細(xì)胞，分IDA-HPMA-EBP實(shí)驗(yàn)組和IDA對(duì)照組。在培養(yǎng)板的第3至10列各孔細(xì)胞中加入不同濃度的IDA-HPMA-EBP或IDA(以其中所含IDA的濃度計(jì))，每濃度至少4孔。細(xì)胞繼續(xù)在37℃、CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。加20μL、5mg/mL MTT。37℃孵育4小時(shí)，再加100μL DMSO，然后，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值。計(jì)算各組半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，其結(jié)果見(jiàn)下表：

表4：IDA-HPMA-EBP和IDA的體外細(xì)胞毒性(IC₅₀)(單位：μM)

由上表可知，IDA-HPMA-EBP在EGFR高表達(dá)細(xì)胞(MDA-MB-453和HCC97)中的毒性比IDA高(IC₅₀值低)，而在EGFR低表達(dá)的U13MG細(xì)胞中，IDA-HPMA-EBP的細(xì)胞毒性比IDA低(IC₅₀值高)，說(shuō)明IDA-HPMA-EBP的細(xì)胞毒性與細(xì)胞EGFR的表達(dá)水平有關(guān)。但是，IDA在高、低不同EGFR表達(dá)的細(xì)胞中的毒性無(wú)明顯差異，提示IDA的細(xì)胞毒性與細(xì)胞EGFR的表達(dá)水平無(wú)關(guān)。

實(shí)施例11：體外DHAQ-HPMA-EBP細(xì)胞毒性研究

96孔培養(yǎng)板孔中，按每孔5×10³個(gè)細(xì)胞數(shù)分別加入MDA-MB-453、HCC97或U13MG細(xì)胞，24小時(shí)后分DHAQ-HPMA-EBP實(shí)驗(yàn)組和DHAQ陽(yáng)性對(duì)照組，按不同濃度配制DHAQ-HPMA-EBP和DHAQ(以其中所含DHAQ濃度計(jì))為受試物。在第2列和第11列的8個(gè)孔中加入不含血清的新鮮培養(yǎng)液為對(duì)照。而在第3至10列各孔細(xì)胞中加入不同濃度受試物，每濃度至少4孔。細(xì)胞繼續(xù)在37℃、CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。加20μL、5mg/mL MTT。37℃孵育4小時(shí)，再加100μL DMSO，然后，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值。計(jì)算各組半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，其結(jié)果見(jiàn)下表：

表5：DHAQ-HPMA-EBP和DHAQ的體外細(xì)胞毒性(IC₅₀)(單位：μM)

結(jié)果顯示，DHAQ-HPMA-EBP在EGFR高表達(dá)細(xì)胞(MDA-MB-453和HCC97)中的毒性比DHAQ高(IC₅₀值低)，而在EGFR低表達(dá)的U13MG細(xì)胞中，DHAQ-HPMA-EBP的細(xì)胞毒性比DHAQ低(IC₅₀值高)，表示DHAQ-HPMA-EBP的細(xì)胞毒性與細(xì)胞EGFR的表達(dá)水平有關(guān)。但是，DHAQ在高、低不同EGFR表達(dá)的細(xì)胞中的毒性無(wú)明顯差異，表明DHAQ的細(xì)胞毒性與細(xì)胞EGFR的表達(dá)水平無(wú)關(guān)。

實(shí)施例12：動(dòng)物體內(nèi)DOX-HPMA-EBP抗腫瘤活性研究

取鼠肝癌H22細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1.5×10⁷個(gè)/mL，將0.2mL細(xì)胞懸液接種至BALB/c小鼠(體重18～22g)后肢皮下，2周后選擇腫瘤生長(zhǎng)良好且無(wú)壞死的動(dòng)物，頸椎脫臼處死，無(wú)菌條件下取出實(shí)體瘤，切成直徑約2mm大小的瘤塊，用穿刺針移植至鼠后肢外側(cè)皮下。腫瘤移植后1周，選擇腫癌生長(zhǎng)良好的小鼠為移植瘤動(dòng)物模型，隨機(jī)分為DOX-HPMA-EBP實(shí)驗(yàn)組、DOX陽(yáng)性對(duì)照組和生理鹽水溶媒陰性對(duì)照組。分別在腫瘤移植后的第7、14和21天，經(jīng)靜脈注射給藥。實(shí)驗(yàn)組給藥劑量按DOX-HPMA-EBP中的DOX含量為15mg/kg，陽(yáng)性對(duì)照組給1mg/kg DOX。實(shí)驗(yàn)期間每天記錄動(dòng)物的存活情況，每周測(cè)量瘤體的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)2～3次，根據(jù)公式：V＝(a×b²)/2計(jì)算腫瘤體積變化等。各組動(dòng)物腫瘤移植后1周(第1次給藥時(shí))的初治腫瘤體積，至腫瘤移植后5周(第35天)實(shí)驗(yàn)?zāi)┠[瘤體積的觀察結(jié)果見(jiàn)圖1。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組和DOX陽(yáng)性對(duì)照組小鼠，在H22肝癌細(xì)胞移植后4周開(kāi)始，陸續(xù)出現(xiàn)死亡，到第5周，近半數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡。而此時(shí)，DOX-HPMA-EBP實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物0死亡。DOX組腫瘤瘤體體積的變化情況，癌移植1周(第7天)首次治療時(shí)檢測(cè)的腫瘤體積平均為208±60mm³，5周(第35天)后的腫瘤體積增加到907±72mm³，但與生理鹽水組的腫塊大小(1630±120mm³)相比，腫塊體積縮小。DOX-HPMA-EBP實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物初次治療時(shí)(第7天)的腫瘤體積平均為234±56mm³，經(jīng)過(guò)3次治療后，從第21天開(kāi)始，腫瘤體積明顯縮小。到第35天時(shí)，腫瘤大小為583±47mm³，與生理鹽水組的腫塊大小(1630±120mm³)相比，腫塊體積縮小差異顯著。

實(shí)施例13：動(dòng)物體內(nèi)EPI-HPMA-EBP抗腫瘤活性研究

用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整鼠肝癌H22細(xì)胞數(shù)為1.5×10⁷個(gè)/mL，取0.2mL細(xì)胞懸液接種至BALB/c小鼠(體重18～22g)皮下，2周后處死動(dòng)物取出實(shí)體瘤切成小瘤塊，用穿刺針將腫瘤移植至動(dòng)物后肢皮下。1周后選擇腫癌生長(zhǎng)良好的為移植瘤動(dòng)物模型，隨機(jī)分EPI-HPMA-EBP實(shí)驗(yàn)組、EPI陽(yáng)性對(duì)照組和生理鹽水陰性對(duì)照組。分別在腫瘤移植后的第7、14和21天，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物以其中EPI含量按15mg/kg的劑量靜脈注射給藥，而EPI對(duì)照組按1mg/kg劑量靜脈注射。實(shí)驗(yàn)期間每天記錄動(dòng)物的存活情況，每周測(cè)量瘤體的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)2～3次，根據(jù)公式：V＝(a×b²)/2計(jì)算腫瘤體積變化等。各組動(dòng)物腫瘤移植后1周(第1次給藥時(shí))的初治腫瘤體積，至腫瘤移植后5周(第35天)實(shí)驗(yàn)?zāi)┠[瘤體積的觀察結(jié)果見(jiàn)圖2。

結(jié)果顯示，EPI組動(dòng)物在腫瘤移植1周(第7天)首次治療時(shí)，檢測(cè)的腫瘤體積平均為212±56mm³，5周(第35天)后的腫瘤體積增加到715±89mm³，與生理鹽水組的腫塊大小(1630±120mm³)相比，腫塊體積縮小。EPI-HPMA-EBP實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物初次治療時(shí)(第7天)的腫瘤體積平均為192±75mm³，到第35天時(shí)，腫瘤大小為150±40mm³，與生理鹽水組的腫塊大小(1630±120mm³)相比，腫塊體積明顯縮小。

實(shí)施例14：動(dòng)物體內(nèi)THP-HPMA-EBP抗腫瘤活性研究

取鼠肝癌H22細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1.5×10⁷個(gè)/mL，將0.2mL細(xì)胞懸液接種至BALB/c小鼠(體重18～22g)后肢皮下，2周后選擇腫瘤生長(zhǎng)良好且無(wú)壞死的動(dòng)物，頸椎脫臼處死，無(wú)菌條件下取出實(shí)體瘤，切成直徑約2mm大小的瘤塊，用穿刺針移植至鼠后肢外側(cè)皮下。腫瘤移植后1周，選擇腫癌生長(zhǎng)良好的小鼠為移植瘤動(dòng)物模型，隨機(jī)分為T(mén)HP-HPMA-EBP實(shí)驗(yàn)組、THP陽(yáng)性對(duì)照組和生理鹽水陰性對(duì)照組。分別在腫瘤移植后的第1、7和14天，經(jīng)靜脈注射給藥。實(shí)驗(yàn)組以THP-HPMA-EBP中的THP含量按15mg/kg的劑量靜脈給藥，THP對(duì)照組按1mg/kg的劑量靜脈給藥。實(shí)驗(yàn)期間每天記錄動(dòng)物的存活情況，每周測(cè)量瘤體的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)2～3次，根據(jù)公式：V＝(a×b²)/2計(jì)算腫瘤體積變化等。各組動(dòng)物腫瘤移植后1周(第1次給藥時(shí))的初治腫瘤體積，至腫瘤移植后5周(第35天)實(shí)驗(yàn)?zāi)┠[瘤體積的觀察結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3所示，THP組動(dòng)物在腫瘤移植后第7天的腫瘤體積平均為160±60mm³，35天后的腫瘤體積平均為1057±78mm³，與生理鹽水組相比，腫塊體積縮小。THP-HPMA-EBP實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物初次治療時(shí)(第7天)的腫瘤體積平均為198±62mm³，到第35天時(shí)，腫瘤大小為166±70mm³，與生理鹽水組的腫塊大小相比，腫塊體積明顯縮小。

實(shí)施例15：動(dòng)物體內(nèi)IDA-HPMA-EBP抗腫瘤活性研究

取鼠肝癌H22細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1.5×10⁷個(gè)/mL，將0.2mL細(xì)胞懸液接種至BALB/c小鼠(體重18～22g)后肢皮下，2周后選擇腫瘤生長(zhǎng)良好且無(wú)壞死的動(dòng)物，頸椎脫臼處死，無(wú)菌條件下取出實(shí)體瘤，切成直徑約2mm大小的瘤塊，用穿刺針移植至鼠后肢外側(cè)皮下。腫瘤移植后1周，選擇腫癌生長(zhǎng)良好的小鼠為移植瘤動(dòng)物模型，隨機(jī)分為IDA-HPMA-EBP實(shí)驗(yàn)組、IDA陽(yáng)性對(duì)照組和生理鹽水陰性對(duì)照組。分別在腫瘤移植后的第1、7和14天，經(jīng)靜脈注射給藥。實(shí)驗(yàn)組給藥劑量按IDA-HPMA-EBP中的IDA含量為15mg/kg，陽(yáng)性對(duì)照組給1mg/kg的IDA。實(shí)驗(yàn)期間每天記錄動(dòng)物的存活情況，每周測(cè)量瘤體的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)2～3次，根據(jù)公式：V＝(a×b²)/2計(jì)算腫瘤體積變化等。各組動(dòng)物腫瘤移植后1周(第1次給藥時(shí))的初治腫瘤體積，至腫瘤移植后5周(第35天)實(shí)驗(yàn)?zāi)┠[瘤體積的觀察結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，IDA組動(dòng)物初治腫瘤體積平均為292±57mm³，實(shí)驗(yàn)?zāi)┠[瘤體積為1157±78mm³，與生理鹽水組相比，腫塊體積縮小。IDA-HPMA-EBP組初治腫瘤體積為282±22mm³，實(shí)驗(yàn)?zāi)┠[瘤大小為173±65mm³，與生理鹽水組相比，腫塊體積明顯縮小。

實(shí)施例16：動(dòng)物體內(nèi)DHAQ-HPMA-EBP抗腫瘤活性研究

取鼠肝癌H22細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1.5×10⁷個(gè)/mL，將0.2mL細(xì)胞懸液接種至BALB/c小鼠(體重18～22g)后肢皮下，2周后選擇腫瘤生長(zhǎng)良好且無(wú)壞死的動(dòng)物，頸椎脫臼處死，無(wú)菌條件下取出實(shí)體瘤，切成直徑約2mm大小的瘤塊，用穿刺針移植至鼠后肢外側(cè)皮下。腫瘤移植后1周，選擇腫癌生長(zhǎng)良好的小鼠為移植瘤動(dòng)物模型，隨機(jī)分為DHAQ-HPMA-EBP實(shí)驗(yàn)組、DHAQ陽(yáng)性對(duì)照組和生理鹽水陰性對(duì)照組。分別在腫瘤移植后的第1、7和14天，經(jīng)靜脈注射給藥。DHAQ-HPMA-EBP組給藥劑量為15mg/kg，DHAQ組給1mg/kg的DHAQ。實(shí)驗(yàn)期間每天記錄動(dòng)物的存活情況，每周測(cè)量瘤體的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)2～3次，根據(jù)公式：V＝(a×b²)/2計(jì)算腫瘤體積變化等。各組動(dòng)物腫瘤移植后1周(第1次給藥時(shí))的初治腫瘤體積，至腫瘤移植后5周(第35天)實(shí)驗(yàn)?zāi)┠[瘤體積的觀察結(jié)果見(jiàn)圖5。

從圖5所知，DHAQ組動(dòng)物首次治療時(shí)，腫瘤大小為215±61mm³，實(shí)驗(yàn)?zāi)┠[瘤大小為1053±117mm³，與生理鹽水組相比，腫塊體積縮小。DHAQ-HPMA-EBP組動(dòng)物初次治療時(shí)腫瘤體積平均為186±50mm³，第35天時(shí)的腫瘤大小為183±85mm³，與生理鹽水組相比，腫塊體積明顯縮小。