陽離子雙親性膜靶向α-螺旋多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明具體涉及一種陽離子雙親性膜靶向α -螺旋多肽的序列設(shè)計(jì)及其在細(xì)胞 不蹤、癌癥治療等方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物質(zhì)膜含有磷脂成分，因此具備了疏水的特性；相關(guān)研究表明癌細(xì)胞比正常細(xì) 胞的表面電位低，呈現(xiàn)更強(qiáng)的負(fù)電性；線粒體和細(xì)胞核，也維持著很強(qiáng)的內(nèi)部負(fù)電位，因而 是陽離子多肽理想的選擇性作用靶標(biāo)。多肽分子具有很好的生物相容性，多功能性及結(jié)構(gòu) 設(shè)計(jì)多樣性高的優(yōu)點(diǎn)而引起了研究者們的興趣。陽離子雙親性多肽在癌癥治療領(lǐng)域的研 究也越來越多，比如爪蛙蟾素，蜂毒肽。但此類多肽多需由生物體中提取，其操作復(fù)雜，產(chǎn)量 低，難以進(jìn)行規(guī)?；瘧?yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種陽離子雙親性膜靶向α -螺 旋多肽及其應(yīng)用。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案： 一種陽離子雙親性膜靶向α-螺旋多肽，包含如下所示氨基酸序列JX1X2X3X 1X2X3X1]η-ΝΗ2，其中NH2分布于所述多肽的C端，X1為帶正電荷的極性氨基酸，Χ 2、Χ3為非極性疏水性 氨基酸，并且Xp X2、X3均為L型氨基酸，η為正整數(shù)。
[0005] 進(jìn)一步的，在遇到生物質(zhì)膜時(shí)，所述多肽能夠形成α -螺旋構(gòu)象。
[0006] 進(jìn)一步的，所述多肽具有SEQ ID No. 1~SEQ ID No. 6中任一者所示氨基酸序列。
[0007] 如前任一項(xiàng)所述的陽離子雙親性膜靶向α-螺旋多肽在制備癌細(xì)胞檢測試劑、抗 癌藥物或抗癌藥物前體、細(xì)胞內(nèi)示蹤試劑或細(xì)胞毒性試劑中的應(yīng)用。
[0008] 以下進(jìn)一步說明本發(fā)明的多肽的特點(diǎn)，其包括： 1)本發(fā)明的一系列陽離子雙親性膜靶向α -螺旋多肽易于與癌細(xì)胞發(fā)生作用，多肽遇 到生物質(zhì)膜能夠形成α -螺旋構(gòu)象，能夠增強(qiáng)與癌細(xì)胞的作用。
[0009] 2)本發(fā)明的多肽具有抗癌活性，不同類型的疏水氨基酸（L，I，F(xiàn)，A等）的膜作用效 果有明顯不同，氨基酸序列親疏水性的調(diào)節(jié)導(dǎo)致多肽在細(xì)胞水平定位的差異。多肽可定位 于細(xì)胞膜等細(xì)胞內(nèi)的生物膜結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞器，比如線粒體、溶酶體等，但并不局限 于上述結(jié)構(gòu)。
[0010] 3)本發(fā)明的多肽的細(xì)胞毒性與多肽的關(guān)鍵成膠束濃度（CMC)具有高度相關(guān)性，當(dāng) 低于此濃度時(shí)細(xì)胞存活率不受影響而定位于溶酶體中，當(dāng)高于此濃度時(shí)多肽可以自組裝成 微膠束與細(xì)胞膜作用而產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性。
[0011] 4)本發(fā)明的多肽序列N端含有一個組氨酸，能夠與環(huán)金屬銥配位化合物，例如， 分子式為（LCTN)2Ir (Ls0Iv)2M _發(fā)生配位反應(yīng)，使得多肽具備綠色熒光，便于進(jìn)行胞內(nèi)示 足示。
[0012] 概言之，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括：提供了一系列陽離子雙親性膜靶向 α -螺旋多肽，其具有抗癌活性，不同類型的疏水氨基酸（L，I，F(xiàn)，A等）的膜作用效果有明顯 不同，且在高于關(guān)鍵成膠束濃度時(shí)可以自組裝成微膠束產(chǎn)生猛烈地細(xì)胞殺傷作用，為抗癌 藥物的開發(fā)提供了新的依據(jù)。
【附圖說明】
[0013] 圖1是本發(fā)明多肽殺傷細(xì)胞的作用機(jī)理示意圖； 圖2A和2B是實(shí)施例1-2中陽離子雙親性膜靶向α -螺旋多肽關(guān)鍵成膠束濃度變化曲 線圖，其中圖2Α是多肽序列2的關(guān)鍵成膠束濃度（CMC)變化曲線圖，圖2Β是多肽序列5的 關(guān)鍵成膠束濃度變化曲線圖； 圖3A和3B是實(shí)施例1中環(huán)金屬銥配位化合物標(biāo)記多肽序列2后，在關(guān)鍵成膠束濃度 上下多肽的細(xì)胞內(nèi)定位圖，圖3A是在低于此濃度時(shí)多肽聚集于溶酶體的激光共聚焦圖，圖 3B是高于此濃度時(shí)多肽透過于細(xì)胞膜進(jìn)入胞漿中導(dǎo)致細(xì)胞死亡的激光共聚焦圖。
[0014] 圖4A和4B是實(shí)施例2中環(huán)金屬銥配位化合物標(biāo)記多肽序列5后，在關(guān)鍵成膠束 濃度上、下多肽的細(xì)胞內(nèi)定位圖，圖4A是在低于此濃度時(shí)多肽聚集于溶酶體的激光共聚焦 圖，圖4B是高于此濃度時(shí)多肽作用于細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞打孔死亡的激光共聚焦圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 本發(fā)明的一個方面提供了一系列陽離子雙親性膜靶向α-螺旋多肽，其具有抗癌 活性，不同類型的疏水氨基酸（L，I，F(xiàn)，A等）的膜作用效果有明顯不同，氨基酸序列親疏水 性的調(diào)節(jié)導(dǎo)致多肽在細(xì)胞水平定位的差異。多肽的細(xì)胞毒性與關(guān)鍵成膠束濃度（CMC)存在 高度相關(guān)性，當(dāng)?shù)陀诖藵舛葧r(shí)細(xì)胞存活率不受影響而定位于溶酶體中，當(dāng)高于此濃度時(shí)多 肽可以自組裝成微膠束與細(xì)胞作用而產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性，為抗癌活性多肽的設(shè)計(jì)合成提 供了新的參考。
[0016] 參閱圖1所示系本發(fā)明的多肽殺傷細(xì)胞的作用機(jī)理示意圖。
[0017] 更為具體的，本發(fā)明的陽離子雙親性膜靶向α-螺旋多肽包含如下所示氨基酸序 列：[X1X2X3X1X2X 3X1L-NH2，其中NH2分布于所述多肽的C端(亦可理解為，NH 2表示C端氨基 化)，X1為相同的帶正電荷的極性氨基酸，X2、X3為相同或不相同的非極性疏水性氨基酸，并 且Xi、X2、X3均為L型氨基酸，η為正整數(shù)。
[0018] 在一具體實(shí)施方案之中，所述帶正電荷的極性氨基酸可采用Lys或Arg。
[0019] 進(jìn)一步的，所述多肽遇到生物質(zhì)膜能夠形成α -螺旋構(gòu)象。
[0020] 作為較為典型的實(shí)施案例，所述多肽可具有SEQ ID No. 1~SEQ ID No. 6中任一 者所示氨基酸序列，即： 序列 I :hgg-(Klaklak)2-NH2序列 2 :hgg-(Rlarlar)2-Nh2序列 3 :hgg-(Kiikiik)2-NH2序列 4 :hgg-(Kllkllk)2-Nh2序列 5 :hgg-(Rllrllr)2-Nh2序列 6 :HGG-(KLLKLLK) 3-NH2。
[0021] 進(jìn)一步的，所述多肽的細(xì)胞毒性隨η的增大而增強(qiáng)。
[0022] 進(jìn)一步的，當(dāng)所述多肽的濃度低于關(guān)鍵成膠束濃度時(shí)，細(xì)胞存活率不受影響而定 位于溶酶體中，而當(dāng)所述多肽的濃度高于關(guān)鍵成膠束濃度時(shí)，所述多肽自組裝形成微膠束 并與細(xì)胞膜作用而產(chǎn)生強(qiáng)烈細(xì)胞毒性。
[0023] 本發(fā)明的另一方面提出了前述陽離子雙親性膜靶向α-螺旋多肽在制備癌細(xì)胞 檢測試劑、抗癌藥物或抗癌藥物前體、細(xì)胞內(nèi)示蹤試劑或細(xì)胞毒性試劑中的應(yīng)用。
[0024] 進(jìn)一步的，本發(fā)明的多肽的氨基酸序列親疏水性的調(diào)節(jié)導(dǎo)致多肽在細(xì)胞水平定位 的差異，例如，可定位于細(xì)胞膜等細(xì)胞內(nèi)的生物膜結(jié)構(gòu)及細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞器，比如線粒體、 溶酶體等，但并不局限于上述結(jié)構(gòu)。
[0025] 進(jìn)一步的，多肽的細(xì)胞毒性與多肽的關(guān)鍵成膠束濃度（CMC)具有高度相關(guān)性，當(dāng)?shù)?于此濃度時(shí)細(xì)胞存活率不受影響而定位于溶酶體中，當(dāng)高于此濃度時(shí)多肽可以自組裝成微 膠束與細(xì)胞膜作用而產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性。
[0026] 作為較為優(yōu)選的實(shí)施方案之一，所述多肽序列N端含有一個組氨酸，能夠與環(huán)金 屬銥配位化合物（LCTN)2Ir (Ls0Iv)2 M _發(fā)生配位反應(yīng)，使得多肽具備綠色熒光，便于進(jìn)行 胞內(nèi)示蹤，為抗癌藥物的開發(fā)提供了新的依據(jù)。
[0027] 例如，作為典型實(shí)施方案之一，本發(fā)明提供了一種胞內(nèi)示蹤試劑，其主要由前述陽 離子雙親性膜靶向α-螺旋多肽通過N端的一個以上組氨酸與環(huán)金屬銥配位化合物通過配 位反應(yīng)而形成，并具備綠色熒光，所述環(huán)金屬配合物的結(jié)構(gòu)式如下：
其中，I^n為C~N二齒配體，Lstjlv為溶劑分子，M _包括三氟甲基磺酸根、六氟磷酸根或 四氟硼酸根，所述C~N二齒配體包括2-苯基吡啶，1-苯基異喹啉，2-苯基苯并噻吩，苯并喹 啉，4-甲基苯基吡啶，4, 6-二氟苯基吡啶，2-(苯并噻吩）批啶，2-苯基喹啉或2, 5-二苯基 惡唑，且均不限于此。
[0028] 作為更為典型的實(shí)施案例之一，所述環(huán)金屬配合物的分子式為[(Ppy)2Ir(H 2O)2] (OTf)。
[0029] 以下結(jié)合若干較佳實(shí)施例及附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明。
[0030] 實(shí)施例1 當(dāng)X1SArg, X2SLeu, X3SAla時(shí)，多肽序列（SEQ ID No.2,亦可簡稱序列2)如下： HGG-(RLARLAR)2-NH2t5
[0031] 1.多肽的關(guān)鍵成膠束濃度實(shí)驗(yàn) 多肽的關(guān)鍵成膠束濃度實(shí)驗(yàn)中，多肽采用Milli Q水稀