一種菲律賓蛤仔抗氧化肽及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種菲律賓蛤仔抗氧化肽極其制備方法，屬于食品生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 在正常的代謝途徑下，機體內自由基的產生和消除處于一個動態(tài)的平衡狀態(tài)，但 是隨著年齡的增長或者當機體處在不良的環(huán)境下時，機體內的自由基平衡會被打破，平衡 一旦被打破，無法被人體消除的多余自由基就會滯留在機體內。過多的自由基會引起機體 的衰老，甚至導致多種疾病的出現。
[0003] 自由基清除劑也被稱為抗氧化劑，它能夠起到清除自由基的效果，減輕或者消除 自由基對機體的損傷。合成抗氧化劑如食子酸丙酯等經過證實對人體有毒害作用和致癌作 用。因此，從天然的動植物資源中尋找安全、高效的天然抗氧化劑必然能夠受到人們越來越 多的重視，也必然能夠成為現代醫(yī)藥和保健行業(yè)發(fā)展的新趨勢。
[0004] 抗氧化肽類是指具有一定抗氧化活性的多肽物質，分子結構介于氨基酸和蛋白質 之間，一般分子量小于6000道爾頓。近年來，通過蛋白酶酶解動植物蛋白來提取制備抗氧 化肽已經成為國內外研宄的熱點。發(fā)明申請專利（申請?zhí)?01110128241.0)公開了一種鯊魚 皮膠原蛋白制備的抗氧化多肽，氨基酸序列為Gly-Ala-Ile-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Arg-A la，其分子量為866Da，該抗氧化產品消除了天然抗氧化劑所具有的缺陷并且消除了公眾對 人工合成抗氧化劑的憂慮。發(fā)明申請專利（申請?zhí)?01210558061. 0)公開了一種金槍魚碎 肉蛋白抗氧化肽及其制備方法和用途，該抗氧化肽的氨基酸序列為Tyr-Glu-Asn-Gly-Gly， 制得的抗氧化肽具有安全無毒副作用、抗氧化活性強和易于消化吸收等優(yōu)點。
[0005] 菲律賓蛤仔（沿ZtZiiape1S 是一種高蛋白、低脂肪的經濟類水產 品。但我國現階段對菲律賓蛤仔的加工主要以傳統(tǒng)的產品為主，產品附加值低，這嚴重制約 了菲律賓蛤仔加工產品的市場發(fā)展。因此利用菲律賓蛤仔的資源優(yōu)勢，制備出具有較高抗 氧化活性的活性肽，解決菲律賓蛤仔加工產品附加值低的問題，是菲律賓蛤仔蛋白資源綜 合利用的重要環(huán)節(jié)。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明目的在于提供一種具有很強抗氧化活性的菲律賓蛤仔抗氧化肽及其制備 方法，該抗氧化肽的氨基酸序列為Leu-Phe-Lys-Lys-Asn-Leu-Leu-Thr-Leu，具體技術方案 如下。
[0007] -種菲律賓蛤仔抗氧化肽的制備方法，包括如下步驟： (1) 抗氧化肽的酶解制備：將活菲律賓蛤仔用清水清洗后，去殼取肉，打漿。按料 液比1 : 3~1 : 7加入pH值為7. 5、濃度為0.01m〇l/L的磷酸鹽緩沖溶液，加入胰蛋白 酶5400~6600U/g于45~55°C下酶解3~4h，于95~100°C下滅酶5min，將得到的酶解液在 8000rpm下離心10min，得到的上清液即為菲律賓蛤仔酶解液； (2) 抗氧化肽的分離純化：采用Sephadex G-25凝膠層析分離純化酶解液，以純水為洗 脫劑，在280nm下檢測，檢測得到各組分的抗氧化活性，收集活性最高的組分，冷凍干燥后 用去離子水配成溶液，進一步用Sephadex G-15凝膠層析分離，以純水為洗脫劑，在280nm 下檢測，檢測各組分的抗氧化活性，收集活性最高的組分；將活性最高的組分經制備型液相 色譜分離，液相色譜的色譜條件為：Kromasil C18-5色譜柱（4· 6X 150mm，10 μπι)，流動相 A :去離子水(含0. 1%三氟乙酸)，流動相B :乙腈(含0. 1%三氟乙酸)，梯度設置：起始梯度 Α95%-Β5%，終止梯度Α60%-Β40%，流速12mL/min，分離時間50min。檢測波長214nm，分l~3mL 進樣，收集各組分并檢測各組分的抗氧化活性，收集活性最高的組分，冷凍干燥24h，放置備 用。
[0008] (3)抗氧化肽反向色譜-Triple TOF分析及檢索：將凍干的多肽樣品重新溶解于 納升反向色譜流動相A中。在線Nano-RPLC液相色譜在Eksigent nanoLC-Ultra? 2D系統(tǒng) 進行，溶解后的樣品以2 μ L/min的流速上樣到C18預柱上（100 μ mX 3cm，C18, 3 μ m，150A)， 然后保持流速沖洗脫鹽l〇min。分析柱是C18反相色譜柱（75μπι X 15 cm C18- 3μπι 120 Α)，實驗所用梯度為90min內流動相B由5%升高至35%。質譜采用Triple TOF 5600系統(tǒng) 結合納升噴霧ΠI離子源，噴霧電壓為2. 5 kV，氣簾氣壓為30PSI，霧化氣壓為5PSI，加熱器 溫度為150°C，質譜掃描方式為信息依賴的采集工作模式下（IDA，Information Dependent Analysis)，一級TOF-MS單張圖譜掃描時間為250ms，每次IDA循環(huán)下最多采集35個電荷 為2+到5+且單秒計數大于150的二級圖譜，每次循環(huán)時間固定為2. 5秒，碰撞室能量設定 適用于所有前體離子碰撞誘導解離（CID)，動態(tài)排除設置為18秒，約等于色譜半峰寬。數 據處理采用Mascot 2. 3軟件進行，數據庫為菲律賓蛤仔數據庫，酶為胰蛋白酶，允許最大 漏切位點為2 ;固定修飾為：Carbamidomethyl (C);可變修飾為：Acetyl (Protein-term)、 Deamidated (NQ)、Dioxidation (W)、0xidation (M)、Phospho (ST)和 Phospho (Y);MS 容 差為 ± 15ppm，MSMS 容差為 ±0. 15Da，Protein score C. I. % 大于 95% 為鑒定成功。
[0009] 納升反向色譜流動相A :0. 1%甲酸，2%乙腈，納升反向色譜流動相B :0. 1%甲酸， 98%乙臆。
[0010] 菲律賓蛤仔數據庫檢索結果得到抗氧化肽的氨基酸序列為：Leu-Phe-Lys-Lys-As n-Leu-Leu-Thr-Leu，分子量為 1089. 39Da。
[0011] 在本發(fā)明中采用超氧陰離子自由基清除率作為抗氧化活性的檢測方法。取2 mL濃 度為I. 6mg/mL的樣品溶液和2. 5 mL濃度為50 mmol/L，pH8. 2的Tris-HCl緩沖液混合，于 25 °C的條件下保溫2min，然后加入0. 15mL 3mmol/L的鄰苯三酚溶液(含lOmmol/L HC1)。 4min內每30s在325nm出測一次吸光值（A)，作（吸光度一時間)圖，其斜率即為自氧化速率。 抗壞血酸（Vc)作為陽性對照。超氧陰離子自由基清除率（Y)計算公式如下：
注：Vtl為蒸餾水代替酶解液組的自氧化率，Vl為酶解液組的自氧化速率。
[0012] 本發(fā)明與現有技術相比，具有如下優(yōu)點和技術效果： (1) 本發(fā)明所用原料為菲律賓蛤仔肉，來源廣泛，價格低廉，現在將其作為原料，開發(fā)成 抗氧化肽，升值幅度是相當可觀的； (2) 本發(fā)明采用酶解法酶解制備菲律賓蛤仔酶解液，然后利用色譜分離技術制備出了 一種抗氧化肽； (3) 本發(fā)明提供的抗氧化肽活性很強，，不僅可以用作食品添加劑，也可以作為功能性 成分，用于保健品、化妝品及護膚品中； (4) 本發(fā)明提供的抗氧化肽是一種九肽，分子量小，易于人體的吸收。
【附圖說明】
[0013] 圖1為Sephadex G-25凝膠層析分離純化抗氧化肽圖譜，其中圖Ia為色譜分離洗 脫曲線，圖Ib為抗氧化活性測定圖。
[0014] 圖2為Sephadex G-15凝膠層析分離純化抗氧化肽圖譜，其中圖2a為色譜分離洗 脫曲線，圖2b為抗氧化活性測定圖。
[0015] 圖3為制備型高效液相色譜分離純化抗氧化肽圖譜，其中圖3a為色譜分離洗脫曲 線，圖3b為抗氧化活性測定圖。
[0016] 圖4為抗氧化肽的離子流圖。
[0017] 圖5為抗氧化肽的二級質譜圖。
[0018] 圖6為抗氧化肽的擬合生成的質譜圖。
【具體實施方式】
[0019] 以下通過實施例進一步說明本發(fā)明的實施，但本發(fā)明的實施和保護不限于此。 [0020] 實施例1 (1) 抗氧化肽的酶解制備：將活菲律賓蛤仔用清水清洗后，去殼取肉，打漿。按料液比 1 : 5加入pH值為7.5,濃度為0.01mol/L磷酸鹽緩沖溶液，加入胰蛋白酶6000U/g于50°C 下酶解3. 5小時，于100°C下滅酶5min，將得到的酶解液在8000rpm下離心10min，得到的上 清液即為菲律賓蛤仔酶解液； (2) 抗氧化肽的分離純化：將酶解液用S印hadex G-25凝膠層析分離，以純水為洗脫 劑，于280nm下檢測，流速為2mL/min，檢測各組分的抗氧化活性，收集活性最高的RPTE2組 分，冷凍干燥后用去離子水配成50mg/mL溶液，用Sephadex G-15凝膠層析進一步分離，以 純水為洗脫劑，在280nm下檢測，流速為I. 25mL/min，檢測各組分的抗氧化活性，收集活性 最高的RPTE2-2組分；將RPTE2-2組分經制備型液相色譜分離，液相色譜的色譜條件為：