商陸皂苷元氨基胍衍生物Hu-17及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域，更具體地講，涉及新的具有抗癌活性的商陸皂苷元氨 基胍衍生物Hu-17及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 商陸阜苷元（phytolaccagenin，化學(xué)名：2 β，3 β，23-三羥基-齊墩果 烷-12-烯-28-酸-30-酸甲酯）是從中藥商陸中分離得到的一種活性成分，是商陸皂苷甲 (Esculentoside A，EsA)的苷元部分，而本發(fā)明中的商陸阜苷元通過酸水解商陸阜苷甲而 得到，其結(jié)構(gòu)如下：
[0003]
[0004] 研宄顯示，商陸皂苷甲在體外能顯著抑制巨噬細(xì)胞釋放IL-1、IL-6、TNF、PGE等 促炎因子，并能選擇性抑制C0X-2的活性；動物實驗表明，商陸皂苷甲對各種急慢性炎癥的 動物模型有顯著的抗炎作用（Wang Hong-Bin，et al. Mediators of inflammation 5 (4)： 292-294,1996 ；ffang Hong-Bin, et al, Mediators of Inflammation 5 (6):196,1996 ； Dianwen Ju，et al. Pharmacology 1998;鞠佃文等，藥學(xué)學(xué)報 34(1) :9_12,1999;肖振宇 等，中國藥理學(xué)會通訊，17(4) :32, 2000 ;肖振宇等，中國藥理學(xué)會通訊，17(4) :33, 2000 ;鄭 欽岳等，第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，22(5) :425, 2001;肖振宇等，中國藥理學(xué)報，23(7) :638, 2002; ZY Xiao, et al. Int J Radiat Oncol, 65 (3) :882-889,2006 ；ffang YB1Zhang YC1Zhu ZY, et al.，Bioorg&Med Chem. (15) :2528 - 2532, 2007)。但由于商陸皂苷甲有較強的溶血作用，限 制了其作為注射藥物的使用。而商陸皂苷元沒有溶血作用，因而具有良好的開發(fā)前景。為 了發(fā)現(xiàn)商陸皂苷元的新的活性，我們對商陸皂苷元進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造。有關(guān)具有抗癌活性的 商陸皂苷元衍生物的制備，國內(nèi)外未見有過報導(dǎo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個目的在于提供商陸皂苷元氨基胍衍生物Hu-17。
[0006] 本發(fā)明的第二個目的在于提供商陸皂苷元氨基胍衍生物Hu-17的制備方法。
[0007] 為實現(xiàn)以上第一個目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案：商陸皂苷元氨基胍衍生物 Hu-17,其特征在于，所述Hu-17分子式：C63H96N40 n，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
[0008]
[0009] 為實現(xiàn)本發(fā)明第二個目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案：商陸皂苷元氨基胍衍生物 Hu-17的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0010] (1)商陸皂苷元活性酯中間體的制備：商陸皂苷元溶于干燥的DMF/THF中，加入 N，N-二環(huán)己基碳酰亞胺和N-羥基苯并三氮唑形成商陸皂苷元活性酯；
[0011] (2)Hu-17的合成：在步驟（1)獲得的商陸皂苷元活性酯中加入硫酸氨基胍和二甲 亞砜，加熱攪拌，分離純化，即得目標(biāo)產(chǎn)物Hu-17。
[0012] 作為一個優(yōu)選方案，步驟⑴中DMF/THF的體積比為1:3。
[0013] 作為一個優(yōu)選方案，步驟（2)的反應(yīng)條件為氬氣或者氮氣保護(hù)，60-90°C，4一8小 時。
[0014] 本發(fā)明的優(yōu)點在于：為提高商陸皂苷元的活性，對商陸皂苷元進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造獲得 商陸皂苷元C28衍生物Hu-17。C28羧基結(jié)構(gòu)是其主要的活性位點，通過化學(xué)合成方法，將商 陸皂苷元衍生化，獲得的化合物Hu-17具有顯著的抗卵巢癌活性。
【附圖說明】
[0015] 圖1化合物Hu-17抑制卵巢癌細(xì)胞：A)化合物Hu-17 (1. 25 μ M、2. 5 μ M、3. 75 μ M、 5 μΜ)處理 Α2780 細(xì)胞 24、48 和 72 小時；Β)化合物 Hu-17(2. 5 μΜ、3· 75 μΜ、5 μΜ)處理 Η0-8910 細(xì)胞 24、48 和 72 小時；C)化合物 Hu-17(2. 5 μΜ、3· 75 μΜ、5 μΜ)處理 Η0-8910ΡΜ 細(xì)胞 24、48 和 72 小時；D)化合物 Hu-17(2. 5 μΜ、3· 75 μΜ、5 μΜ)處理 SK-0V-3 細(xì)胞 24、48 和72小時。MTT比色法檢測細(xì)胞相對活力，計算細(xì)胞生長抑制情況。各組實驗均獨立重復(fù) 三次，圖中數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差（mean土SD)展示。
[0016] 圖2化合物Hu-17能顯著誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡：A) (a)化合物Hu-17 (2.5 μ M、 3. 75 μΜ)處理Α2780和SK-0V-3細(xì)胞42小時流式細(xì)胞儀檢測的Annexin V陽性細(xì)胞（統(tǒng) 計二四象限比例之和）的比例，（b)候選藥物（3. 75μΜ、5μΜ、6. 25μΜ)處理H0-8910和 Η0-8910ΡΜ細(xì)胞48小時檢測的Annexin V陽性細(xì)胞比例。Β)選取的Η0-89ΚΚΗ0-8910ΡΜ和 SK-0V-3細(xì)胞在不同藥物濃度處理后的凋亡散點圖，橫坐標(biāo)代表FITC-Annexin V，縱坐標(biāo)代 表ΡΙ，紅色散點（即第三象限）代表活細(xì)胞，藍(lán)色散點（即第二象限）代表晚期凋亡的細(xì)胞， 綠色散點（即第四象限）代表早期凋亡的細(xì)胞。C)5yM候選藥物（Hu-17)處理Η0-8910ΡΜ 細(xì)胞48小時線粒體跨膜電位降低的細(xì)胞比例。D)線粒體跨膜電位變化的散點圖，圖中橫坐 標(biāo)為Rhl23,縱坐標(biāo)為PI，第四象限表示羅丹明123陽性細(xì)胞，一三象限表示膜電位降低的 細(xì)胞。各組實驗均獨立重復(fù)三次，圖中數(shù)據(jù)以平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（mean土SD)展示，組間比較 采用雙側(cè)t檢驗法，其中**表示P〈0. 01，***表示P〈0. 001。
[0017] 圖3化合物Hu-17擾亂卵巢癌細(xì)胞周期：A) (a) A2780細(xì)胞經(jīng)候選藥物（2. 5 μ Μ)處 理48小時后各周期比例的柱狀圖。（b)H0-8910細(xì)胞經(jīng)候選藥物（3. 75 μΜ)處理48小時 候后各周期比例的柱狀圖。（c) Η0-8910ΡΜ細(xì)胞經(jīng)候選藥物（3.75 μ Μ)處理48小時候后各 周期比例的柱狀圖。Β)Α2780、Η0-8910、Η0-8910ΡΜ細(xì)胞加藥前后的周期分布圖，圖中藍(lán)色 部分代表處于S期的細(xì)胞，其左右兩側(cè)紅色部分分別代表處于G0/G1期和G2/M期的細(xì)胞。 各組實驗均獨立重復(fù)三次，圖中數(shù)據(jù)以平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（mean土SD)展示，組間比較采用雙 側(cè)t檢驗法，其中*表示Ρ〈0· 05, **表示Ρ〈0· 01，***表示Ρ〈0· 001，ns表示無統(tǒng)計學(xué)顯著 性差異。
[0018] 圖4化合物HU-17在荷瘤小鼠上顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的生長：A)在裸鼠皮下移植 A2780細(xì)胞2周后給藥（腹腔注射給藥，三天兩次，5mg/kg/次）并動態(tài)監(jiān)測腫瘤直徑，通過 公式V = l/2XaXb2計算出腫瘤體積，并得出相對腫瘤體積（RTV = Vt/V0，Vt表示實時測 量的腫瘤體積，VO表示給藥前腫瘤體積），繪制腫瘤生長曲線，Candidate表示候選新藥組， Control表示陰性對照組。B)給藥結(jié)束3天后（Day31)，脫頸處死裸鼠，將兩組瘤體剝離后 稱得的瘤重。C)給藥期間動態(tài)監(jiān)測裸鼠體重的變化繪制成的體重變化曲線。圖中數(shù)據(jù)以 平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（mean土SD)展示，組間比較采用t檢驗法，其中*表示P〈0. 05, **表示 P〈0. 01，ns表示無統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。D)兩組瘤體剝離后的照片。
[0019] 圖5體外實驗證實化合物Hu-17顯著增強順鉑對耐藥的卵巢癌細(xì)胞的生長抑制和 誘導(dǎo)凋亡效果：A) A2780、H0-8910、H0-8910PM和SK-0V-3細(xì)胞經(jīng)10 μ M和20 μ M的順鉑處 理48小時，MTT法檢測相對細(xì)胞活力。Β) Η0-8910、Η0-8910ΡΜ和SK-0V-3細(xì)胞經(jīng)20 μ M順 鉑或2. 5 μΜ Hu-17單獨或聯(lián)合處理48小時，MTT法檢測相對細(xì)胞活力。OWestern blot法 檢測H0-8910、H0-8910PM和SK-0V-3細(xì)胞的蛋白P53的表達(dá)。D)流式技術(shù)檢測H0-8910、 H0-8910PM和SK-0V-3細(xì)胞經(jīng)20 μ M順鉑或2. 5 μ M Hu-17單獨或聯(lián)合處理48小時后的凋亡 細(xì)胞的比例，凋亡細(xì)胞以Annexin V陽性細(xì)胞的比例顯示（統(tǒng)計二四象限）。E)SK-0V-3細(xì) 胞在20 μ M順鉑或2. 5 μ M Hu-17處理48小時后的凋亡散點圖。F) SK-0V-3細(xì)胞在2. 5 μ M Hu-17或20 μ M順鉑處理12小時后，抽提蛋白檢測凋亡指示分子PARP及caspase 3的變 化。G)H0-8910細(xì)胞經(jīng)200 μΜ卡鉑（Carboplatin)或5 μΜ Hu-17單獨或聯(lián)合處理48小 時，MTT法檢測相對細(xì)胞活力。H) SK-0V-3細(xì)胞經(jīng)80 μ M卡鉑或5 μ M Hu-17單獨或聯(lián)合處 理48小時，MTT法檢測相對細(xì)胞活力。M表示候選新藥，M+C (combination)表示候選新藥 與順鉬聯(lián)合使用。M+carboplatin表示候選新藥與卡鉬聯(lián)合使用。各組實驗均獨立重復(fù)三 次，圖中數(shù)據(jù)以平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（mean土 SD)展示，組間比較采用雙側(cè)t檢驗法，其中**表 示 Ρ〈0· 01，*** 表示 Ρ〈0· 001。
[0020] 圖6裸鼠體內(nèi)實驗顯示Hu-17與順鉑聯(lián)合使用顯著抑制耐藥的卵巢癌細(xì)胞的生 長：A)裸鼠皮下移植SK-0V-3細(xì)胞第13天開始用藥，期間動態(tài)監(jiān)測腫瘤大小，通過公示V = l/2XaXb2和RT