專利名稱：氨基胍的分析及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)氨基胍及其類似物的分析，特別是涉及在人體液中的氨基胍及其類似物的測(cè)量。
對(duì)化合物氨基胍的研究已進(jìn)行多年，具體地說(shuō)，最初確定它具有某些生理性質(zhì)，其中的一個(gè)性質(zhì)是對(duì)酶的組胺酶的抑制作用，氨基胍已被確定為雙胺氧化酶的一種選擇性抑制劑，為了研究組胺的新陳代謝而提供給動(dòng)物和人體。更具體地說(shuō)，如同Lindbergh等人在“The Inhibitory Effect of Aminoguanidine On Histamine catabolism in Human Pregnancy”《ACTA OBSTET.GYNECOL.SCAND.》(45131-139，1966)中指出的那樣，氨基胍被認(rèn)為可以提高組胺的水平。特別是最近確認(rèn)氨基胍作為蛋白質(zhì)的葡萄糖傳遞交聯(lián)的抑制劑，例如有用在非酶蛋白質(zhì)交聯(lián)狀態(tài)治療中，例如用在糖尿病引起的長(zhǎng)期并發(fā)癥的治療中。氨基胍的這一新發(fā)現(xiàn)的作用由Cerami.Ulrich和Brownlee，在1988年7月19日出版，專利號(hào)為4758583美國(guó)專利說(shuō)明書中公開(kāi)。其中的相關(guān)部分作為本申請(qǐng)的參考技術(shù)引用。
由于前面所述的氨基胍在研究組胺新陳代謝中的應(yīng)用結(jié)果，使在檢驗(yàn)活組織中的氨基胍分布相應(yīng)的測(cè)定方法取得了適當(dāng)?shù)倪M(jìn)度。特別是由Beaven等人在《J.PHARMACOL.EXP.THER.》(16514-22，1969)，提出了一種根據(jù)在酸溶液中氨基胍與P-硝基苯甲醛的反應(yīng)比色分析氨基胍。在這個(gè)反應(yīng)中生成一種正黃色的物質(zhì)，這種物質(zhì)可以從內(nèi)生的物質(zhì)萃取到乙酸乙酯中，然后再返回到稀鹽酸中，再將該鹽酸萃取物變成堿性后，可以用分光光度法測(cè)定該黃色產(chǎn)物。
另一方面，由Beaven等人確認(rèn)的方法提供了一種適于具有個(gè)別特性研究的測(cè)定，作為一種即將出現(xiàn)的治療試劑的氨基胍已經(jīng)促進(jìn)了更加完善的測(cè)定方法的發(fā)展，這種方法能夠自動(dòng)地操作，迅速地分批分析生物樣品中的該化合物。這樣的測(cè)定將促進(jìn)有效地、迅速地和精確地控制氨基胍的治療。這正如在美國(guó)專利4758583中所提及那樣，另外還有助于對(duì)這種化合物的新的潛在活性和各種應(yīng)用識(shí)別。
此外，人們希望發(fā)展這種分析方法，這種方法不僅對(duì)氨基胍是有用的，對(duì)它的類似物也是有用的，這些同樣是根據(jù)上述的美國(guó)專利所教導(dǎo)的概要發(fā)展，而AG(氨基胍)及其類似物的代謝物的存在對(duì)于測(cè)量是重要的。
根據(jù)本發(fā)明，發(fā)展了一種分析方法和有關(guān)的材料，這種方法提供了確定氨基胍及其類似物質(zhì)在生物樣品例如血漿和身體組織存在和分布的迅速和精確的手段。因此，在其本質(zhì)方面本發(fā)明包括一種分析氨基胍及其類似化合物的方法，它包括A、收集一個(gè)確信包括有一些氨基胍及其類似化合物的生物樣品;
B、脫去該生物樣品中的蛋白質(zhì);
C、使經(jīng)步驟B中除去過(guò)蛋白質(zhì)的生物樣品同足夠量的吡啶醛反應(yīng)，以使在該生物樣品中存在的氨基胍及其類似物全部轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的吡啶醛-取代腙;
D、用一個(gè)利用梯度洗脫高壓液相色譜法從反應(yīng)混合物的剩余物分離出在步驟C中生成的全部取代腙;以及E、檢驗(yàn)步驟D中所分離出的物質(zhì)，以便估計(jì)該氨基胍和/或其類似物的分布和數(shù)量。
這個(gè)生物樣品可以通過(guò)用足夠數(shù)量的脫去蛋白質(zhì)試劑或從用于沉淀蛋白質(zhì)的中等強(qiáng)度酸到強(qiáng)酸選擇的試劑以及一種適合的有機(jī)溶劑脫去蛋白質(zhì);也可以使樣品經(jīng)超過(guò)濾而脫去蛋白質(zhì)。適用的酸包括高氯酸和三氯乙酸，而適用的有機(jī)溶劑包括甲醇、乙腈和二氯甲烷。在氨基胍是被分析的化合物的情況下，吡啶醛最好包括6-甲基-2-甲基吡啶醛，它對(duì)應(yīng)于形成6-甲基-2-甲基吡啶醛脒腙。最好是使生物樣品和吡啶醛之間的反應(yīng)在中等酸度的條件下進(jìn)行，而色譜條件采用具有徑向壓縮的色譜柱和具有一均勻流量率和在離子對(duì)條件下進(jìn)行。在缺少?gòu)较驂嚎s的工藝的情況下，可以用鋼柱中類似填充材料來(lái)代替，雖然色譜儀調(diào)整可能需要。最后腙析出物可以用紫外光譜儀進(jìn)行檢驗(yàn)。對(duì)氨基胍來(lái)說(shuō)在波長(zhǎng)302nm能檢查出來(lái)。
上述程序具有各種應(yīng)用，特別是適用于促進(jìn)與糖尿病和衰老的有害影響斗爭(zhēng)而正在服用的氨基胍的測(cè)量，以便確定是否曾供給過(guò)氨基胍，倘若如此，為了獲得所希望的效果，氨基胍在體液中的合適數(shù)量是否已經(jīng)達(dá)到，作為最后監(jiān)測(cè)的輔助手段，上述程序?qū)⑦M(jìn)一步促進(jìn)調(diào)整給藥量，以便使體液中的氨基胍的含量達(dá)到有效水平。這樣本發(fā)明分析方法例如可以利用生物流體樣品如尿、唾液、組織勻漿和血漿。
如上所述，借助于這個(gè)分析的檢測(cè)和測(cè)量氨基胍的方法適合于氨基胍的類似物。在這當(dāng)中，下面將以N-乙基氨基胍測(cè)定作為氨基胍的典型的類似物的例子來(lái)說(shuō)明，這個(gè)物質(zhì)已作本分析系統(tǒng)的內(nèi)部標(biāo)樣，并表明這個(gè)分析系統(tǒng)適合于氨基胍的其它類似物。氨基胍可以用作其它類似物的內(nèi)部標(biāo)樣，只要氨基胍不是一種可疑的或該類似物的已知代謝物，并且它有測(cè)量需要的濃度。
本分析方法相應(yīng)的應(yīng)用范圍可以推廣到生物樣品是組織的情況下，此外，本發(fā)明可以擴(kuò)展到一種測(cè)量在組織中氨基胍和/或及其類似物的存在的方法，這個(gè)方法是通過(guò)收集一個(gè)或多個(gè)組織樣品，然后對(duì)這些樣品完成本發(fā)明的測(cè)定。這樣這些組織例如可以是腎、骨膠原子、血管等以及類似物可以作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究和人體活組織研究同樣地被檢驗(yàn)，以便測(cè)量在這些組織中氨基胍或類似物的水平，從而確定這樣的水平是否合適，以及在一新發(fā)現(xiàn)了氨基胍的衍生物的情況下，為了發(fā)揮所希望治療的抑制效果就要確定這些衍生物是否能夠定位在所期望的組織中。
本發(fā)明還擴(kuò)展到一種測(cè)量腎功能的方法，該方法是通過(guò)對(duì)氨基胍及其類似物的消除半衰期測(cè)量來(lái)完成的，而在一個(gè)具體的實(shí)施例中，可以借助本分析方法來(lái)完成測(cè)定。當(dāng)然，腎功能的測(cè)量可以通過(guò)從所檢測(cè)者收集血漿樣品;用足夠量的氯化有機(jī)酸除去血漿樣品中的蛋白質(zhì)，使脫去蛋白質(zhì)的血漿樣品同吡啶醛最好在中等強(qiáng)度的酸性條件下反應(yīng)，以便生成一種吡啶醛取代脘;借助高壓液相色譜法分離形成的任何腙，并且最好用紫外光譜儀檢測(cè)這個(gè)分離物，以便確定氨基胍或其類似物。
整個(gè)的分析和程序包括服用一個(gè)固定劑量的氨基胍或及類似物，接著按不同的時(shí)間收集血漿樣品，完成本方法，從而確定在每個(gè)樣品中的氨基胍的含量，將計(jì)算出的氨基胍的排除數(shù)據(jù)，同根據(jù)曲線或列表的連續(xù)集得到的數(shù)據(jù)相比較，其中曲線或列表的數(shù)據(jù)是事先收集各種不同腎功能被試驗(yàn)者中采集的氨基胍的排除數(shù)據(jù)中整理出來(lái)的，根據(jù)比較結(jié)果來(lái)確定目前被檢測(cè)者的腎功能。
本發(fā)明還涉及一個(gè)為完成本分析的試驗(yàn)器材箱，這個(gè)器材箱中裝有A、供脫去生物樣品蛋白質(zhì)用的一定量的試劑;
B、用于同獲得的氨基胍或其類似化合物反應(yīng)的一定量的吡啶醛;
C、其它用在高壓液體色譜儀試劑和固定液;
D、使用這些器材的指南。
適合的脫去蛋白質(zhì)的試劑可以從適合于沉淀蛋白質(zhì)的中等強(qiáng)度的酸到強(qiáng)酸以及合適的有機(jī)溶劑中選擇。這些酸和溶劑早已列這當(dāng)中。本測(cè)定器材箱還可以包括從氨基胍和它的類似物選出的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，例如氨基胍的類似物N-乙基氨基胍。
在為測(cè)量腎功能而準(zhǔn)備的試驗(yàn)器材箱的情況，它可以包括在事先量過(guò)的適于被試驗(yàn)者服用的劑型中一定量氨基胍或一種類似物，還應(yīng)包括商的曲線或列表的連續(xù)集，或者從這樣一個(gè)連續(xù)集導(dǎo)出的公式，這個(gè)連續(xù)集由用腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)表示的氨基胍或它的類似物一致的消除半衰期(T1/2)確定，診斷者和門診醫(yī)師可以參考它解釋在腎合用性期間試驗(yàn)結(jié)果。
這種予先確定的劑型，可以制成口服的，具可以事先制成固態(tài)或液態(tài)劑型，如所予期的片劑、膠囊、甘香酒劑、糖漿等。這個(gè)商包括由氨基胍或其類似物消除半衰期(T1/2)與腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)的比率得出的系數(shù)。
本發(fā)明呈現(xiàn)出廣泛的優(yōu)點(diǎn)，作為能夠迅速估計(jì)腎功能的現(xiàn)代診斷程序，以及與顯露診斷和治療作用相結(jié)合的有希望的效率，這對(duì)于氨基胍和它的類似物被預(yù)見(jiàn)。因?yàn)楸景l(fā)明的分析方法速度高，操作簡(jiǎn)單，精度高，可靠，所以使它可作為一個(gè)極好的診斷和研究工具，將達(dá)到廣泛的接受和使用。
這樣，本發(fā)明的主要目的是提供一種測(cè)量氨基胍及其類似物質(zhì)在組織和生物流體樣品中的分布。
本發(fā)明的另一目的是提供一種上述的方法，這種方法可在容易和廉價(jià)的方式中完成。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種上述的方法，這種方法可以用作對(duì)和氨基胍及其代謝物和類似物質(zhì)具有同樣作用的藥品和其它化合物的分析。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種精確的可靠的估價(jià)腎功能的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的提供一種為完成所述方法的試驗(yàn)器材箱，它應(yīng)用簡(jiǎn)單。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是在具有氨基胍或其類似物質(zhì)的存在，活性或排除的有關(guān)病理學(xué)狀況或條件的哺乳動(dòng)物中監(jiān)測(cè)藥物養(yǎng)生法或類似草案的有效性。
根據(jù)下面的說(shuō)明書和結(jié)合附圖的描述對(duì)于本專業(yè)的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見(jiàn)的。


圖1是從完成測(cè)定鼠、狗和人的血漿結(jié)果中得到的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)的概括的曲線。
圖2包括分別為人的空白血漿樣品，一個(gè)低濃度(0.1μg/ml)量的對(duì)照樣品和一個(gè)高濃度(8μg/ml)量對(duì)照樣品單獨(dú)的色譜圖。
圖3是一個(gè)從完成測(cè)定人的尿的結(jié)果中得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)的概括的曲線。
圖4包括分別為人的空白尿樣品，一個(gè)低濃度(1、0μg/ml)量的對(duì)照樣品，和一個(gè)高濃度(90μg/ml)量的對(duì)照樣品的單獨(dú)色譜圖。
圖5是一個(gè)氨基胍排放半衰期(T1/2)對(duì)腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)商的連續(xù)集的關(guān)系曲線。
本發(fā)明涉及一種用于測(cè)量在人體流體和組織中的氨基胍及其類似物質(zhì)的方法和有關(guān)材料。本發(fā)明的方法包括A、收集確信含有氨基胍或其類似物質(zhì)的生物樣品;
B、對(duì)生物樣品進(jìn)行脫去蛋白質(zhì)處理;
C、使在步驟B中脫去過(guò)蛋白質(zhì)的生物樣品同中足夠量的吡啶醛反應(yīng)，以便使在該生物樣品中的氨基胍或其類似物質(zhì)全部轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的吡啶醛-取代腙;
D、借助于利用均勻洗脫的高壓液體色譜法從反應(yīng)混合物的剩余物中全部分離出在步驟C中生成的取代腙。
E、檢驗(yàn)步驟D中的分離物，以便估價(jià)該氨基胍和/或及類似物的數(shù)量和分布。
如上所述，本發(fā)明的方法力圖提供一個(gè)能夠用在自動(dòng)的分批的基礎(chǔ)上使用測(cè)定程序，這個(gè)程序除了適合診斷和試驗(yàn)?zāi)康耐?，還適合于治療目的。盡管Beaven等人公開(kāi)的氨基胍已知測(cè)定方法中包括比色分析，但是本發(fā)明方法在生成吡啶醛取代腙這點(diǎn)上是具有特點(diǎn)的，這個(gè)吡啶醛取代腙可以用紫外光檢測(cè)，而更重要的是在其檢驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性、相應(yīng)的精度和重復(fù)性。生成腙本身不是新的發(fā)現(xiàn)，它已被Ceba等人在《Analytical Properties of Pyridine-2-Aledhyde Guanylhydrazone，》(TALANTA 28134-136 1981)所公開(kāi)，這些作者公開(kāi)了這種腙的制備方法并建議同各種無(wú)機(jī)陽(yáng)離子一起作為分析試劑，因?yàn)橛眠@種腙能生成視覺(jué)可以區(qū)分的絡(luò)合物。在Ceba等人的論文中，關(guān)于可以通過(guò)反應(yīng)生成相應(yīng)脒基腙來(lái)測(cè)定氨基胍，以及這最終的反應(yīng)物可以在波長(zhǎng)為302nm的紫外范圍內(nèi)很容易檢測(cè)出來(lái)，這個(gè)構(gòu)思一點(diǎn)也沒(méi)有提及。
如上所述，為了脫去樣品的蛋白質(zhì)可以用能夠沉淀蛋白質(zhì)的試劑來(lái)處理樣品，也可以用其它分離技術(shù)處理樣品，例如超過(guò)濾技術(shù)。適合的試劑可以從中等強(qiáng)酸到強(qiáng)酸，例如高氯酸和三氯乙酸一類酸中選取，后者優(yōu)先選用。如果用三氯乙酸，其典型的濃度為7.5%。試劑也可以從由在溶劑一以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)沉積程序中使用的有機(jī)溶劑，例如甲醇、乙腈和二氯甲烷中選取。蛋白沉積技術(shù)是公知的，在這里要提及的是補(bǔ)充的程序。當(dāng)然在這里試劑和規(guī)定的程序是為了說(shuō)明的目的，以及依照申請(qǐng)人要盡公開(kāi)完成本發(fā)明最好的方式的義務(wù)而提出的。
用在本發(fā)明的吡啶醛可以是6-甲基甲基吡啶醛，它可以制成例如10mg/ml濃度的溶液。此外，在吡啶醛和脫去過(guò)蛋白質(zhì)的生物樣品之間的反應(yīng)最好在中等強(qiáng)度酸中進(jìn)行。然而具體的吡啶醛及其具體的濃度在這個(gè)工藝中是可以改變的，上述的選擇數(shù)據(jù)同樣是為了使申請(qǐng)人盡公開(kāi)完成發(fā)明的最好方式的義務(wù)而提出的。
本方法的下一個(gè)步驟中是要借助于采用均勻或梯度的洗脫的高壓液體色譜法從生物樣品和吡啶醛之間的反應(yīng)形成取代腙，然后從反應(yīng)混合物的剩余物中把所有取代腙全部分離出。具體地說(shuō)，色譜方案可以利用具有均勻流量率的在離子對(duì)條件下的徑向壓縮色譜柱的。然后，用紫外光譜法對(duì)最終的腙的分離物進(jìn)行檢驗(yàn)，而在氨基胍的具體情況下，可以在302nm波長(zhǎng)檢測(cè)。這個(gè)檢測(cè)特異性是本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)之一，并且它區(qū)別公知的比色分析測(cè)定方法。
實(shí)踐本方法包括一個(gè)內(nèi)部標(biāo)樣的參考標(biāo)準(zhǔn)，這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)最好是同根據(jù)本方法的步驟B對(duì)它處理之前的生物樣品結(jié)合，要選擇具有類似結(jié)構(gòu)和功能性的樣品作為這個(gè)內(nèi)部標(biāo)樣，以便能保持對(duì)本方法的程序?qū)φ兆饔?。適合作為內(nèi)部標(biāo)樣的化合物包括氨基胍及其類似物質(zhì)。內(nèi)部標(biāo)樣可以是氨基胍或一個(gè)類似物質(zhì)，例如N-乙基氨基胍(＝N-ethylhydrazine carboximidamide)。當(dāng)然，利用具體化合物作為內(nèi)部標(biāo)樣不是對(duì)本發(fā)明的限定，而采用其它與氨基胍的結(jié)構(gòu)和功能相似的化合物作為標(biāo)樣也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
如前所述，本方法具有很多應(yīng)用，其中包括對(duì)在各種生物環(huán)境下的氨基胍及其類似物質(zhì)的檢測(cè)，具體地說(shuō)，根據(jù)本方法可以測(cè)量的生物樣品包括流體，例如血漿、唾液、尿和組織等，本方法還具有多種診斷和治療應(yīng)用。
在進(jìn)一步實(shí)施例中，本發(fā)明涉及一種監(jiān)測(cè)治療方案或藥物療法的效率的方法，這些治療中包括服用例如氨基胍或及類似物質(zhì)的化合物，以便與過(guò)強(qiáng)的身體蛋白質(zhì)糖化作用的有害影響斗爭(zhēng)，如在老化過(guò)程和糖尿病中所證明的。本發(fā)明的方法可以借助分離和檢驗(yàn)由血漿，尿或組織所取的生物樣品來(lái)完成。為了確定在血中存在的氨基胍的治療劑量是否達(dá)到要求，可以測(cè)試血漿樣品，而為了測(cè)定氨基胍的清除率可以測(cè)定尿樣品，以便確定為保持有效的治療劑量所需要的相應(yīng)的氨基胍的給藥。最后，組織樣品可以從與治療目的有關(guān)的器官或人體的局部取出，以確定輸送到這個(gè)局部治療試劑是否已經(jīng)夠用。
本發(fā)明擴(kuò)展一種為治療病人以抑制在該病人體內(nèi)過(guò)強(qiáng)的糖基化作用的最后產(chǎn)物，該方法包括服用這樣的過(guò)強(qiáng)糖基化作用的一種有效數(shù)量的抑制劑，它包括一種從氨基胍及其類似物質(zhì)中選出的化合物。該方法還包括連續(xù)監(jiān)測(cè)在取自試驗(yàn)對(duì)象的樣品中氨基胍或它的類似物質(zhì)的含量是否達(dá)到治療有效的水平，這些樣品包括體液和組織。在這種情況下，本發(fā)明的分析方法可以在規(guī)定的時(shí)間間隔中進(jìn)行，精確的時(shí)間間隔應(yīng)根據(jù)單個(gè)服藥方案和病人簡(jiǎn)況改變。例如，這些時(shí)間間隔可以在一小時(shí)到24小時(shí)內(nèi)調(diào)整。
本發(fā)明可以應(yīng)用于檢測(cè)上面提及的氨基胍的類似物質(zhì)，就此而論，擴(kuò)展到一種確認(rèn)化合物篩選測(cè)定，這種化合物可以抑制過(guò)強(qiáng)的糖基化作用最后產(chǎn)物的生成，并且這類化合物具有和氨基胍相似的結(jié)構(gòu)。在這樣的情況下，一種生物樣品例如組織樣品或細(xì)胞培養(yǎng)物，可以用一定量的化合物在試驗(yàn)中培養(yǎng)，此后本分析方法在觀察時(shí)可以測(cè)定被檢查化合物的存在和活性，從而測(cè)定它的吸收、分布、新陳代謝和/或排泄簡(jiǎn)況。在這種情況，予見(jiàn)的具有和氨基胍相似的結(jié)構(gòu)抑制劑化合物臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中，則可以將這個(gè)新藥物供給實(shí)驗(yàn)對(duì)象，然后接規(guī)定的間隔取出尿樣品，從而確定被檢測(cè)藥品的范圍和它的腎清除率發(fā)生。這個(gè)試驗(yàn)可以作為檢驗(yàn)組織和血漿樣品的輔助手段來(lái)進(jìn)行。從而不僅確定了新藥品的療效，還試圖有系統(tǒng)地闡述一個(gè)適宜的給藥方案。
本發(fā)明同樣擴(kuò)展到一個(gè)測(cè)試器材箱，以便完成氨基胍及其類似物質(zhì)的分析，它包括A、一定數(shù)量用于脫去生物樣品中蛋白質(zhì)的試劑;
B、一定數(shù)量用于同獲得的氨基胍或類似化合物反應(yīng)吡啶醛;
C、在高壓液體色譜法中應(yīng)用的其它試劑和固定液;
D、關(guān)于該器材箱的使用指南。
在本器材箱中的脫去蛋白質(zhì)的試劑和吡啶醛的選擇如前所述。同樣，這個(gè)器材箱可以包括一定量的內(nèi)標(biāo)以及一般用在高壓色譜法中試劑和材料。
本發(fā)明進(jìn)一步實(shí)施例擴(kuò)展到一種測(cè)定腎功能的方法，它包括，向待檢測(cè)對(duì)象供給一事先確定的數(shù)量或從由氨基胍及其類似物質(zhì)組成的組中選定的主要試劑量;按規(guī)定的時(shí)間間隔從該待檢對(duì)象身上，收集血漿樣品，并檢測(cè)該標(biāo)品中上述的氨基胍或其類似物質(zhì)的含量和分布。這種方法主要注視作為這個(gè)目的主要試劑氨基胍及其類似物質(zhì)應(yīng)用，并擴(kuò)展到各種試驗(yàn)方案，在這些方案中，可以服用這樣的試劑，然后進(jìn)行監(jiān)測(cè)和/或測(cè)量。這些方案的具體例子將在這里著重說(shuō)明，對(duì)試驗(yàn)器材箱同樣也予以考慮，它包括一定數(shù)量的從氨基胍及其類似物中選出的主要試劑，其它的試劑和底物以及器材的使用指南。
下面說(shuō)明一種測(cè)量腎功能的具體方法，它包括測(cè)量氨基胍或及類似物質(zhì)的排放半衰期(T1/2)，并把這些數(shù)據(jù)同從各種參考個(gè)人樣品得到的同類數(shù)據(jù)集相比較。更具體地說(shuō)，這種方法包括服用一確定劑量氨基胍或其類似物質(zhì)，然后按規(guī)定的各個(gè)時(shí)間間隔，依次從該被檢對(duì)象身體中收集血漿樣品，用本法檢測(cè)這些樣品，根據(jù)其檢測(cè)結(jié)果確定每個(gè)樣品的排放半衰期數(shù)據(jù)，再將這些數(shù)據(jù)與從有各種腎功能個(gè)別人試驗(yàn)和分析中得到的數(shù)據(jù)的預(yù)先確定的數(shù)據(jù)集相比較。這個(gè)測(cè)定的數(shù)據(jù)包括排放半衰期和腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)，將這些單個(gè)數(shù)據(jù)綜合起來(lái)考慮，以便確定一個(gè)比值，根據(jù)這個(gè)比值，可以用表格或曲線圖的數(shù)據(jù)集表示出來(lái)。
作為
背景技術(shù)：
，腎功能的測(cè)量數(shù)據(jù)長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為是在一般的健康評(píng)價(jià)以及具體的病癥例如腎病(nephropathy)的重要指標(biāo)。因?yàn)槟I在人體呼吸和新陳代謝活動(dòng)中起著同等重要的作用，所以與病理無(wú)關(guān)的腎衰老或腎衰竭是危險(xiǎn)的。例如，腎衰竭需要血液透析或進(jìn)行腎移植，在血透析的情況下，必須連續(xù)地監(jiān)測(cè)腎功能，以便確定透析處理的必要性和頻次。因此可以正確估價(jià)腎衰竭是否由糖尿病引起的。上述的方法一般應(yīng)用在任何病理?xiàng)l件下的腎功能的評(píng)價(jià)上。
公知的測(cè)量腎功能的方法有多種，其中有血靜脈內(nèi)灌輸放射性示蹤物，首先服用示蹤物，然后取出血液和定量的尿樣品，再測(cè)定在穩(wěn)定條件下這些示蹤物的腎清除率。雖然這種方法是精確的，但是它有許多缺點(diǎn)，其中包括需要小心管理病人和定時(shí)收集尿和血樣品等，此外病人服用的放射性物質(zhì)可能表現(xiàn)對(duì)人體安全有危害，以及附帶的同位素的存儲(chǔ)和運(yùn)輸、銷售的價(jià)格高和由于這些同位素的半衰期短，需要經(jīng)常補(bǔ)充的等問(wèn)題，還有安全幫資金上的考慮。因?yàn)榉派湫酝凰氐陌胨テ诙潭杞?jīng)常補(bǔ)充，在很多情況下，在用這種物質(zhì)之前，設(shè)備、病人和在測(cè)定中使用這種物質(zhì)的工作人員，都要受到附加的污染。
第二種方法是測(cè)量?jī)?nèi)生的肌酸酐排放量，在這種方法中必需從病人收集血和全尿樣品，誤差主要是由于很難收集全尿樣品，很多要求測(cè)定腎功能的病人呈現(xiàn)有神經(jīng)方面的損傷，使他們完全排空膀胱，如果不是不可能至少也是困難的。而且為了收集全部尿，24小時(shí)尿收集需要病人在家里或在醫(yī)院里配合，這種配合病人很難保證。于是雖然肌酸酐排放量的測(cè)定是科學(xué)可靠的，和理論上精確，但是常常在獲得精確檢測(cè)樣品的實(shí)踐中失敗。
通過(guò)上述的比較，作為適合于測(cè)定腎功能的本方法提供了一個(gè)簡(jiǎn)單方便和可能的方案。所需要做的只是一次服用小劑量的氨基胍和分三次取出血液樣品。服用小劑量的氨基胍表現(xiàn)低的危險(xiǎn)，減少了流體收集的次數(shù)，同樣還減少了對(duì)病人的危險(xiǎn)和不方便。正如下面指出的那樣，從完成用于腎功能的本方法中所獲得的數(shù)據(jù)指出在氨基胍的消除半衰期和借助腎小球?yàn)V過(guò)率測(cè)定的腎功能之間的線性關(guān)系有極好線性相關(guān)。
如前所述，完成評(píng)價(jià)腎功能的本方法的具體實(shí)施例的步驟包括A、給病人服用一次300mg劑量的鹽酸氨基胍，鹽酸氨基胍可以是口服的膠束、片劑或液體糖漿、甘香酒劑等。
B、在氨基胍或類似物質(zhì)服用后，定期收集血漿樣品，例如至少收集3ml血漿樣品，如果服用的是干的氨基胍(例如小丸狀)則應(yīng)在服用后10小時(shí)取第一個(gè)樣品，在服用后14小時(shí)取第二個(gè)樣品，在服用后18小時(shí)取第三個(gè)樣品;如果服用的是液體氨基胍，可以按類似的規(guī)則進(jìn)行取樣。
C、根據(jù)本發(fā)明的方法，對(duì)按指定時(shí)間間隔收集的樣品進(jìn)行處理，以便測(cè)定氨基胍的濃度。
D、測(cè)定消除半衰期(T1/2)，具體地說(shuō)，是參考關(guān)系式解釋和確定數(shù)據(jù)，其中血漿濃度的對(duì)數(shù)下傾的斜率隨時(shí)間關(guān)系被確定為消除率(Kelim)，消除半衰期(T1/2)和Kelim由下列方程來(lái)確定。
T1/2＝0.6931/KelimE、在測(cè)定出氨基胍消除半衰期以后，把它與一個(gè)連續(xù)集比較，這個(gè)集是氨基胍消除半衰期與從大量個(gè)人的腎功能值聯(lián)系起來(lái)，這些個(gè)人有各種各樣的腎功能，其中包括從腎功能正常的到不正常的試驗(yàn)對(duì)象。在這些人身上，兩種測(cè)量結(jié)果都已事先得到。這個(gè)現(xiàn)存數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)或連續(xù)集顯示出氨基胍的消除半衰期和腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)之間呈反比的關(guān)系。
以目前得到的數(shù)據(jù)和試驗(yàn)為基礎(chǔ)，口服300mg劑量的鹽酸氨基胍以后測(cè)定氨基胍得到T1/2和腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)之間的關(guān)系如下氨基胍T1/2＝-0.14(GFR)+22.04(r＝0.875，n＝18)上述關(guān)系式可以根據(jù)腎小球?yàn)V過(guò)率解出，將解出的最終的數(shù)據(jù)點(diǎn)同根據(jù)的已知腎功能個(gè)人試驗(yàn)建立的數(shù)據(jù)的連續(xù)集相比較。圖5中示出這樣連續(xù)集的代表。它包括一個(gè)氨基胍的清除半衰期隨著腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)變化的曲線和并包括求出的數(shù)據(jù)點(diǎn)，這個(gè)圖將在后面的例3中說(shuō)明。
正如前所述，本方法的優(yōu)點(diǎn)之一是擺脫了因繁瑣的尿的收集和檢驗(yàn)而帶來(lái)的不精確和不方便。本方法可以通過(guò)簡(jiǎn)單服用事先確定數(shù)量的氨基胍，然后按照如上面所建議的時(shí)間間隔依次收集血漿樣品來(lái)完成，然后根據(jù)本方法處理這些樣品，將這測(cè)量數(shù)據(jù)變換氨基胍的相應(yīng)的消除數(shù)據(jù)，再將這些數(shù)據(jù)與借助于曲線或表格表示的已有的連續(xù)集比較。根據(jù)這個(gè)方法，可以得到一安全有效的簡(jiǎn)單的監(jiān)測(cè)腎功能的方法?？砂堰@種方法推廣到檢測(cè)與腎功能有關(guān)的病癥的發(fā)作和存在，這是可取的。
本發(fā)明還進(jìn)一步提供一個(gè)根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)最佳實(shí)施例評(píng)價(jià)腎功能的測(cè)試器材箱，它包括A)一定數(shù)量的氨基胍及類似物質(zhì)，它被制成予先確定劑量的適于檢測(cè)對(duì)象服用的形式;
B)包括從氨基胍或其類似物質(zhì)的消除半衰期T1/2同它的腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)的比值導(dǎo)出商的圖或連續(xù)集;
C)一定數(shù)量的用于脫去生物樣品中蛋白質(zhì)的試劑;
D)一定數(shù)量的用于同可以獲得的氨基胍或其類似化合反應(yīng)的吡啶醛;
E)用在高壓色譜儀中的其他試劑和固定液;
以及F)測(cè)試器材使用指南。
如前所述試驗(yàn)器材箱，本測(cè)試器材箱可以包括一個(gè)內(nèi)部標(biāo)樣，例如氨基胍或其類似物質(zhì)。同樣地在測(cè)試器材箱中的試劑可以包括前面指出脫去蛋白質(zhì)試劑在內(nèi)的那些試劑。這個(gè)測(cè)試器材箱可以根據(jù)重復(fù)使用基礎(chǔ)來(lái)準(zhǔn)備，其中器材箱中的某些消耗品可以多倍劑量地提供;或者這個(gè)器材箱準(zhǔn)備供一次使用;在其中提供特定數(shù)量的每種試劑和消耗物品。
同樣，某些試劑可以制成干式的，例如借助于凍干，以便于包裝，并附有特定的說(shuō)明，為使用時(shí)加適當(dāng)液體以便活化這些試劑。
在本測(cè)試器材箱中事先確定的或事先測(cè)量過(guò)的數(shù)量的氨基胍或其類似物質(zhì)可以按各種服用方式制備，最好是制成固態(tài)或液態(tài)可口服的藥劑;如片、膠束、糖衣丸、密餞、糖漿、甘香酒劑等形式。此外具有各種濃度氨基胍都是有用的，本發(fā)明不限制氨基胍的特定濃度，300mg的鹽酸氨基胍及其類似物質(zhì)的藥劑已經(jīng)被利用并且是優(yōu)選的。
用下面的實(shí)施例加以說(shuō)明，可以更好地理解本發(fā)明
例1、下列試驗(yàn)曾經(jīng)是為確定本方法檢驗(yàn)一些哺乳動(dòng)物血漿樣品的精度而進(jìn)行的。這些樣品是從鼠、狗和人體中收集的，然后以一予先確定劑量的氨基胍處理。為了評(píng)價(jià)本分析程序的重復(fù)性和可靠性，兩個(gè)分析者進(jìn)行獨(dú)立和平行分析，對(duì)于每位分析者的最后得到的樣品按下述方法處理分析方法1、樣品制備將0、5ml內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(在7.5%三氯乙酸中10μg/mlN-乙基氨基胍甲苯磺酸鹽)加到0.5ml的血漿樣品中，在旋渦10秒鐘和在微型離心機(jī)(microfuge)(Eppendorf，14000rpm，10分鐘)離心分離后，將上層清液傾析到一干凈螺旋塞培養(yǎng)管中，其中裝有0.1ml反應(yīng)試劑的水溶液(10mg/ml)(6甲基-乙吡啶甲醛)，將該樣品用蓋蓋緊，在加熱裝置中(95°-100℃)反應(yīng)10分鐘，待冷卻后，將樣品輸送到高壓液相色譜儀中管瓶中，從該瓶中取200μl的樣品，以供高壓液相色譜分析用。
2、色譜采用Waters Associates Model 510泵的帶有一徑向壓縮柱(Waters Novapak CN.8mm×10cm，4μm的大小顆粒)和一個(gè)氰基(Waters Resolve Guard-pak CN)前置柱。利用可變波長(zhǎng)的紫外光檢測(cè)器(Waters 484)在302nm波長(zhǎng)檢測(cè)。移動(dòng)相(體積比)15%的乙腈10%的甲醇75%的各為0.01M的1-庚磺酸和磷酸一鈉。在室溫下流速保持在恒定的2.0ml/分，借助一個(gè)可編程序的取樣器順序地自動(dòng)地注入樣品。(Waters WISP 712)
3、數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)的獲得是用Waters Maxima 820系統(tǒng)來(lái)完成的，藥物峰高對(duì)內(nèi)部標(biāo)樣藥劑的濃度的峰高比對(duì)在標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)成日常方法標(biāo)準(zhǔn)化中加入的血漿中的濃度的峰高進(jìn)行線性一致分析。從該線性回歸線的內(nèi)插法，確定在質(zhì)量對(duì)照和未知分析樣品中氨基胍的濃度。
4、結(jié)果和討論以每天為基礎(chǔ)，在游離的氨基胍濃度為0-10μg/ml范圍內(nèi)觀察到線性(r＞0.998，p＜0.01)濃度最小的標(biāo)樣(0.05μg/ml)可被穩(wěn)定地測(cè)出。圖1概括了從這些研究中得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)，并表明平均峰高的比特性曲線和血漿濃度關(guān)系曲線。在這個(gè)研究中，從兩個(gè)分析者得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線本質(zhì)上是重疊的，因而圖是用總平均數(shù)據(jù)給出的。
從色譜的角度來(lái)看，6-甲基甲基吡啶醛脒腙(AGH)和6-甲基甲基吡啶醛-N-乙基脒腙(NEH)，這兩種在反應(yīng)期間同甲基吡啶醛(6-甲基-2-吡啶-羰基醛)生成的兩個(gè)加合物易于彼此和從內(nèi)生的干擾物中分離出來(lái)。圖2示出了一個(gè)人的空白血漿樣品色譜圖，一個(gè)低濃度(0、1μg/ml)質(zhì)量的對(duì)照樣品色譜圖和一個(gè)高濃度(8μg/ml)的質(zhì)量對(duì)照樣品色譜圖。
對(duì)每個(gè)試驗(yàn)中的隨時(shí)間有明顯較小不同，如用標(biāo)準(zhǔn)曲線的予先質(zhì)量對(duì)照試驗(yàn)與標(biāo)準(zhǔn)曲線過(guò)后的質(zhì)量對(duì)照試驗(yàn)(數(shù)據(jù)未給出)，所示這種變化的原因可能歸因于有機(jī)溶劑對(duì)各種移動(dòng)相水平的分配(色譜時(shí)移動(dòng)相沒(méi)有攪拌)或因過(guò)夜運(yùn)行時(shí)溫度波引動(dòng)起的，但是在進(jìn)行真實(shí)的生物樣品實(shí)際分析時(shí)，這些問(wèn)題可以通過(guò)在整個(gè)試驗(yàn)中緩慢連續(xù)攪拌移動(dòng)相使標(biāo)樣和質(zhì)量對(duì)照樣品分散開(kāi)來(lái)解決。因此對(duì)于這個(gè)研究使對(duì)所有的標(biāo)樣的數(shù)據(jù)號(hào)(予先的和后來(lái)的質(zhì)量對(duì)照)的回歸分析能充分模擬隨機(jī)分散標(biāo)樣曲線上的結(jié)果。
三組被測(cè)試組的全部血漿質(zhì)量對(duì)照樣品(質(zhì)量對(duì)照樣品A-D的游離氨基胍的濃度分別為0.1，0.8，2.0和8.0μg/ml)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)匯總在下面的表Ⅰ中



誤差%＝100%×(觀測(cè)濃度-理論濃度)/(理論濃度)QC＝質(zhì)量對(duì)照參看表Ⅰ，根據(jù)系數(shù)誤差確定人血漿的測(cè)定精度(用體積百分比表示)的范圍在所研究的濃度(0.1-8μg/ml)范圍內(nèi)從3.6%-12.9%(總平均值＝6.5%)。根據(jù)與理論濃度的百分誤差測(cè)出的準(zhǔn)確度的范圍從-0.90%到-5.8%(總平均值3.6%)對(duì)于從生物分析的觀點(diǎn)上看，這已是相當(dāng)令人滿意的結(jié)果了。
動(dòng)物血漿的質(zhì)量對(duì)照樣品(狗和鼠的)每天要用含水的氨基胍溶液注入到動(dòng)物的空白血漿中的辦法來(lái)組成。這樣作的目的是為了評(píng)價(jià)測(cè)定來(lái)自小動(dòng)物研究樣品的可行性。對(duì)于這些小動(dòng)物來(lái)說(shuō)要配制大量的血漿標(biāo)準(zhǔn)是有困難的。
就狗血漿質(zhì)量對(duì)照樣品的測(cè)定精度來(lái)說(shuō)，總平均的系數(shù)變差為9.7%(范圍8.2%到10.6%)。而就準(zhǔn)確度來(lái)說(shuō)與理論濃度總平均百分偏差為-2.6%(范圍-7.0%到1.8%)。
鼠血漿質(zhì)量對(duì)照樣品的測(cè)定精度平均為8.7%體積濃度(范圍5.6%到13.3%)，而與理論濃度的平均百分偏差為1.5%(范圍-3.8%到9.1%)。
在現(xiàn)行的分析條件下，如果血漿樣品中被測(cè)得的游離氨基胍的濃度超過(guò)10μg/ml，則需要用人(或相應(yīng)的動(dòng)物)空白血漿稀釋，然后重新測(cè)定以使樣品的響應(yīng)在標(biāo)樣曲線的線性范圍內(nèi)(0.05-10μg/ml)。應(yīng)該把內(nèi)推法氨基胍濃度少于0.05μg/ml的樣品稱為“NR”(不能報(bào)告的)，在進(jìn)一步計(jì)算中(如藥物動(dòng)力學(xué)，統(tǒng)計(jì)學(xué)等)作為零對(duì)待。
這個(gè)研究的結(jié)果表明，這個(gè)發(fā)展的高壓液相色譜分析方法的具有重復(fù)性，準(zhǔn)確和穩(wěn)定，對(duì)于三組所有血漿樣品的總平均變差系數(shù)(精度)少于10%，總平均準(zhǔn)確度在理論值的4%之內(nèi)。分析穩(wěn)定性經(jīng)兩個(gè)分析者在三天的確認(rèn)期間非常好的結(jié)果，是很好的證明，在其中可檢測(cè)加合物，對(duì)一整天看來(lái)是穩(wěn)定的，從而可使或批樣品的處理簡(jiǎn)化和高生產(chǎn)率地分析，利用人血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線可成功地分析動(dòng)物血漿的氨基胍濃度對(duì)于采用這個(gè)程序的未來(lái)的分析者可以予期得到10%的精度和5%的準(zhǔn)確度標(biāo)準(zhǔn)。
總之，本分析方法在人、狗和鼠血漿中令人滿意地被確認(rèn)。
例2這個(gè)試驗(yàn)計(jì)劃按照類似于例1的方案進(jìn)行，以便進(jìn)一步證實(shí)本分析方法對(duì)于尿樣品測(cè)定的準(zhǔn)確度、可操作性。兩個(gè)分析者利用一個(gè)HPLC系系統(tǒng)，獨(dú)立繪制一人尿標(biāo)樣曲線和對(duì)四個(gè)已知的質(zhì)量對(duì)照樣品反復(fù)四次作高壓液相色譜分析，每個(gè)工作日連續(xù)二天以便完成特定的分析操作規(guī)范。
分析方法1、樣品制備將0.5ml工作內(nèi)標(biāo)溶液(在7.5%三氯乙酸中10μg/mlN-乙基氨基胍甲苯磺酸鹽)和在干凈螺旋塞培養(yǎng)管中0.5ml的含水(10mg/ml)溶液的反應(yīng)試劑(6-乙基-2-吡啶-羰基醛)加到0.5ml的尿樣品中。將樣品蓋緊，旋渦(10秒)然后在加熱器(95°-100℃)上反應(yīng)10分鐘，在冷卻后將樣品輸送到一個(gè)高壓液相色譜儀的管瓶中，從中50μl一份被注射用于高壓液相色譜儀分析用。
2、色譜法利用一個(gè)Waters Associates Model 510泵并帶有一個(gè)徑向加壓的柱(Waters Novapak CN，8mm×10cm，4μm顆粒大小)和一個(gè)氰基(Waters Resolve Guard-Pak CN)前置柱。用可變紫外光檢測(cè)器(Waters 484)在302μm波長(zhǎng)檢測(cè)樣品的成份。移動(dòng)相包括(體積比)10%乙腈10%的甲醇各0.01M的1-庚磺酸和磷酸-鈉80%。在整個(gè)試驗(yàn)中，借助磁攪拌器緩慢地?cái)嚢枰苿?dòng)相防止有機(jī)溶劑分配。保持均勻的流速2.0ml/分，在室溫下。經(jīng)一個(gè)可編程的取樣器順序自動(dòng)注入樣品(Waters WISP 712)。
3、數(shù)據(jù)分析利用Waters Maxima 820色譜操作臺(tái)收集所有數(shù)據(jù)，由分析者利用線性試驗(yàn)校正藥劑峰高和內(nèi)部標(biāo)樣峰高的比值同在標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)成日常的方法標(biāo)準(zhǔn)化中加入尿中的濃度關(guān)系，從線性回歸線內(nèi)插法來(lái)確定在質(zhì)量對(duì)照和未知的被測(cè)定樣品中的氨基胍濃度。
結(jié)果和討論以天為基準(zhǔn)，被觀察到的線性(r＞0.998，p＜0.01)是在游離氨基胍的濃度0-100μg/ml的范圍內(nèi)，最低標(biāo)準(zhǔn)樣品(0.5μg/ml)可以被穩(wěn)定檢測(cè)出。圖3匯總了從這個(gè)研究中標(biāo)樣曲線數(shù)據(jù)，并示出了平均峰高比響應(yīng)同血漿濃度關(guān)系曲線。和例1相同，由兩個(gè)分析者在這次研究中得到的標(biāo)樣曲線基本上是可重疊的，因此總平均數(shù)據(jù)繪制成曲線。
從色譜的觀點(diǎn)來(lái)看，6-甲基甲基吡啶醛脒基腙(AGH)和6-甲基甲基吡啶醛-N-乙基脒基腙(NEH)，在同甲基吡啶醛(6-甲基-2-吡啶-羰基醛)反應(yīng)期間生成的這兩種加合物易于彼此或從內(nèi)生干擾物中分離出來(lái)。圖4示出人的空白尿的色譜，一個(gè)低濃度(1.0μg/ml)質(zhì)量對(duì)照樣品的色譜和一個(gè)高濃度(90μg/ml)質(zhì)量對(duì)照樣品的色譜。
和例1的分析結(jié)果相同，如用標(biāo)樣樣品予先質(zhì)量對(duì)照試驗(yàn)同標(biāo)準(zhǔn)樣品曲線以后質(zhì)對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)的關(guān)系所示，二者隨時(shí)間的在每個(gè)試驗(yàn)結(jié)果中記下了較小不同。引起這些變化可能是由于在夜間試驗(yàn)中試驗(yàn)室溫度波動(dòng)引起的，這些可能的溫度波動(dòng)對(duì)保留時(shí)間有很大的影響，然而感興趣的峰仍能有效地彼此以及與其他無(wú)關(guān)峰分開(kāi)，這些峰容易檢測(cè)和積分。和例1相同，這些問(wèn)題將通過(guò)在整個(gè)試驗(yàn)中分散標(biāo)樣和質(zhì)量對(duì)照樣品最終得到平衡，因而對(duì)這個(gè)研究，對(duì)所有標(biāo)樣點(diǎn)進(jìn)行回歸分析可以充分模擬結(jié)果。
人尿的質(zhì)量對(duì)照樣品(對(duì)于質(zhì)量對(duì)照樣品A-D游離氨基胍的濃度分別為1.0，8.0，40和90μg/ml)結(jié)果匯總在下面的表Ⅱ中。

誤差%＝100%×(觀測(cè)濃度-理論濃度)/理論濃度QC＝質(zhì)量對(duì)照利用m′(強(qiáng)制通過(guò)原點(diǎn)的回歸斜率n＝14)計(jì)算質(zhì)量對(duì)照的濃度以便獲得最大的準(zhǔn)確度。為確定未知的濃度，所給出的全部結(jié)果是用m′表示的。根據(jù)變差系數(shù)(用體積百分濃度)在所研究的濃度范圍(1.0-40μg/ml)測(cè)量的精度的范圍為1.8%到6.8%(總平均＝4.9%。用與理論濃度的百分誤差測(cè)量的準(zhǔn)確度的范圍為-6.7%到15.5%(總平均＝4.8%)這對(duì)于生物分析觀點(diǎn)來(lái)說(shuō)已是相當(dāng)令人滿意的結(jié)果了。
在現(xiàn)行的分析條件下，如被分析樣品的游離氨基胍的濃度超過(guò)100μg/ml，則應(yīng)用人(或相應(yīng)的動(dòng)物)空白尿來(lái)稀釋，然后重新分析，以便使樣品的響應(yīng)在標(biāo)樣曲線的線性范圍(0.5-100μg/ml)內(nèi)。對(duì)內(nèi)推的氨基胍濃度小于0.5μg/ml樣品應(yīng)該被認(rèn)為“NR”(不報(bào)告)在進(jìn)一步計(jì)算中(如藥物動(dòng)力學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué))以零對(duì)待。
這個(gè)研究的結(jié)果進(jìn)一步證明了本分析方法是可重復(fù)的，準(zhǔn)確的和穩(wěn)定的，以及對(duì)尿樣品是適用的。對(duì)人尿的總平均變差(精度)系數(shù)小于5%，總平均準(zhǔn)確度在理論濃度5%以內(nèi)。分析的穩(wěn)定性兩個(gè)試驗(yàn)者在兩天確認(rèn)期間所得到的結(jié)果證明是優(yōu)良的。在其中可檢測(cè)的加合物在一整天中看來(lái)是穩(wěn)定的，這樣就便于樣品的成批處理和高生產(chǎn)率的分析。予計(jì)利用這個(gè)確認(rèn)程序的未來(lái)分析者可以期望得到5%的精度和5%準(zhǔn)確度的標(biāo)準(zhǔn)。
例3為了說(shuō)明本方法在測(cè)量腎功能中的應(yīng)用，使一組19個(gè)試驗(yàn)對(duì)象服用總劑量為300mg的鹽酸氨基胍。在病人服用這個(gè)總劑量后，按照規(guī)定的服用后10小時(shí)，14小時(shí)和18小時(shí)，依次從每個(gè)病人處取出血漿樣品，這些血漿被取出后，按例1的操作方案進(jìn)行處理再用本發(fā)明的方法分析。
首先將這此樣品同一定量的在7.5%三氯乙酸中N-乙基氨基胍甲苯磺酸鹽內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)工作溶液相混合，將得到的試樣經(jīng)10秒鐘旋渦處理，然后在14000rpm速度下離心分離10分鐘。將得到的上層清液倒入裝有0.1ml含水溶液(10μg/ml)的6-甲基吡啶醛的培養(yǎng)管中。再將這些樣品用蓋子蓋緊，在加熱器上反應(yīng)10分鐘，待冷卻后，轉(zhuǎn)移到高壓液相色譜的管瓶中，從管瓶把等分的樣品供給高壓液相色譜分析。
利用一個(gè)等流量在離子對(duì)條件下的徑向加壓的色譜柱，測(cè)量是借助一個(gè)可變紫外檢測(cè)器在波長(zhǎng)302nm完成的，利用所獲得數(shù)據(jù)并通過(guò)下式，把計(jì)算的消除率轉(zhuǎn)換為消除半衰期數(shù)據(jù)。
T1/2＝0、6931/Kelim然后，把這些數(shù)據(jù)相對(duì)于用放射性示蹤法測(cè)量的病人腎小球?yàn)V過(guò)率繪制成曲線，利用二者之間最后的線性關(guān)系式根據(jù)公式T1/2＝-0.14GFR+22.04(r＝0.875，n＝18)計(jì)算腎小球?yàn)V過(guò)率。然后對(duì)每個(gè)病人推導(dǎo)出T1/2和GFR的對(duì)應(yīng)數(shù)值，這些數(shù)值列在下面表Ⅲ中表Ⅲ病人 GFR 氨基胍T1/21 12.8 24.592 52.4 14.193 116.3 3.83
4 44.1 21.755 31.1 19.046 80.5 6.787 26.7 14.838 12.1 24.919 117.2 4.7310 148.9 3.9411 111.9 6.8212 103.8 6.0813 41.6 14.9214 39.2 9.5415 113.2 4.8116 82.2 6.0318 131.3 7.0519 131.1 6.46此外，這些數(shù)據(jù)被整理成表格形式，并示在圖5中，從這些列出的數(shù)據(jù)中可以發(fā)現(xiàn)十分一致和一個(gè)線性關(guān)系存在，可以測(cè)定氨基胍的消除以及確定相應(yīng)的正常腎功能。因而氨基胍T1/2值在腎功能中用作鑒定反常，根據(jù)這個(gè)腎功能結(jié)果可以確定腎損傷和/或潛在的病理狀態(tài)。
本發(fā)明可以包括另外的形式或在不背離本發(fā)明的精神或主要特征的條件下通過(guò)其它方法完成。因此，本說(shuō)明書只是為對(duì)所有的方面進(jìn)行說(shuō)明，而不是對(duì)這些方案的限定。本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求書限定，所有的在相等意義和范圍內(nèi)變化都應(yīng)在本發(fā)明范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種分析氨基胍及其類似物的方法，它包括A、收集確信包含有氨基胍或其類似物的生物樣品；B、脫去該生物樣品中的蛋白質(zhì)；C、使在步驟B中脫去蛋白質(zhì)的生物樣品同足夠量的吡啶醛反應(yīng)，以使在該生物樣品中的氨基胍或其類似物全部生成相應(yīng)的吡啶醛一取代腙；D、借助于利用均勻或梯度洗脫的高壓液相色譜法從步驟C中生成的反應(yīng)混合物的剩余物中分離全部取代腙；E、檢測(cè)步驟D中的分離物，以便估價(jià)該氨基胍和/或類似物的數(shù)量和分布。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該生物樣品可以從血漿、尿和組織中選取。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該生物樣品根據(jù)一個(gè)已知相等含量的內(nèi)標(biāo)來(lái)制備。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，該內(nèi)標(biāo)可以從氨基胍和其類似物中選取。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，該內(nèi)標(biāo)由氨基胍組成。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，該內(nèi)標(biāo)由N-乙基氨基胍組成。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該生物樣品用從中等強(qiáng)度酸到強(qiáng)酸、以及可以沉淀蛋白質(zhì)的有機(jī)溶劑中選取的脫去蛋白質(zhì)試劑處理，來(lái)脫去蛋白質(zhì)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，該酸從高氯酸和三氯乙酸中選取。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，該有機(jī)溶劑從甲醇、乙腈和二氯甲烷中選取。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該生物樣品通過(guò)使該樣品經(jīng)超過(guò)濾處理來(lái)脫去蛋白質(zhì)。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該吡啶醛是甲基吡啶醛。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，該吡啶醛是6-甲基甲基吡啶醛。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟C是在中等強(qiáng)度酸的條件下完成的。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟D的高壓液相色譜法的方案是利用徑向壓縮色譜柱和等流量以及離子對(duì)條件下進(jìn)行。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟E的檢驗(yàn)包括用紫外分光光譜在302nm波長(zhǎng)分析分離出物質(zhì)，檢測(cè)所有的氨基胍和/或其類似物。
16.用于完成分析氨基胍及其類似物的測(cè)試器材箱，包括A、一定數(shù)量的用于和可得到的氨基胍或類似化合物反應(yīng)的吡啶醛;B、用在高壓液相色譜中的其它試劑和固定液;C、使用這些器材的指南。
17.如權(quán)利要求16所述的測(cè)試器材箱，進(jìn)一步包括一定數(shù)量用于脫去該生物樣品中蛋白質(zhì)的試劑。
18.如權(quán)利要求16所述的測(cè)試器材箱，包括一個(gè)從氨基胍及其類似物中選定的內(nèi)標(biāo)。
19.如權(quán)利要求18所述的測(cè)試器材箱，其特征在于該內(nèi)標(biāo)是氨基胍。
20.如權(quán)利要求18所述的測(cè)試器材箱，其特征在于該內(nèi)標(biāo)是N-乙基氨基胍。
21.如權(quán)利要求16所述的測(cè)試器材箱，其特征在于借助于從由中等強(qiáng)度酸到強(qiáng)酸，以及可以沉淀蛋白質(zhì)的有機(jī)溶劑中選取脫去蛋白質(zhì)試劑來(lái)脫去該生物樣品中的蛋白質(zhì)。
22.如權(quán)利要求21所述的測(cè)試器材箱，其特征在于該酸從高氯酸和三氯乙酸中選取。
23.如權(quán)利要求21所述的測(cè)試器材箱，其特征在于該有機(jī)溶劑從甲醇、乙腈和二氯甲烷中選取。
24.如權(quán)利要求16所述的測(cè)試器材箱，其特征在于該生物樣品是超過(guò)濾處理該樣品來(lái)脫去蛋白質(zhì)的。
25.如權(quán)利要求16所述的測(cè)試器材箱，其特征在于該吡啶醛是甲基吡啶醛。
26.如權(quán)利要求16所述的測(cè)試器材箱，其特征在于該吡啶醛是6-甲基甲基吡啶醛。
27.用于測(cè)量腎功能的權(quán)利要求16所述的測(cè)試器材箱，還包括一定數(shù)量的予先確定的適合于試驗(yàn)對(duì)象服用劑型的氨基胍或其類似物;一個(gè)商值曲線或表格形式的連續(xù)集，該商值是根據(jù)氨基胍或其類似物的消除半衰期(T1/2)與腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)的比率得出的，據(jù)此可以向診斷者和臨床醫(yī)生提供解釋腎功能測(cè)試結(jié)果。
28.如權(quán)利要求27所述的測(cè)試器材箱，該預(yù)先確定的劑型是口服劑型。
29.如權(quán)利要求28所述的測(cè)試器材箱，其特征在于該口服劑型是從藥丸、糖果劑、膠囊、糖衣丸、甘香酒劑、糖漿中選取的。
30.如權(quán)利要求29所述的測(cè)試器材箱，其特征在于該口服劑型含有300mg鹽酸氨基胍或其類似物。
31.一種監(jiān)測(cè)哺乳動(dòng)物腎功能的方法，包括服用由氨基胍和其類似物中選取的主試劑一確定劑量，在規(guī)定的時(shí)間間隔從所述哺乳動(dòng)物收集血漿樣品，檢驗(yàn)這些樣品，以便確定該主試劑的存在和分布。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，還包括(1)用下述方法檢驗(yàn)這些樣品A、收集確信含有氨基胍或其類似物的生物樣品;B、脫去該生物樣品中的蛋白質(zhì);C、使在步驟B中脫去了蛋白質(zhì)的生物樣品同足量的吡啶醛反應(yīng)，以便使在該生物樣品中的氨基胍或其類似物全部轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的吡啶醛-取代腙;D、借助于使用均勻或梯度洗脫的高壓液相色譜法從步驟C中反應(yīng)混合物的剩余物中分離出形成的所有取代腙;E、檢驗(yàn)在步驟D中的分離出的物質(zhì)，以便估價(jià)所述氨基胍和/或其類物的數(shù)量和分布;(2)根據(jù)所得結(jié)果確定氨基胍和/或其類物的消除半衰期;以及(3)把這些確定的消除數(shù)據(jù)與從各種已知腎功能的哺乳動(dòng)物得到氨基胍的消除數(shù)據(jù)圖或表格連續(xù)集比較。
33.完成權(quán)利要求31所述方法的測(cè)試器材箱包括A、從氨基胍和其類似物中選取的一種主試劑的固定劑量;B、其他試劑和固定液;C、這些器材的使用說(shuō)明。
34.一種檢測(cè)與腎功能改變有關(guān)疾病的出現(xiàn)或存在的方法，包括完成權(quán)利要求31或32的方法。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于該疾病是腎病和糖尿病。
36.一種監(jiān)測(cè)抑制過(guò)強(qiáng)的糖基化最終產(chǎn)物在人體中生成的藥物療效的方法，包括完成權(quán)利要求1的方法。
37.一種篩選可以抑制在人體內(nèi)過(guò)強(qiáng)糖基化最終產(chǎn)物形成的新化合物培育的生物樣品，確定吸收、分布、代謝和/或排泄的簡(jiǎn)況，并用權(quán)利要求1的方法檢驗(yàn)該樣品。
全文摘要
公開(kāi)了用于檢測(cè)和測(cè)量在生物樣品中氨基胍和其類似物的存在和數(shù)量的方法和包括試驗(yàn)器材箱的有關(guān)材料。生物樣品包括血漿、尿或組織。本方法可以用于確定氨基胍和其類似物的活性和效果，物別是對(duì)這些材料用作防止過(guò)強(qiáng)的蛋白質(zhì)糖化作用的試劑程度。本發(fā)明擴(kuò)展到新藥分析、適用的試驗(yàn)器材箱，并擴(kuò)展到評(píng)價(jià)腎功能和幫助在腎機(jī)能障礙是癥狀的潛在病狀的診斷中的可能性。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1055063SQ9110178
公開(kāi)日1991年10月2日 申請(qǐng)日期1991年2月20日 優(yōu)先權(quán)日1990年2月20日
發(fā)明者彼得·C·烏爾里希, 齊·M·盧克 申請(qǐng)人:杰里科技有限公司