Kromasil C18-5色譜柱（4. 6X 150mm，10 μ m)，流動(dòng)相A :去離子水(含0. 1%三氟乙酸)，流 動(dòng)相B :乙腈(含0. 1%三氟乙酸)，梯度設(shè)置：起始梯度A95%-B5%，終止梯度A60%-B40%，流速 12mL/min，分離時(shí)間50min。檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，分2mL進(jìn)樣，檢測(cè)各組分的抗氧化活性，收集 活性最高的RPTE2-2-4組分，冷凍干燥24h，放置備用。
[0021] (3)抗氧化肽反向色譜-Triple TOF分析及檢索：將凍干的RPTE2-2-4組分重新 溶解于 Nano-RPLC Buffer A 中。在線 Nano-RPLC 液相色譜在 Eksigent nanoLC-Ultra? 2D系統(tǒng)中進(jìn)行，溶解后的樣品以2yL/min的流速上樣到C18預(yù)柱上（100ymX3cm，C18， 3以111，15(^)，然后保持流速?zèng)_洗脫鹽1〇1^11。分析柱是(：18反相色譜柱（75以11^15〇11(：18- 3 μπι 120 A)，實(shí)驗(yàn)所用梯度為90min內(nèi)流動(dòng)相B由5%升高至35%。質(zhì)譜采用Triple TOF 5600系統(tǒng)結(jié)合納升噴霧III離子源，噴霧電壓為2.5 kV，氣簾氣壓為30PSI，霧化氣壓為 5PSI，加熱器溫度為150°C，質(zhì)譜掃描方式為信息依賴的采集工作模式下（IDA，Information Dependent Analysis), 一級(jí)T0F-MS單張圖譜掃描時(shí)間為250ms，每次IDA循環(huán)下最多采 集35個(gè)電荷為2+到5+且單秒計(jì)數(shù)大于150的二級(jí)圖譜，每次循環(huán)時(shí)間固定為2. 5秒， 碰撞室能量設(shè)定適用于所有前體離子碰撞誘導(dǎo)解離（CID)，動(dòng)態(tài)排除設(shè)置為18秒，約等于 色譜半峰寬。數(shù)據(jù)處理采用Mascot 2. 3軟件進(jìn)行，數(shù)據(jù)庫(kù)為菲律賓蛤仔數(shù)據(jù)庫(kù)，酶為胰 蛋白酶，允許最大漏切位點(diǎn)為2 ;固定修飾為：Carbamidomethyl (C);可變修飾為：Acetyl (Protein-term)、Deamidated (NQ)、Dioxidation (W)、Oxidation (M)、Phospho (ST)和 Phospho (Y) ;MS 容差為 ± 15ppm，MSMS 容差為 ±0. 15Da，Protein score C. I. % 大于 95% 為鑒定成功。菲律賓蛤仔數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果得到抗氧化肽的氨基酸序列為：Leu-Phe-Lys-Ly s-Asn-Leu-Leu-Thr-Leu 〇
[0022] 實(shí)施例2 (1)抗氧化肽的酶解制備：將活菲律賓蛤仔用清水清洗后，去殼取肉，打漿。按料液比 1 : 4加入pH值為7.5,濃度為0.01m〇l/L磷酸鹽緩沖溶液，加入胰蛋白酶5400U/g于55°C 下酶解3小時(shí)，然后再在95°C下滅酶5min，將得到的酶解液在8000rpm下離心10min，得到 的上清液即為菲律賓蛤仔酶解液； 抗氧化肽的分離純化：將酶解液用Sephadex G-25凝膠層析分離，以純水為洗脫劑，在 280nm下檢測(cè)，流速為3mL/min，檢測(cè)各組分的抗氧化活性，收集活性最高的RPTE2組分，冷 凍干燥后用去離子水配成80mg/mL溶液，用Sephadex G-15凝膠層析進(jìn)一步分離，以純水 為洗脫劑，在280nm下檢測(cè)，流速為I. 5mL/min，檢測(cè)各組分的抗氧化活性，收集活性最高的 RPTE2-2組分；其余步驟按照實(shí)施例1同樣的實(shí)施方式進(jìn)行，菲律賓蛤仔數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果得 到抗氧化肽的氨基酸序列為：Leu-Phe-Lys-Lys-Asn-Leu-Leu-Thr-Leu。
[0023] 實(shí)施例3 (1)抗氧化肽的酶解制備：將活菲律賓蛤仔用清水清洗后，去殼取肉，打漿。按料液比 1 : 6加入pH值為7. 5,濃度為0.01m〇l/L磷酸鹽緩沖溶液，加入胰蛋白酶6600U/g于45°C 下酶解4小時(shí)，于97°C下滅酶5min，將得到的酶解液在8000rpm下離心10min，得到的上清 液即為菲律賓蛤仔酶解液； 抗氧化肽的分離純化：將酶解液用Sephadex G-25凝膠層析分離，以純水為洗脫劑，在 280nm下檢測(cè)，流速為I. 5mL/min，檢測(cè)各組分的抗氧化活性，收集活性最高的RPTE2組分， 冷凍干燥后用去離子水配成65mg/mL溶液，用Sephadex G-15凝膠層析進(jìn)一步分離，以純 水為洗脫劑，在280nm下檢測(cè)，流速為lmL/min，檢測(cè)各組分的抗氧化活性，收集活性最高的 RPTE2-2組分；其余步驟按照實(shí)施例1同樣的實(shí)施方式進(jìn)行，菲律賓蛤仔數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果得 到抗氧化肽的氨基酸序列為：Leu-Phe-Lys-Lys-Asn-Leu-Leu-Thr-Leu。
[0024] 圖1為S印hadex G-25凝膠過(guò)濾色譜分離純化抗氧化肽圖譜，其中圖Ia為色譜 分離洗脫曲線，圖Ib為抗氧化活性測(cè)定圖。由圖1可知，組分RPTE2活性最高。圖2為 Sephadex G-15凝膠過(guò)濾色譜分離純化抗氧化肽圖譜，其中圖2a為色譜分離洗脫曲線，圖 2b為抗氧化活性測(cè)定圖。由圖2可知，組分RPTE2-2活性最高。圖3為制備型高效液相色 譜分離純化抗氧化肽圖譜，其中圖3a為色譜分離洗脫曲線，圖3b為抗氧化活性測(cè)定圖。由 圖3可知，組分RPTE2-2-4活性最高。圖4為抗氧化肽的離子流圖。圖5為抗氧化肽二級(jí) 質(zhì)譜圖。圖6為抗氧化肽Leu-Phe-Lys-Lys-Asn-Leu-Leu-Thr-Leu的擬合生成的質(zhì)譜圖。
[0025] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種菲律賓蛤仔抗氧化肽，其特征在于：所述菲律賓蛤仔抗氧化肽氨基酸序列為L(zhǎng)e u-Phe-Lys-Lys-Asn-Leu-Leu-Thr-Leu〇2. -種如權(quán)利要求1所述的菲律賓蛤仔抗氧化肽制備方法，其特征在于：包括如下步 驟： (1) 抗氧化肽的酶解制備； (2) 抗氧化肽的分離純化； (3) 抗氧化肽反向色譜-Triple TOF分析及檢索。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的菲律賓蛤仔抗氧化肽制備方法，其特征在于：所述抗氧化肽 的酶解制備：將活菲律賓蛤仔用清水清洗后，去殼取肉，打漿；按料液比1 : 3~1 : 7加入 pH值為7. 5、濃度為0.0 lmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，加入胰蛋白酶5400~6600U/g于45~55°C 下酶解3~4h，于95~100°C下滅酶5min，將得到的酶解液在8000rpm下離心10min，得到的上 清液即為菲律賓蛤仔酶解液。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的菲律賓蛤仔抗氧化肽制備方法，其特征在于：所述抗氧化肽 的分離純化：采用Sephadex G-25凝膠層析分離純化酶解液，以純水為洗脫劑，在280nm下 檢測(cè)，檢測(cè)得到各組分的抗氧化活性，收集活性最高的組分，冷凍干燥后用去離子水配成溶 液，進(jìn)一步用Sephadex G-15凝膠層析分離，以純水為洗脫劑，在280nm下檢測(cè)，檢測(cè)各組 分的抗氧化活性，收集活性最高的組分；將活性最高的組分經(jīng)制備型液相色譜分離，液相色 譜的色譜條件為：Kromasil C18-5色譜柱，流動(dòng)相A :含0. 1%三氟乙酸去離子水，流動(dòng)相 B :含0. 1%三氟乙酸乙腈，梯度設(shè)置：起始梯度A95%-B5%，終止梯度A60%-B40%，流速12mL/ min，分離時(shí)間50min ;檢測(cè)波長(zhǎng)214nm，分]~3mL進(jìn)樣，收集各組分并檢測(cè)各組分的抗氧化活 性，收集活性最高的組分，冷凍干燥24h，放置備用。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的菲律賓蛤仔抗氧化肽制備方法，其特征在于：所述抗氧化肽 反向色譜-Triple TOF分析及檢索：將凍干的多肽樣品重新溶解于納升反向色譜流動(dòng)相A 中，在線Nano-RPLC液相色譜在Eksigent nanoLC-Ultra? 2D系統(tǒng)進(jìn)行，溶解后的樣品以 2 y L/min的流速上樣到C18預(yù)柱上，然后保持流速?zèng)_洗脫鹽IOmin ;分析柱是C18反相色譜 柱，實(shí)驗(yàn)所用梯度為90min內(nèi)流動(dòng)相B由5%升高至35%，納升反向色譜流動(dòng)相A :0.1 wt. %甲 酸，2wt. %乙腈，納升反向色譜流動(dòng)相B :0.1 wt. %甲酸，98wt. %乙腈。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種菲律賓蛤仔抗氧化肽極其制備方法，所述菲律賓蛤仔抗氧化肽氨基酸序列為L(zhǎng)eu-Phe-Lys-Lys-Asn-Leu-Leu-Thr-Leu，通過(guò)抗氧化肽的酶解制備、抗氧化肽的分離純化、抗氧化肽反向色譜-Triple TOF分析及檢索獲得抗氧化肽。本發(fā)明所用原料為菲律賓蛤仔肉，來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，現(xiàn)在將其作為原料，開發(fā)成抗氧化肽，升值幅度是相當(dāng)可觀的。本發(fā)明提供的抗氧化肽活性很強(qiáng)，不僅可以用作食品添加劑，也可以作為功能性成分，用于保健品、化妝品及護(hù)膚品中。
【IPC分類】G01N30/02, C12P21/06, C07K7/06, C07K1/16
【公開號(hào)】CN104974224
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510403292
【發(fā)明人】程文健, 劉文釗, 張惠婷, 趙卉雙, 鐘機(jī), 陳麗嬌
【申請(qǐng)人】福建農(nóng)林大學(xué)
【公開日】2015年10月14日
【申請(qǐng)日】2015年7月11日