本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)檢測和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及腫瘤干細胞cd133特異性靶向多肽篩選及其作為藥物載體的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤是嚴(yán)重危及人類生命的疾病之一，近幾十年來，世界范圍內(nèi)腫瘤的發(fā)病率和病死率越來越高?，F(xiàn)在對于多數(shù)惡性腫瘤可以采用手術(shù)、化療與放射、靶向和免疫治療等方法能夠殺滅大部分腫瘤細胞，但絕大多數(shù)腫瘤患者仍無法獲得根治，容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，惡性腫瘤患者的生存時間和生活質(zhì)量始終較低。2001年，腫瘤干細胞(cancerstemcell，csc)這一概念被正式提出。腫瘤干細胞(csc)假說認(rèn)為腫瘤組織中存在極少量的瘤細胞充當(dāng)著干細胞的角色，它們具有自我更新能力、無限增殖能力和高致瘤性等特點，使得腫瘤組織中具有自我更新能力的腫瘤細胞的數(shù)量不斷增加，腫瘤組織能夠不斷增大且能驅(qū)動腫瘤的形成和生長。除此之外，csc還有以下特性，比如還(1)具有抗凋亡特性，csc高度表達抗凋亡基因bcl-2；(2)具有端粒酶活性；(3)耐藥性,csc膜表面表達多種abc轉(zhuǎn)運蛋白，可以利用atp水解提供的能量把藥物泵出細胞外。由此可見，對腫瘤干細胞展開深入研究確實對于推進腫瘤防治有至關(guān)重要的意義。因此，消除cscs是具有挑戰(zhàn)性的，但它是成功根除腫瘤所必需的。盡管csc的發(fā)現(xiàn)使人們對腫瘤有了進一步的認(rèn)識，但距離徹底治愈腫瘤還是有很長的路要走。然而，由于缺乏檢測，定位和非侵入性的量化檢測技術(shù)，阻礙了csc在臨床患者中的調(diào)查研究。具體來說，還沒有報道用臨床相關(guān)的成像探針(例如，結(jié)合csc特異性細胞表面蛋白的抗體或其他配體)對csc成功進行非侵入性的成像操作。癌干細胞(cscs)被認(rèn)為是對許多惡性腫瘤的生長和傳播以及治療后的復(fù)發(fā)的負(fù)責(zé)。因此，csc的無創(chuàng)成像方法可能對腫瘤診斷和治療監(jiān)測產(chǎn)生深遠的影響。但是，臨床仍然缺乏可用于非侵入性csc成像的方法。因此，當(dāng)前的工作應(yīng)著重于發(fā)展多種測定方法對盡可能多的csc進行有效分析，并對其靶向治療，對目前腫瘤的診斷、預(yù)防和治療可能會具有重要的意義。尋找特異性的表面標(biāo)記物，通過其分選腫瘤干細胞，是進一步研究腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后的關(guān)鍵。因此，腫瘤治療應(yīng)當(dāng)針對腫瘤干細胞，通過特異表面標(biāo)記分選腫瘤干細胞是研究其生長特點的前提。cd133也稱為prominin-1，是高度糖基化的五次跨膜膜糖蛋白，其與質(zhì)膜中的膽固醇結(jié)合。人cd133基因位于4號染色體，包含至少37個外顯子。cd133蛋白為細胞膜蛋白超家族成員，含有865個氨基酸、分子量約為120kd的糖蛋白。其分子結(jié)構(gòu)包括：細胞外nh2-端，2個大的胞外環(huán)狀結(jié)構(gòu)，5次跨膜結(jié)構(gòu)域，2個小的富含半胱氨酸胞內(nèi)環(huán)狀結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)的-cooh結(jié)構(gòu)(zhangetal,chinesejournalofcancer,2010,29,3)。cd133是人類干/祖細胞膜上發(fā)現(xiàn)的一種跨膜糖蛋白抗原，常表達于神經(jīng)原始細胞、上皮/內(nèi)皮祖細胞譜系、造血干/祖細胞等，是目前用來標(biāo)記或分選干/祖細胞的最常用的膜表面標(biāo)志。越來越多的證據(jù)表明cd133已經(jīng)成為眾多腫瘤干細胞表面的特異標(biāo)記分子，cd133蛋白不僅僅在神經(jīng)干細胞、表皮干細胞等干細胞中有表達，在白血病干細胞、大腸癌干細胞、腦腫瘤干細胞等多種腫瘤干細胞中都有表達。研究表明，cd133強表達的肝癌患者生存期明顯較cd133弱表達組的短，cd133的表達與hcc患者的總生存期相關(guān)，細胞質(zhì)表達cd133是影響hcc患者總生存的非常顯著的危險因素。檢測肝癌患者外周血cd133表達，分析其與臨床病理特征、腫瘤遠端轉(zhuǎn)移等的相互關(guān)系，具有重要的臨床意義。cd133+腫瘤細胞與腫瘤的自我更新、分化潛能、信號傳導(dǎo)調(diào)控、藥物耐受、復(fù)發(fā)和預(yù)后等均有相關(guān)性。cd133+細胞有望在干細胞相關(guān)疾病的治療和腫瘤靶向治療中發(fā)揮巨大作用。cd133作為多種腫瘤共同的細胞表面標(biāo)志物，通過cd133特異性分選干細胞，將更有助于我們研究腫瘤干細胞的生物學(xué)特性、信號傳導(dǎo)通路和耐放化療機制。同時，將有可能以cd133作為靶向治療腫瘤的靶點，為腫瘤治療帶來重大突破。脂質(zhì)體(liposome)是一種人工生物膜，其在水中親水頭部會進入水中，疏水尾部會伸向空氣中，并通過攪動后會形成具有雙層磷脂分子的球形。脂質(zhì)體對細胞膜親和性好，作為藥物的載體具有靶向、高效、緩釋、副作用小等特點，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。脂質(zhì)體作為藥物的載體，能達到藥物制劑在治療上的很多要求，擁有很多優(yōu)點。但普通脂質(zhì)體作為藥物載體主要是通過被動靶向?qū)⑺幬镞\輸?shù)讲≡畈课?。為了減少藥物用量，提高治療效果，主動靶向的給藥方法成為研究的熱點。將小分子多肽修飾到脂質(zhì)體表面，能夠增強脂質(zhì)體顆粒的腫瘤靶向性，增強腫瘤藥物的定向運輸，對增強腫瘤治療效果具有重要的研究意義?；诩{米技術(shù)的藥物遞送系統(tǒng)可以克服傳統(tǒng)化療藥物穩(wěn)定性差、特異性低和毒性高等缺點，其獨特的尺寸效應(yīng)可將納米藥物載體負(fù)載的化療藥物通過高通透性和滯留效應(yīng)效應(yīng)在腫瘤組織富集。因此，構(gòu)建腫瘤靶向遞藥系統(tǒng)，降低化療藥物對正常器官的損害，增強化療藥物在腫瘤實質(zhì)中的滲透性越來越引起研究者的關(guān)注。腫瘤干細胞被認(rèn)為在腫瘤維持，轉(zhuǎn)移，腫瘤治療中起關(guān)鍵作用抵抗和復(fù)發(fā)。因此，有必要開發(fā)非侵入性體內(nèi)檢測癌癥干細胞的方法實現(xiàn)對csc的動態(tài)監(jiān)測。然而，csc通常只能構(gòu)成腫瘤細胞的一小部分，存在數(shù)量極少，很難被發(fā)現(xiàn)和捕獲。分子影像在免疫治療和個性化醫(yī)學(xué)中發(fā)揮越來越重要的作用。其中分子探針的制備是分子影像的關(guān)鍵，只有高靈敏度和特異性的分子探針引入體內(nèi)后可與細胞內(nèi)特定的靶分子發(fā)生特異性結(jié)合并產(chǎn)生某種信號，體外通過特定的影像設(shè)備，如：正電子發(fā)射計算機斷層掃描(pet-ct)、單光子發(fā)射計算機斷層成像術(shù)(spect)、磁共振成像(mri)以及化學(xué)發(fā)光設(shè)備等進行采集成像，從而達到特異性診斷的才能實現(xiàn)高度特異性的診斷。因此，急需開發(fā)高靈敏度和高特異的分子探針。當(dāng)前的用于檢測和靶向cd133陽性癌癥干細胞的組織病理學(xué)技術(shù)是基于抗cd133抗體。使用臨床相關(guān)示蹤劑觀察腫瘤干細胞的技術(shù)可能對癌癥診斷和治療有廣泛的影響，cd133目前是許多顱內(nèi)和顱外實體腫瘤表現(xiàn)最好的腫瘤干細胞標(biāo)記之一(gaedickeetal,pnas,2014,111(6),e692)。盡管最近有一些關(guān)于使用單克隆抗體對csc標(biāo)記物表達腫瘤細胞進行成像和治療靶向的報道，但迄今為止還沒有報道關(guān)于csc或表達csc標(biāo)記物的靶向多肽用于腫瘤的非侵入性體內(nèi)成像和靶向治療。但由于抗體藥物存在著制備繁瑣、體外穩(wěn)定性較差、分子較大、標(biāo)記困難、穿透力弱，翻譯后修飾且費用昂貴等原因使其進一步應(yīng)用受到限制。因此，為了提高癌癥診斷和治療的特異性和準(zhǔn)確性，彌補抗體的缺陷，迫切需要尋求針對新的腫瘤標(biāo)志物設(shè)計小分子探針，以作為檢測和治療癌癥的有效方法。多肽類靶向小分子藥物及診斷探針以成本低、分子量小、生物相容性好、穿透性強、無免疫原性、并有較快的血液清除速率、且制備簡單等特點，在腫瘤靶向給藥、癌癥診斷等方面彰顯出很強的優(yōu)越性。因此，開發(fā)一種針對cd133的多肽探針對多種腫瘤干細胞的診斷將有突破性的重大意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及一種腫瘤干細胞標(biāo)志物cd133的靶向多肽篩選及該多肽和化療藥物聯(lián)合的載藥脂質(zhì)體的應(yīng)用。本發(fā)明的主要目的是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足提供了一種靶向cd133的多肽用于檢測和靶向腫瘤干細胞，該多肽和化療藥物聯(lián)用，制備成cd133多肽-聚乙二醇化磷脂復(fù)合物-化療藥物載藥脂質(zhì)體，利用cd133多肽提高藥物對腫瘤組織的靶向滲透能力。本發(fā)明為實時監(jiān)控患者外周血cd133表達和cd133+腫瘤干細胞在腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、藥物耐受和預(yù)后的相關(guān)性提供了簡便快捷、經(jīng)濟、準(zhǔn)確的檢測手段，以便及時調(diào)整治療方案，改善患者預(yù)后提供了新的手段。所述多肽不僅特異性、敏感性好，并且制備方法簡單，成本低，具有很強的實用性。為達到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：第一方面，本發(fā)明提供了一種靶向腫瘤干細胞標(biāo)志物cd133的多肽，該多肽能與cd133蛋白相結(jié)合，所述多肽的通式為：cx1x2x3x4x5x6x7x8lx9其中，c半胱氨酸，l為亮氨酸，x1是芳香族氨基酸，優(yōu)選為酪氨酸或色氨酸；x2是非極性氨基酸，優(yōu)選為異亮氨酸和精氨酸；x3是非極性氨基酸，優(yōu)選為纈氨酸或亮氨酸；x4是非極性氨基酸，優(yōu)選為精氨酸或苯丙氨酸；x5是芳香族氨基酸，優(yōu)選為酪氨酸或色氨酸；x6是堿性或酸性氨基酸，優(yōu)選為賴氨酸或天冬氨酸；x7是極性氨基酸，優(yōu)選為蘇氨酸和絲氨酸；x8中性氨基酸，優(yōu)選為脯氨酸和天冬酰胺；x9是堿性或酸性氨基酸，優(yōu)選為賴氨酸和谷氨酸。本發(fā)明所述的氨基酸殘基可以是l-型，也可以是d-型，或者是l-、d-型的混合。本發(fā)明中，根據(jù)yin等人(blood,1997,90(12):5002)的報道基于人cd133的蛋白結(jié)構(gòu)特點和分子識別理論進行肽庫的設(shè)計和構(gòu)建。采用氨基修飾的tentagel樹脂作為固相載體，利用fmoc合成策略進行混合均分合成庫容量為106的一珠一物肽庫。利用熒光標(biāo)記磁球和微流控芯片的方法進行高通量一珠一物肽庫篩選，陽性肽珠經(jīng)maldi-tof-ms鑒定，獲得了一系列能特異性結(jié)合cd133的活性多肽。作為優(yōu)選技術(shù)方案，本發(fā)明所述多肽的氨基酸序列如下表cs133-p1、cs133-p2、cs133-p3之一所示，其分別對應(yīng)序列表中的序列1、2、3所示的氨基酸序列。多肽的氨基酸序列：seqidcs133-p1cyivfydspleseqidcs133-p2cwrlrwhsplkseqidcs133-p3cwdvqyktnle本發(fā)明中，所述cs133-p1、cs133-p2和cs133-p3所示的氨基酸序列對cd133高特異性親和。第二方面，本發(fā)明還提供了一種dna片段，其包含編碼上述本發(fā)明第一方面所述多肽的氨基酸序列。作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述dna片段包含編碼本發(fā)明上述cs133-p1、cs133-p2、cs133-p3之一的氨基酸序列。第三方面，本發(fā)明還提供了一種表達載體，包括至少一個拷貝的編碼氨基酸序列為本發(fā)明第一方面所述多肽的如本發(fā)明第二方面所述的dna片段。作為優(yōu)選技術(shù)方案，本發(fā)明的表達載體，包括至少一個拷貝的編碼氨基酸序列為cs133-p1、cs133-p2cs133-p3之一所示多肽的如本發(fā)明第二方面所述的dna片段。第四方面，本發(fā)明還提供了一種原核或真核宿主細胞，該宿主細胞含有如本發(fā)明第三方面所述的表達載體。第五方面，本發(fā)明還提供了一種二價體或多價體，由本發(fā)明第一方面所述的多肽(如cs133-p1、cs133-p2、cs133-p3之一)組裝而成。本發(fā)明中的二價體或多價體具有靶向cd133陽性的腫瘤干細胞的特性。作為優(yōu)選技術(shù)方案，本發(fā)明的二價體或多價體是通過連接分子共價連接形成；或是通過與多聚體混合、非共價連接形成的。優(yōu)選地，所述的連接分子為6-叔丁氧羰肼基煙酸(hynic)、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(edc)或n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)；該連接分子是一種新型無毒、生物相容性良好的交聯(lián)劑。本發(fā)明可以根據(jù)具體需要來選擇多聚體，例如可以是聚乙二醇(peg)、聚乙烯醇(pva)、環(huán)糊精、聚酰胺-胺型樹枝狀高分子(pamam)、聚乳酸(pla)、聚乳酸-乙醇胺(plga)中的任意一種或至少兩種的混合。第六方面，本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，包括本發(fā)明第一方面所述的多肽(如cs133-p1、cs133-p2或cs133-p3)或本發(fā)明第五方面所述的二價體或多價體作為靶向多肽；以及能殺傷癌細胞的制劑。進一步地，所述藥物組合物還包括與所述的多肽(如cs133-p1、cs133-p2、cs133-p3之一)或所述二價體或多價體相綴合或混合可制備靶向藥物的載體。優(yōu)選地，所述制劑為能殺傷癌細胞的化學(xué)藥物、生物藥物、納米藥物、放射性藥物、光熱治療或光動力治療藥物；或包裹這些藥物的載體中的任意一種。進一步優(yōu)選地，所述制劑為烷化劑、抗代謝藥物、抗腫瘤天然藥物、抗腫瘤抗生素、激素及金屬絡(luò)合物或腫瘤放射靶向標(biāo)記物中的任意一種。進一步優(yōu)選地，所述載體為納米材料、脂質(zhì)體或聚合物膠束中的任意一種。本發(fā)明采用將第一方面所述的多肽(如cs133-p1、cs133-p2、cs133-p3之一)或第五方面所述的二價體或多價體與所述載體(納米材料、脂質(zhì)體或聚合物膠束等高分子材料)綴合，本發(fā)明所述的多肽、二價體或多價體可以使綴合后生成的化合物在機體內(nèi)更穩(wěn)定地被運輸?shù)桨屑毎５谄叻矫?，本發(fā)明還提供了另外一種藥物組合物，所述藥物組合物包括本發(fā)明第一方面所述的多肽(如cs133-p1、cs133-p2、cs133-p3之一)或本發(fā)明第五方面所述的二價體或多價體，以及顯像制劑。優(yōu)選地，所述多肽、二價體或多價體與顯像制劑相綴合或混合。優(yōu)選地，所述的顯像制劑為放射性核素、放射性核素標(biāo)記物或分子影像制劑中的任意一種。第八方面，本發(fā)明還提供了如本發(fā)明第一方面所述的多肽(如cs133-p1、cs133-p2、cs133-p3之一)或本發(fā)明第五方面所述的二價體或多價體在制備用于治療、預(yù)防或診斷癌癥的藥物或顯像制劑中的用途。作為優(yōu)選技術(shù)方案，本發(fā)明所述癌癥為cd133過表達的癌癥。優(yōu)選地，所述癌癥為神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌、非小細胞肺癌、白血病、腎癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌等。本發(fā)明的肽具有靶向cd133蛋白的作用，可以作為靶頭增加藥物或載有藥物的載體如納米材料、脂質(zhì)體等在cd133陽性干細胞中的含量，再添加藥學(xué)上可接受的輔料或佐劑制成新型的更有效的靶向腫瘤干細胞的抗癌藥物。本發(fā)明多肽和化療藥物聯(lián)用，制備成腫瘤靶向性多肽-聚乙二醇化磷脂復(fù)合物-化療藥物載藥脂質(zhì)體，利用cd133多肽提高了藥物對腫瘤組織的靶向滲透能力。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：(1)本發(fā)明的多肽具有靶向cd133陽性腫瘤細胞的特性，因而在實際應(yīng)用中，可以將本發(fā)明的多肽作為分子探針用于非侵入性的影像學(xué)技術(shù)檢測腫瘤干細胞的數(shù)量和活性預(yù)測評估接受治療的病人耐藥反應(yīng)和療效評估。本發(fā)明的多肽探針選擇性強，純度高，分子量小，特異性強，無免疫原性，安全可靠，可以采用化學(xué)合成的方法制備，簡單易行，適于作為化療的預(yù)測和伴隨診斷試劑。本發(fā)明藥物組合物用于近紅外熒光成像在皮移植腫瘤中對cd133腫瘤干細胞進行高靈敏度、高分辨率監(jiān)測和靶向治療。本發(fā)明為實時監(jiān)控患者外周血cd133表達和cd133腫瘤干細胞在腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、藥物耐受和預(yù)后的相關(guān)性提供了簡便快捷、經(jīng)濟、準(zhǔn)確的檢測手段，以便及時調(diào)整治療方案，改善患者預(yù)后提供了新的手段。(2)本發(fā)明的針對cd133的靶向多肽是目前最為普適的一類腫瘤靶向多肽，還沒有相關(guān)的報道。因此，本發(fā)明對csc測定方法進行有效的補充，并對其靶向治療，對目前腫瘤的診斷、預(yù)防和治療可能會具有重要的意義。(3)cd133多肽介導(dǎo)的靶向納米載體相比抗體用于腫瘤診療具有獨特優(yōu)勢。多肽作為天然的優(yōu)良兩親性分子，可通過特定的序列設(shè)計來自組裝形成規(guī)整有序的納米結(jié)構(gòu)。多肽功能化的納米載體可以通過共價或非共價的形式輸運診斷探針及抗腫瘤藥物。因其良好的生物相容性、易降解、可調(diào)的機械性能以及環(huán)境響應(yīng)性，在腫瘤診療領(lǐng)域具有很強的實用性備受關(guān)注。(4)本發(fā)明中，cd133多肽篩選方法采用既具有高熒光量子效率，又具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光(aie)性能的tpe分子，在聚集后可提高分子的抗光漂白能力，普通的熒光分子容易產(chǎn)生分子聚集熒光猝滅。此外，只有通過識別-聚集-發(fā)光的途徑，熒光才特異“打開”而被檢測到，可以消除非特異性吸附的熒光干擾，進而提高篩選的效率和減少假陽性率。附圖說明圖1cd133靶向多肽微芯片篩選圖；圖2表面等離子共振(spri)檢測陽性多肽與人cd133蛋白的親合力；圖3cs133-p2多肽對cd133+腫瘤干細胞以及結(jié)直腸癌病人組織切片的特異性染色；圖4腫瘤細胞對cs133-p2-lp脂質(zhì)體藥物載體的攝取情況；圖5cs133-p2-lp藥物載體的體外抗腫瘤檢測。具體實施方式下面通過具體實施方式來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對本發(fā)明的具體限制。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實驗例1本發(fā)明cd133靶向多肽篩選系統(tǒng)的構(gòu)建和篩選1)實驗儀器與材料n-甲基嗎啉(nmm)，哌啶，三氟乙酸(tfa)，二氯甲烷(dcm)，茚三酮，維生素c，苯酚，四甲基脲六氟磷酸鹽(hbtu)，六氫吡啶，三異丙基硅烷(tis)，乙二硫醇(edt)，n,n二甲基甲酰胺(dmf)，無水乙醚，樹脂，甲醇，各種fmoc保護氨基酸，四苯基乙烯(tpe)，pe-anti-cd133抗體，mb-streptavidin(鏈霉親和素磁珠)，多肽合成管，搖床，真空水泵，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，激光共聚焦顯微鏡(zeisslsm710)，上述試劑和材料均從商業(yè)途徑獲得。2)cd133“一珠一物”多肽文庫的合成采用fmoc固相肽合成方法合成多肽文庫，具體方法如下：稱取200mg的tentagel-nh2樹脂，按照上述固相多肽合成程序循環(huán)，依次加入met、gly依次進行反應(yīng)，脫保護后進行混合均分合成；(1)待反應(yīng)完成后，把樹脂均分4份，向每管分別加入thr、glu、lys、arg與等量的hbtu進行偶聯(lián)，待偶聯(lián)完畢后，把4管樹脂脫保護后混合，再把樹脂相應(yīng)均分為若干份，依次循環(huán)合成；(2)分別加入tyr、leu偶聯(lián)方法同(2)；(3)分別加入asp、asn、arg、pro、his偶聯(lián)方法同(2)；(4)分別加入thr、ser、tyr、pro偶聯(lián)方法同(2)；(5)分別加入glu、lys、ser、his、asp偶聯(lián)方法同(2)；(6)分別加入tyr、phe、trp偶聯(lián)方法同(2)；(7)分別加入gln、tyr、phe、arg、glu偶聯(lián)方法同(2)；(8)分別加入pro、leu、lys、val、asp偶聯(lián)方法同(2)；(9)分別加入asp、asn、arg、ile、his偶聯(lián)方法同(2)；(11)分別加入tyr、trp偶聯(lián)方法同(2)；(12)分別加入cys偶聯(lián)方法同(2)，待偶聯(lián)完畢后，樹脂tfa脫保護后混合。經(jīng)過甲醇置換和收縮步驟，真空抽干，得到加載有肽庫的干燥樹脂備用。3)cd133陽性多肽的篩選(1)取干燥肽庫用1×pbs洗3次，加入5％的脫脂牛奶在混旋儀上37℃對肽珠表面封閉2h，再用1×pbs洗3次；(2)取四苯基乙烯(tetraphenylethene,tpe)和生物素標(biāo)記的cd133蛋白與多肽庫混合，37℃孵育2h后用1×pbs洗3次；(3)然后分別取100μlmb-streptavidin加入肽庫在混旋儀上37℃避光混合孵育2h。把孵育后含多肽庫ep管置于磁力架上。陽性多肽受磁力影響吸附于ep管側(cè)壁，而陰性多肽由于重力沉降在ep管底。由圖(1)看出陽性肽珠與tpe標(biāo)記的受體蛋白孵育后，陽性肽珠特異性識別蛋白，標(biāo)記tpe和磁性鏈霉親和素通過識別生物素而識別陽性肽珠。陽性肽珠表面將包覆一層磁珠具有磁性從而被磁場捕獲同時由于蛋白結(jié)合引起tpe的聚集誘導(dǎo)發(fā)光特性(aie)陽性多肽珠子產(chǎn)生藍色熒光。同時，親和力越強聚集的熒光越強，可直觀的找到最好的陽性肽。將陽性肽珠轉(zhuǎn)移到微芯片陣列中，滴加溴化氫原位裂解，用maldi-tof-ms鑒定通過mascot數(shù)據(jù)庫解出相應(yīng)序列信息。按序列重新合成陽性多肽部分標(biāo)記熒光，maldi-tof鑒定和hplc純化用于后續(xù)試驗。經(jīng)化學(xué)合成制得本發(fā)明的3條多肽分別為：cs133-p1、cs133-p2和cs133-p3。實驗例2通過表面等離子共振(spri)方法檢測cs133-p2多肽與cd133蛋白的親和作用將1mg/ml的cs133-p2多肽及1×pbs點到芯片上，在4℃濕潤條件下孵育過夜，然后用10×pbs清洗10min，再用1×pbs清洗10min，最后用去離子水清洗2次，每次10min，浸入含5％牛奶的1×pbs中，4℃條件下孵育過夜，然后用10×pbs清洗10min，1×pbs清洗10min，最后用去離子水清洗2次，每次10min，用氮氣吹干，裝芯片上機(plexeraht表面等離子共振成像系統(tǒng))。流動相依次通過1×pbs、2×pbs、0.78μg/ml、1.56μg/ml、3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml和25μg/ml的人cd133純化蛋白，記錄分析spri信號。由圖2可以看出，cs133-p2的spri信號隨著蛋白濃度的增加逐漸增強，說明本發(fā)明的cs133-p2多肽對cd133都有強結(jié)合的，而且親和解離常數(shù)達到7.37×10-9m，接近抗體的親和力?？梢宰鳛樘结槹邢騝d133的腫瘤干細胞，用于相關(guān)的檢測研究和靶向治療應(yīng)用。實驗例3cs133-p2分別與白血病中分離的cd133+腫瘤干細胞以及結(jié)直腸癌病人組織切片的特異性染色經(jīng)cd133抗體流式分選cd133+腫瘤干細胞用含細胞生長因子的干細胞完全培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h后，以1×103/ml的細胞濃度植入圓形玻底培養(yǎng)皿(35mm)，三種細胞中分別加入含1μmol/lhoechst33342和5μlpe-anti-cd133抗體，4℃避光孵育60min后，用預(yù)冷1×pbs洗滌2次，分別加入50μmol/l的fitc標(biāo)記cs133-p2多肽，4℃避光孵育20min后，用預(yù)冷1×pbs洗滌3次。用激光掃描共聚焦顯微鏡(zeisslsm710)檢測干細胞中的熒光分布。腫瘤組織樣本用多聚甲醛固定48h以上(中途更換一次多聚甲醛)，并制作石蠟切片，脫蠟后，先進行cd133抗體免疫組化染色，再用fitc標(biāo)記cs133-p2多肽染色，方法參照h&e染色，然后顯微鏡觀察。結(jié)果如圖3(a)所示，加入cs133-p2干細胞觀測到有很強綠色熒光，同時pe標(biāo)記的cd133抗體也可特異的結(jié)合干細胞，圖3(b)切片染色也顯示，cs133-p2多肽結(jié)合在腫瘤組織中陽性腫瘤干細胞的細胞膜上，抗體定位顯示與cd133表達部位相同。即cs133-p2多肽可特異的識別結(jié)合cd133陽性腫瘤干細胞，而且特異性與靶標(biāo)蛋白的表達量呈正相關(guān)，可以作為靶向分子替代抗體用于cd133陽性相關(guān)干細胞的診斷和檢測。實驗例4在本實施例中，評價cs133-p2-lp藥物載體的體外抗腫瘤效果，具體方法如下：(1)納米脂質(zhì)體的制備：稱取大豆軟磷脂、膽固醇、阿霉素(dox)、多肽偶聯(lián)物(cs133-p2-peg2000-dspe)，比例為8:2:1:1(w/w/w/w)。將上述稱取樣品溶解在甲醇/二氯甲烷(v/v2:1)的混合溶液里置于圓底燒瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)形成均勻的薄膜后，1×pbs于60℃水浴震蕩水化20min。然后超聲15min。最后經(jīng)過220nm的濾膜過濾得到所需的脂質(zhì)體藥物載體。(2)人結(jié)直腸癌細胞系ht29(cd133陽性)和人腎上皮細胞系293t細胞(cd133陰性)用含10％胎牛血清及1％青霉素和鏈霉素的dmem/highglucose培養(yǎng)基在37℃恒溫培養(yǎng)箱(5％co2)中培養(yǎng)。(3)以1×105/ml的細胞濃度植入圓形玻底培養(yǎng)皿(35mm)細胞貼壁后，去掉培養(yǎng)基，然后分別加入lp，cs133-p2-lp(20μg/ml,200μl)樣品溶液，37℃孵育2h。加pbs清洗后，然后加入溶酶體標(biāo)記染料(lysotrackergreen,50nm)和細胞核染料(hoechst33342,10nm)孵育30min。最終，pbs洗三次后，加入少量的pbs。激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞對于納米脂質(zhì)體的攝取情況。(4)將ht29和293t以每皿5×103個細胞的數(shù)量接種到96孔板中進行過夜培養(yǎng)24h。然后一組96孔板中每個孔里加入200μl不同濃度的游離dox，lp，cs133-p2-lp的樣品溶液(濃度分別為0.01，0.05，0.1，0.2，0.4和0.8mg/ml)，孵育24h。吸掉藥物溶液，加入0.5mg/ml的mtt溶液37℃度孵育4個小時。吸掉液體，加入200μl二甲基亞砜(dmso)，經(jīng)過10分鐘震蕩混勻后，使用酶標(biāo)儀測定570nm處的光密度od570值，并分析細胞藥物毒性。從圖4a中我們可以看到cs133-p2-lp在ht29細胞中dox熒光強度顯著高于其他組，而且在細胞核有大量的聚集。反之，對照組lp在細胞質(zhì)中顯示出的熒光也非常弱(圖4b)，這表明沒有靶向肽識別元件的情況下，脂質(zhì)體對細胞膜的結(jié)合能力不強。此外，cs133-p2-lp處理的陰性細胞系293t細胞顯示非常弱的熒光強度，表明cs133-p2-lp在缺乏靶向受體的細胞中的細胞攝取并不明顯(圖4c)。根據(jù)上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在細胞膜靶向元件(cs133-p2)的輔助下，脂質(zhì)體以特異和有效的方式進入細胞質(zhì)和相應(yīng)的亞細胞結(jié)構(gòu)。在細胞水平上驗證cd133靶向脂質(zhì)體的靶向性，因此cs133-p2-lp可以作為一個有效靶向cd133陽性腫瘤干細胞的藥物載體。為了進一步評估脂質(zhì)體藥物載體對腫瘤細胞的殺傷效果，通過mtt方法來監(jiān)測細胞存活率。如圖5a所示，cs133-p2-lp對cd133陽性的腫瘤細胞ht29的細胞毒性隨脂質(zhì)體濃度的增加而增加，且與沒有多肽修飾的非靶向脂質(zhì)體相比具有更強的細胞毒作用。如圖5b所示，cs133-p2-lp對cd133陰性細胞293t表現(xiàn)出很低的細胞毒性進而說明其安全性。這一結(jié)果表明cd133多肽修飾脂質(zhì)體能夠提高cd133陽性腫瘤對藥物的攝取導(dǎo)致更高效的細胞毒作用殺滅腫瘤。綜上所述，從實驗例1-4可以得出，本發(fā)明的多肽具有靶向表達cd133陽性腫瘤細胞和腫瘤干細胞的特性，該藥物遞送載體在很大程度上減少了化療藥物用量，降低了藥物毒副作用。在臨床上對相關(guān)腫瘤具有診斷和治療的應(yīng)用價值。因而在實際應(yīng)用中，可以將本發(fā)明的多肽作為靶向多肽，與能殺傷癌細胞的制劑相綴合或混合，用于腫瘤的靶向治療和成像，免疫治療反應(yīng)標(biāo)志物的檢測。申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的工藝方法，但本發(fā)明并不局限于上述工藝步驟，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述工藝步驟才能實施。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>國家納米科學(xué)中心<120>一種靶向腫瘤干細胞標(biāo)志物cd133的多肽及其應(yīng)用<130>khp171113669.5<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>11<212>prt<213>人工序列<400>1cystyrilevalphetyraspserproleuglu1510<210>2<211>11<212>prt<213>人工序列<400>2cystrpargleuargtrphisserproleulys1510<210>3<211>11<212>prt<213>人工序列<400>3cystrpaspvalglntyrlysthrasnleuglu1510當(dāng)前第1頁12