本發(fā)明涉及蛋白修飾化檢測技術領域，更具體地，涉及一種用于檢測組蛋白位點乙?；闹亟M蛋白及其應用。

背景技術：

調(diào)控細胞過程和疾病進展的翻譯后修改分子解剖學是后基因組生物學研究的主要目標之一。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)300多種翻譯后修飾。這是使蛋白基本結構甚至功能發(fā)生改變的有效方式。賴氨酸側鏈上的修飾證明了分子網(wǎng)絡的巨大復雜性。賴氨酸是由15個核糖體編碼并已知可被修飾的氨基酸殘基。賴氨酸側鏈具有兩種特性：電荷豐富和親核性，適合翻譯后修飾與不同的親電底物以共價鍵結合。賴氨酸上可發(fā)生很多翻譯后修飾，如甲基化，乙?；?，生物素化，泛素化，豆蔻?；蛃umo化修飾等，這些修飾在細胞生理和病理中有重要作用。

組蛋白上的賴氨酸可被如甲基化，乙?；?，泛素化，sumo化、核糖體化和豆蔻?；揎?。其中，賴氨酸乙?；且环N豐度高，可逆的，并可高度調(diào)控的組蛋白編碼。賴氨酸乙?；诟鞣N細胞過程，如調(diào)亡、代謝、轉錄和應激反應中發(fā)揮重要作用。除了在基礎生物學方面的作用，賴氨酸乙?；捌湔{(diào)控酶與衰老、癌癥、神經(jīng)變性疾病以及心血管疾病也緊密相關。

組蛋白的修飾方式主要有絲氨酸蘇氨酸或絲氨酸磷酸化，賴氨酸乙?；?，賴氨酸或精氨酸甲基化，針對不同修飾及其不同位點，通常購買商業(yè)化抗組蛋白特定修飾位點的多抗，進行蛋白質(zhì)印跡檢測組蛋白修飾的程度，進而分析基因轉錄的激活或抑制水平，在表觀遺傳學上是一項必備的實驗分析技術。

目前，針對組蛋白乙酰化修飾位點的商業(yè)化抗體價格昂貴，而且批次質(zhì)量不穩(wěn)定，交叉反應明顯，特定位點修飾的抗體制備周期很長，產(chǎn)量低。

技術實現(xiàn)要素：

(一)要解決的技術問題

本發(fā)明要解決的技術問題是針對組蛋白乙?；揎椢稽c的商業(yè)化抗體價格昂貴，各批次質(zhì)量不穩(wěn)定，交叉反應嚴重，特定位點修飾的抗體制備周期長，產(chǎn)量低。

(二)技術方案

為了解決上述技術問題或者至少部分地解決上述問題，本發(fā)明提供了一種重組蛋白，重組蛋白的氨基酸序列包括串聯(lián)2個或2個以上bromo結構域序列，其中，該bromo結構域序列，記為bbm1，為：

a)seqidno.1所示的氨基酸序列；或

b)seqidno.1所示的氨基酸序列經(jīng)替換、缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本發(fā)明優(yōu)化了bromo結構域，并將2個或2個以上優(yōu)化后的結構域串聯(lián)，實驗測定kd值為6.75um，親和力提高20倍。

在本發(fā)明中，較為優(yōu)選地是，將2個優(yōu)化后的bromo結構域串聯(lián)。當使用2個優(yōu)化的bromo結構域串聯(lián)時，記為bbm2，當使用3個優(yōu)化的bromo結構域串聯(lián)時，記為bbm3，依此類推。

應當理解，本領域技術人員可根據(jù)本發(fā)明公開的seqidno.1片段，在不影響其活性的前提下，本發(fā)明的bromo結構域序列還包括seqidno.1所示氨基酸序列取代、缺失或增加一個或幾個氨基酸，具有與該結構域序列同等活性的由該bromo結構域序列衍生得到的蛋白質(zhì)。

在本領域中，bromodomain結構域是一進化上高度保守的氨基酸的蛋白質(zhì)功能結構域，本發(fā)明通過對該結構進行優(yōu)化使其具有多個且串聯(lián)的seqidno.1的氨基酸序列，提高對特定位點乙?；挠H和力，從而起到提高檢測靈敏度，降低交叉反應的效果。

為了得到質(zhì)量更加穩(wěn)定的重組蛋白，在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方式中，重組蛋白的氨基酸序列還包括n端的gst融合蛋白。即該重組蛋白中包含了n端的gst融合蛋白和c端的優(yōu)化后的bromo串聯(lián)結構域，即該重組蛋白的氨基酸序列為：

a)seqidno.2所示的氨基酸序列；或

b)seqidno.2所示的氨基酸序列經(jīng)替換、缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

在實驗規(guī)模即可方便的純化得到大量的，質(zhì)量穩(wěn)定的重組蛋白。

應當理解，本領域技術人員可根據(jù)本發(fā)明公開的重組蛋白gst-bbm2的氨基酸序列seqidno.2片段，在不影響其活性的前提下，本發(fā)明的重組蛋白還包括seqidno.2所示氨基酸序列取代、缺失或增加一個或幾個氨基酸，具有與重組蛋白gst-bbm2同等活性的由gst-bbm2衍生得到的蛋白質(zhì)。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還提供了上述含有gst片段的重組蛋白的制備方法，包括：

1)全基因優(yōu)化合成seqidno.1所述的核苷酸序列由2個bromo結構域序列串聯(lián)組成，簡稱為bbm2；

2)構建且誘導表達質(zhì)粒pgex-4t-1-bbm2；

3)用步驟2)中pgex-4t-1-bbm2轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞bl21，活化，低溫誘導培養(yǎng)，即得。

其中，在一個優(yōu)選實施方式中，步驟2)具體為：

根據(jù)步驟1)的bbm2序列合成引物，pcr擴增，亞克隆到pgex-4t-1載體，重組后載體編碼pgex-4t-1-bbm2。

在一個優(yōu)選實施方式中，步驟3)具體為：

重組載體pgex-4t-1-bbm2轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞bl21,單克隆活化到lb液體培養(yǎng)基，當od600＝0.6時，加入iptg，低溫16度誘導15h,可以得到該重組蛋白的可溶性表達；從1l液體lb誘導表達的發(fā)酵液中獲得約20mggst-bbm2重組蛋白。

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明還提供了編碼上述重組蛋白的基因。

當重組蛋白的氨基酸序列包括2個串聯(lián)的bromo結構域序列時，其核苷酸序列如seqidno.3所示的序列。

當該重組蛋白的氨基酸序列中包括seqidno.2所示的氨基酸序列時，其核苷酸序列如seqidno.4所示的序列

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還提供了提供含有上述基因的表達載體。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還提供了含有上述表達載體的宿主細胞。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還提供了含有上述重組蛋白的抗體。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還提供了含有上述重組蛋白的檢測試劑盒。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還提供了使用上述重組蛋白、基因或是抗體在檢測組蛋白位點乙?；械膽谩?/p>

更優(yōu)選地是，組蛋白位點為組蛋白h3中的位點。所述組蛋白位點更優(yōu)選為h3k14。

較優(yōu)選地是，在上述應用中使用蛋白質(zhì)印跡檢測組蛋白位點乙?；潭?。

在本發(fā)明中，組蛋白可以取自人、鼠、馬、牛、豬、綿羊、山羊、雞、狗、貓、果蠅、線蟲和酵母等細胞中。

本發(fā)明涉及的seqidno.2重組蛋白融合的gst蛋白，也可以方便使用抗gst通用的抗體，應用到蛋白免疫印記檢測中。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還提供了使用上述重組蛋白、基因或是抗體在檢測組蛋白h3k14ac免疫印跡中的應用。

在該應用中，使用上述重組蛋白與抗gst通用單抗以及hrp標記的羊抗鼠多抗，經(jīng)過3級結合和信號放大，靈敏度明顯得到提高，可得到較為理想的檢測效果。

在該應用中，檢測方法具體為：

1)提取待檢測蛋白質(zhì)，并將其轉移至硝酸纖維膜上，封閉，tbst洗滌；

2)使用pbs稀釋后終濃度為1-10ug/ml的重組蛋白gst-bbm2孵育，加入抗gst單抗和帶hrp的抗鼠igg多抗孵育，觀察免疫印跡結果。

(三)有益效果

1)本發(fā)明提出的重組蛋白優(yōu)化了bromo結構域，同時優(yōu)選將2個或2個以上上述結構域串聯(lián)，提高了與h3k14ac結合的親和力，特異性識別強，將其替代商業(yè)化抗體，沒有交叉結合發(fā)生，預期成本顯著降低，批次質(zhì)量十分穩(wěn)定，可以快速實現(xiàn)批量化生產(chǎn)；

2)同時seqidno.2所述的重組蛋白融合了助溶蛋白gst，提高了結構域bromo可溶性表達水平。更有優(yōu)勢的是，利用大腸桿菌表達系統(tǒng)制備重組蛋白的成本低，一次研發(fā)理論上可以無數(shù)次重復生產(chǎn)，容易實現(xiàn)標準化工藝和規(guī)?；a(chǎn)，從而保證批次間同質(zhì)性好，質(zhì)量穩(wěn)定；

3)使用商業(yè)化抗體時，每100次樣品實驗使用同樣的抗體，在保證實驗成功的基礎上平均消耗100ug抗體，平均成本為4500元，在成千上萬次的檢測中，這樣的抗體價格就十分昂貴。而使用重組的bromo結構域作為替代抗體，在一個制備周期內(nèi)，每mg重組蛋白生產(chǎn)的平均成本不超過150元，加上使用通用抗體的市場價格,每100ug為500元，可以預期檢測成本至少降低5倍。因此將本發(fā)明的重組蛋白替代商業(yè)化抗體，實驗檢測成本將顯著降低。

具體實施方式

下面結合實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)技術手段。若未特別指明，實施例中所用的試劑為市售。

實施例1

重組蛋白gst-bbm2的制備

1)首先全基因優(yōu)化合成seqidno.1序列所述的核苷酸序列，翻譯的氨基酸序列即為雙結構域bbm2?；騼啥朔謩e引入了限制性酶切位點bamhi和xhoi，合成的基因克隆到puc57載體中；

2)提取步驟1)中包含bbm2序列的載體，雙酶切，連接到同樣雙酶切的pgex-4t-1載體，經(jīng)篩選鑒定得到重組后的載體，命名為pgex-4t-1-bbm2；

3)重組載體pgex-4t-1-bbm2轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞bl21,單克隆活化到5mllb液體培養(yǎng)基，當od600＝0.6時，加入0.5mmiptg,低溫16度-20度誘導12-15個小時,可以得到該重組蛋白的可溶性表達；

4)從1l步驟3)中液體lb誘導表達的發(fā)酵液中獲得約gst-bbm3重組蛋白。

實施例2

重組蛋白的特異性檢測

itc儀器設備：thetitrationwasperformedusingmicrocalitc200system(gehealthcare)

實驗方法參考儀器使用說明和標準設置。

主要步驟：確定合適的反應物濃度，準備樣品；滴定，收集熱量數(shù)據(jù)；校正數(shù)據(jù)，擬合回歸，計算熱力學參數(shù)，最后分析模型。

1)所有檢測樣本置于恒溫25℃反應；

2)合成待測的多肽10mg(組蛋白h3第14位賴氨酸上乙?；揎?，使用itc基礎緩沖液溶解。母液濃度為0.5mg/ml。

多肽序列源于h3k14ac，為arkstggkacaprkq

稀釋溶液：20mmtris-hcl，50mmnacl，ph7.5，多肽工作濃度0.8-1.2mm；

3)重組蛋白使用紫外分光光度計測定，計算得到蛋白濃度為0.8mg/ml,使用上述緩沖液稀釋，工作濃度0.05-0.1mm；

4)收集反應的熱量數(shù)據(jù)，最終結果由origin7擬合計算。

itc實驗測定和計算的kd值反映了重組蛋白對相應模擬多肽的特異性結合。kd越低，結合特異性越好。源于pb1蛋白的bromo2結構域?qū)3k14ac的kd值分別為150um，具有很弱的特異性結合。

其中，實施例1的gst-bbm2對h3k14ac的kd值為6.5um,結合特異性提高了至少20倍。

其中，實施例1的gst-bbm2重組蛋白對h3k14ac：kd值為6.45um。

實施例3

以seqidno.2所述的重組蛋白gst-bbm2蛋白免疫印跡wb(westernblot)檢測

1)使用ripa裂解液提取人肝組織細胞核蛋白.采用15％sds-page聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品中的蛋白質(zhì)，隨后電轉移蛋白到硝酸纖維素膜上；

2)使用5％bsa或脫脂奶粉37度封閉1到2個小時,tbst洗滌3次，每次5min；用tbs洗滌3次，每次5min；

3)使用seqidno.2所述的重組蛋白gst-bbm2孵育nc膜,工作濃度為20-200nm或0.5-5ug/ml,37℃孵育1到2個小時,使用tbst和tbs依次洗滌3次，每次5min；

4)加入小鼠抗gst單抗,按說明書稀釋抗體(1:1000)，37度孵育2h,tbst洗滌3次，每次5min.再用tbs洗滌3次，每次5min；

5)加入帶hrp的羊抗鼠igg多抗(1:2000)，按說明書稀釋抗體，37度孵育2h,tbst洗滌3次，每次5min，用tbs洗滌3次，每次5min；

6)加入ecl發(fā)光液，依次顯影，定影，曝光1-5min。觀察免疫印跡結果。

來源于人的其它組織和細胞樣本均可以以同樣的技術方案實施。

免疫印跡結果：

以gst-bbm2重組蛋白進行wb時，靈敏度是原始結構域的20倍。在可控靈敏度范圍內(nèi)，出現(xiàn)了與h3k14ac對應大小的明顯條帶，對不同組織樣本檢測時，交叉反應較少；最有效的使用濃度為60nm。

以gst-bbm2重組蛋白進行wb時，與商業(yè)化抗體的檢測靈敏度相當，使用重組蛋白有顯著的優(yōu)勢，明顯減少了非特異性識別和交叉反應，使得實驗結果有可靠性和預判性。

最后，本發(fā)明的方法僅為較佳的實施方案，并非用于限定本發(fā)明的保護范圍。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

序列表

<110>武漢博歐特生物科技有限公司

<120>一種用于檢測組蛋白位點乙?；闹亟M蛋白及其應用

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