技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及甾體藥物中間體的制備方法，特別涉及一種孕甾藥物中間體孕甾-1，4，9(11)，16(17)-四烯-3，20-雙酮、孕甾-4，9(11)-雙烯-3，20-雙酮-17α-羥基的制備方法。

背景技術(shù)：
：

糖皮質(zhì)激素是腎上腺皮質(zhì)分泌的類固醇化合物，其生理性作用表現(xiàn)在對(duì)糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)的影響。它能抑制緩激肽、前列腺素e2、5-羥色胺、組胺等炎性介質(zhì)的合成與釋放，降低血管通透性、穩(wěn)定溶酶體膜、抑制吞噬作用。對(duì)各種原因引起的炎癥都有很強(qiáng)的抗炎作用，可以減輕炎癥早期的滲出、水腫、毛細(xì)血管擴(kuò)張、白細(xì)胞浸潤及吞噬反應(yīng)，可抑制炎癥后期毛細(xì)血管和纖維母細(xì)胞增生，抑制免疫反應(yīng)產(chǎn)生的病理變化，解除該疾病的癥狀。

孕甾-1，4，9(11)，16(17)-四烯-3，20-雙酮、孕甾-4，9(11)-雙烯-3，20-雙酮-17α-羥基是孕甾藥物重要中間體，可以制備糖皮質(zhì)激素，例如cn200710061254.4中就介紹了以孕甾-1，4，9(11)，16(17)-四烯-3，20-雙酮為底物制備倍他米松及其系列產(chǎn)品的方法。

為了更好地制備孕甾-1，4，9(11)，16(17)-四烯-3，20-雙酮，研究人員采取了多種方法。

cn201010278556.9由霉菌脫氫物制備甲基四烯物分為兩步反應(yīng)：第一步脫水得甲基脫水物，第二步經(jīng)還原得甲基四烯物(5st)。

cn201510090371.8公開了以雄甾-4-烯-3，17-雙酮-9α-羥基為底物，經(jīng)過脫水、醚化、接側(cè)鏈、生物脫氫得到孕甾-1，4，9(11)，16(17)-四烯-3，20-雙酮。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及甾體藥物中間體的制備方法，特別涉及一種孕甾藥物中間體孕甾-1，4，9(11)，16(17)-四烯-3，20-雙酮、孕甾-4，9(11)-雙烯-3，20-雙酮-17α-羥基的制備方法。

我們經(jīng)過不斷的研究，驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過優(yōu)化反應(yīng)路線，調(diào)整工藝，可以雄甾-4-烯-3，17-雙酮-9α-羥基為底物，經(jīng)過脫水、氰化、縮酮、格氏反應(yīng)得到孕甾-4，9(11)-雙烯-3，20-雙酮-17α-羥基，再經(jīng)過生物脫氫、脫水反應(yīng)，得到孕甾-1，4，9(11)，16(17)-四烯-3，20-雙酮。

一種式2化合物的制備方法，其特征是：

步驟1：

將式3化合物投入到硫酸水溶液或是1-4個(gè)碳的醇、水和硫酸組成的溶液中，攪拌直至無原料，再將反應(yīng)液稀釋至水中，用無機(jī)堿水溶液中和至ph值中性，過濾得到式4化合物；

步驟2：

將1-4個(gè)碳的醇和無機(jī)堿水溶液攪拌均勻，將式4化合物投入到其中，攪拌均勻。再加入2倍摩爾比以上的丙酮氰醇，控制溫度在25-40℃之間攪拌反應(yīng)直至無原料。再將反應(yīng)液稀釋入水中，用無機(jī)酸中和稀釋液至ph值中性；過濾得到式5化合物；

步驟3：

將式5化合物投入到乙二醇中，再依次加入對(duì)甲苯磺酸、原甲酸三乙酯，升溫至30-60℃反應(yīng)直至無原料，再加入適量的有機(jī)堿中和，然后將反應(yīng)液稀釋入水中，過濾，得到縮酮物式6化合物；

步驟4

將干燥的式6化合物和乙烯基正丁醚投入到含有甲苯磺酸的2-6個(gè)碳的醚溶液中，攪拌反應(yīng)至無原料，得到反應(yīng)的中間體；再滴加入格氏試劑-甲基氯化鎂/四氫呋喃，滴加完成后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)至無中間體。再用飽和氯化銨水溶液緩慢滴加淬滅格式試劑，然后用無機(jī)酸調(diào)反應(yīng)液的ph值小于3。加熱反應(yīng)液至40-70℃保溫2小時(shí)，后降溫至5-10℃，用無機(jī)堿水溶液調(diào)ph至中性，濃縮、稀釋，過濾，得到式1化合物；

步驟5

將式1化合物粉碎或以1-4個(gè)碳的醇溶解，投入已培養(yǎng)好簡單節(jié)桿菌的發(fā)酵罐中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，得到化合物7。

步驟6：

將化合物7投入到醋酸中，再加入的鹽酸氨基脲水溶液，升溫反應(yīng)直至無原料，降溫至室溫，稀釋入水中，過濾，得化合物2。

式6化合物中4、5位和5、6位的虛線表示4、5位或5、6位存在雙鍵。

一種式1化合物的制備方法，其特征是：

步驟1：

將式3化合物投入到硫酸水溶液或是1-4個(gè)碳的醇、水和硫酸組成的溶液中，攪拌直至無原料，再將反應(yīng)液稀釋至水中，用無機(jī)堿水溶液中和至ph值中性，過濾得到式4化合物；

步驟2：

將1-4個(gè)碳的醇和無機(jī)堿水溶液攪拌均勻，將式4化合物投入到其中，攪拌均勻。再加入2倍摩爾比以上的丙酮氰醇，控制溫度在25-40℃之間攪拌反應(yīng)直至無原料。再將反應(yīng)液稀釋入水中，用無機(jī)酸中和稀釋液至ph值中性；過濾得到式5化合物；

步驟3：

將式5化合物投入到乙二醇中，再依次加入對(duì)甲苯磺酸、原甲酸三乙酯，升溫至30-60℃反應(yīng)直至無原料，再加入適量的有機(jī)堿中和，然后將反應(yīng)液稀釋入水中，過濾，得到縮酮物式6化合物；

步驟4

將干燥的式6化合物和乙烯基正丁醚投入到含有甲苯磺酸的2-6個(gè)碳的醚溶液中，攪拌反應(yīng)至無原料，得到反應(yīng)的中間體；再滴加入格氏試劑-甲基氯化鎂/四氫呋喃，滴加完成后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)至無中間體。再用飽和氯化銨水溶液緩慢滴加淬滅格式試劑，然后用無機(jī)酸調(diào)反應(yīng)液的ph值小于3。加熱反應(yīng)液至55-65℃保溫2小時(shí)，后降溫至5-10℃，用無機(jī)堿水溶液調(diào)ph至中性，濃縮、稀釋，過濾，得到式1化合物；

式6化合物中4、5位和5、6位的虛線表示4、5位或5、6位存在雙鍵。

如上所述的制備方法，其特征是所述1-4個(gè)碳的醇為甲醇或乙醇。

如上所述的制備方法，其特征是所述步驟1中硫酸水溶液為15-50％硫酸水溶液

如上所述的制備方法，其特征是所述步驟1中1-4個(gè)碳的醇、水和硫酸組成的溶液中水、硫酸為15-50％硫酸水溶液。

如上所述的制備方法，其特征是所述步驟1中硫酸水溶液濃度為25-40％，無機(jī)堿為naoh、koh、na2co3、nahco3、k2co3、khco3中的一種或幾種。

如上所述的制備方法，其特征是所述步驟1中1-4個(gè)碳的醇、水和硫酸組成的溶液中水、硫酸為25-40％硫酸水溶液，，無機(jī)堿為naoh、koh、na2co3、nahco3、k2co3、khco3中的一種或幾種。

如上所述的制備方法，其特征是所述步驟2中無機(jī)堿為naoh、koh中的一種或幾種，無機(jī)堿水溶液濃度為30-60％，式4化合物與無機(jī)堿水溶液的重量體積比為1:0.01-0.1。

如上所述的制備方法，其特征是所述步驟3中對(duì)甲苯磺酸為催化劑量，式5化合物與原甲酸三乙酯的重量體積比為1:0.7-2，有機(jī)堿未吡啶或三乙胺中的一種。

如上所述的制備方法，其特征是所述步驟4中式6化合物與乙烯基正丁醚的重量體積比為1:0.5-1，甲苯磺酸的2-6個(gè)碳的醚溶液濃度為0.01-1％，2-6個(gè)碳的醚為乙醚、四氫呋喃、1,2-二氧六環(huán)、甲乙醚、二甲醚，無機(jī)酸為鹽酸，無機(jī)堿為naoh、koh、na2co3、nahco3、k2co3、khco3中的一種或幾種。

上述式2化合物的制備方法，其特征是步驟5生物轉(zhuǎn)化中溶解式1化合物的溶劑選自甲醇、乙醇、四氫呋喃、二氧六環(huán)、n，n-二甲基甲酰胺中的一種或幾種，簡單節(jié)桿菌的為as1.754、as1.94*。

上述式2化合物的制備方法，其特征是步驟5生物轉(zhuǎn)化中斜面培養(yǎng)基采用以下配比：葡萄糖1.3％，酵母膏1.3％，瓊脂2.0％，以及余量的蒸餾水，用無機(jī)堿溶液調(diào)至ph7.0-7.2，用于斜面培養(yǎng)。

上述式2化合物的制備方法，其特征是步驟5生物轉(zhuǎn)化中斜面培養(yǎng)基采用以下配比：酵母膏0.5％，蛋白胨0.5％，葡萄搪1％，瓊脂2％，自來水配制，用無機(jī)堿溶液調(diào)至ph至7.0-7.2，用于斜面培養(yǎng)。

上述式2化合物的制備方法，其特征是步驟5生物轉(zhuǎn)化中發(fā)酵培養(yǎng)基為以下配比：葡萄糖1.0，酵母膏0.16％，kh2po40.25％，玉米漿0.1％，以及余量的蒸餾水，用無機(jī)堿溶液調(diào)至ph7.0-7.2。

上述式2化合物的制備方法，其特征是步驟6中鹽酸氨基脲水溶液含量為3-10％，升溫反應(yīng)溫度為60℃以上。

在步驟5中底物式1化合物的投料濃度為≤4％(相對(duì)于發(fā)酵液容積)；優(yōu)選投料濃度為1％～3％，發(fā)酵溫度30～34℃，優(yōu)選促溶劑加入量為2～5％(v/v)。生物脫氫反應(yīng)時(shí)間30～72小時(shí)。

生物脫氫反應(yīng)結(jié)束后終止反應(yīng)，優(yōu)選采用將發(fā)酵液升溫至70～90℃而使菌體滅活的方法，終止反應(yīng)后用優(yōu)選采用溶媒萃取發(fā)酵液的形式提取脫氫產(chǎn)物。所述萃取用溶媒優(yōu)選乙酸乙酯。

所述生物脫氫所使用簡單節(jié)桿菌(拉丁命名：arthrobactersimplex)優(yōu)選以下幾種菌株：as1.754、as1.94*(均由中國科學(xué)院微生物研究所提供)。

所述的生物脫氫反應(yīng)可以采用以下發(fā)酵工藝：

斜面培養(yǎng)—一級(jí)培養(yǎng)—一級(jí)培養(yǎng)—加入化合物(1)發(fā)酵進(jìn)行生物脫氫反應(yīng)—終止反應(yīng)。

所述的生物發(fā)酵工藝還可采用任何公知的生物發(fā)酵工藝方法，如參考《生物合成藥物學(xué)》(化學(xué)工業(yè)出版社，2000年出版，褚志義主編；666～675頁)中公開的生物發(fā)酵工藝。

所述的生物脫氫所用的培養(yǎng)基優(yōu)選采用以下配比：

斜面培養(yǎng)基(％)：葡萄糖1.3，酵母膏1.3，瓊脂2.0，以及余量的蒸餾水，ph7.0-7.2，用于斜面培養(yǎng)

發(fā)酵培養(yǎng)基(％)：葡萄糖1.0，酵母膏0.16，kh2po40.25，玉米漿0.1，以及余量的蒸餾水，ph7.0-7.2，用于一級(jí)、二級(jí)培養(yǎng)和最終的生物脫氫反應(yīng)中。

具體實(shí)施方式

hplc：高效液相色譜

實(shí)施例1

實(shí)施例1-1

將10g式3化合物投入到50ml15％硫酸水溶液中，常溫?cái)嚢柚翢o原料，將反應(yīng)液稀釋入200ml冰水中，5％naoh水溶液中和稀釋液至中性。過濾，洗滌。烤干，得到式4化合物8.1g。

實(shí)施例1-2

將10g式3化合物投入到25ml25％硫酸水溶液中，常溫?cái)嚢柚翢o原料，將反應(yīng)液稀釋入200ml冰水中，15％koh水溶液中和稀釋液至中性。過濾，洗滌。烤干，得到式4化合物8.4g。

實(shí)施例1-3

將10g式3化合物投入到20ml40％硫酸水溶液中，在10℃攪拌至無原料，將反應(yīng)液稀釋入300ml冰水中，20％na2co3水溶液中和稀釋液至中性。過濾，洗滌。 烤干，得到式4化合物8.3g。

實(shí)施例1-4

將10g式3化合物投入到15ml50％硫酸水溶液中，0℃攪拌至無原料，將反應(yīng)液稀釋入300ml冰水中，20％khco3水溶液中和稀釋液至中性。過濾，洗滌?？靖桑玫绞?化合物8.3g。

實(shí)施例1-5

將10g式3化合物投入到50ml甲醇、50ml15％硫酸水溶液中，常溫?cái)嚢柚翢o原料，將反應(yīng)液稀釋入200ml冰水中，5％naoh水溶液中和稀釋液至中性。過濾，洗滌?？靖桑玫绞?化合物8.1g。

實(shí)施例1-6

將10g式3化合物投入到40ml乙醇、25ml25％硫酸水溶液中，常溫?cái)嚢柚翢o原料，將反應(yīng)液稀釋入200ml冰水中，15％koh水溶液中和稀釋液至中性。過濾，洗滌?？靖?，得到式4化合物8.4g。

實(shí)施例1-7

將10g式3化合物投入到40ml無水乙醇、20ml40％硫酸水溶液中，在10℃攪拌至無原料，將反應(yīng)液稀釋入300ml冰水中，20％na2co3水溶液中和稀釋液至中性。過濾，洗滌?？靖桑玫绞?化合物8.3g。

實(shí)施例1-8

將10g式3化合物投入到50ml無水甲醇、15ml50％硫酸水溶液中，0℃攪拌至無原料，將反應(yīng)液稀釋入300ml冰水中，20％khco3水溶液中和稀釋液至中性。過濾，洗滌?？靖?，得到式4化合物8.3g。

實(shí)施例2

實(shí)施例2-1

將10g式4化合物投入到30ml甲醇和1ml60％koh水溶液中，攪拌均勻。再加入8ml的丙酮氰醇，攪拌反應(yīng)至原料點(diǎn)消失。再將反應(yīng)液稀釋入150ml水中，用稀鹽酸中和稀釋液至中性。過濾，洗滌?？靖桑玫绞?化合物9.9g。

實(shí)施例2-2

將10g式4化合物投入到20ml甲醇和0.5ml50％koh水溶液中，攪拌均勻。再 加入15ml的丙酮氰醇，攪拌反應(yīng)至原料點(diǎn)消失。再將反應(yīng)液稀釋入300ml水中，用稀鹽酸中和稀釋液至中性。過濾，洗滌?？靖桑玫绞?化合物10.3g。

實(shí)施例2-3

將10g式4化合物投入到15ml甲醇和0.2ml40％氫氧化鈉水溶液中，攪拌均勻。再加入20ml的丙酮氰醇，攪拌反應(yīng)至原料點(diǎn)消失。再將反應(yīng)液稀釋入300ml水中，用稀鹽酸中和稀釋液至中性。過濾，洗滌?？靖?，得到式5化合物10.3g。

實(shí)施例2-4

將10g式4化合物投入到10ml甲醇和0.1ml30％氫氧化鈉水溶液中，攪拌均勻。再加入25ml的丙酮氰醇，攪拌反應(yīng)至原料點(diǎn)消失。再將反應(yīng)液稀釋入200ml水中，用稀鹽酸中和稀釋液至中性。過濾，洗滌?？靖桑玫绞?化合物10.2g。

實(shí)施例3

實(shí)施例3-1

將10g式5化合物投入到15ml乙二醇中，再依次加入0.1g對(duì)甲苯磺酸、20ml原甲酸三乙酯，升溫至55-60℃反應(yīng)至原料點(diǎn)消失。加入適量吡啶中和。然后將反應(yīng)液稀釋入100ml水中，過濾，洗滌。烤干，得到式6化合物10.2g。

實(shí)施例3-2

將10g式5化合物投入到20ml乙二醇中，再依次加入0.2g對(duì)甲苯磺酸、15ml原甲酸三乙酯，升溫至50-55℃反應(yīng)至原料點(diǎn)消失。加入適量吡啶中和。然后將反應(yīng)液稀釋入150ml水中，過濾，洗滌?？靖?，得到式6化合物10.3g。

實(shí)施例3-3

將10g式5化合物投入到25ml乙二醇中，再依次加入0.2g對(duì)甲苯磺酸、10ml原甲酸三乙酯，升溫至40-45℃反應(yīng)至原料點(diǎn)消失。加入適量吡啶中和。然后將反應(yīng)液稀釋入200ml水中，過濾，洗滌?？靖?，得到式6化合物10.4g。

實(shí)施例3-2

將10g式5化合物投入到30ml乙二醇中，再依次加入0.3g對(duì)甲苯磺酸、20ml原甲酸三乙酯，升溫至30-35℃反應(yīng)至原料點(diǎn)消失。加入適量吡啶中和。然后將反應(yīng)液稀釋入200ml水中，過濾，洗滌?？靖桑玫绞?化合物10.3g。

實(shí)施例4

實(shí)施例4-1

將式6化合物10g和5ml的乙烯基正丁醚投入到50ml含有0.01％對(duì)甲苯磺酸的四氫呋喃溶液中，攪拌反應(yīng)至無原料，得到反應(yīng)的中間體。

再滴加入30ml的3m的格氏試劑甲基氯化鎂/四氫呋喃中，滴加完成后，攪拌反應(yīng)至無中間體。再用飽和氯化銨水溶液緩慢滴加淬滅格氏試劑，然后用濃鹽酸調(diào)反應(yīng)液ph至1-2。加熱反應(yīng)液至60-70℃保溫1小時(shí)，再降溫至15-20℃，用10％氫氧化鈉水溶液調(diào)ph至中性，濃縮除去四氫呋喃。將濃縮殘夜稀釋入100ml水中。過濾，洗滌?！婵靖?，得到式1化合物8.8g。

實(shí)施例4-2

將式6化合物10g和7.5ml的乙烯基正丁醚投入到40ml含有0.1％對(duì)甲苯磺酸的乙醚溶液中，攪拌反應(yīng)至無原料，得到反應(yīng)的中間體。

再滴加入35ml的3m的格氏試劑甲基氯化鎂/四氫呋喃中，滴加完成后，攪拌反應(yīng)至無中間體。再用飽和氯化銨水溶液緩慢滴加淬滅格氏試劑，然后用濃鹽酸調(diào)反應(yīng)液ph至1-2。加熱反應(yīng)液至50-60℃保溫2小時(shí)，再降溫至10-15℃，用20％碳酸鉀水溶液調(diào)ph至中性，濃縮除去四氫呋喃。將濃縮殘夜稀釋入150ml水中。過濾，洗滌?！婵靖桑玫绞?化合物9.0g。

實(shí)施例4-3

將式6化合物10g和9ml的乙烯基正丁醚投入到30ml含有0.1％對(duì)甲苯磺酸的1,2-二氧六環(huán)溶液中，攪拌反應(yīng)至無原料，得到反應(yīng)的中間體。

再滴加入40ml的3m的格氏試劑甲基氯化鎂/四氫呋喃中，滴加完成后，攪拌反應(yīng)至無中間體。再用飽和氯化銨水溶液緩慢滴加淬滅格氏試劑，然后用濃鹽酸調(diào)反應(yīng)液ph至1-2。加熱反應(yīng)液至45-55℃保溫4小時(shí)，再降溫至15-20℃，用30％碳酸氫鈉水溶液調(diào)ph至中性，濃縮除去四氫呋喃。將濃縮殘夜稀釋入200ml水中。過濾，洗滌?！婵靖?，得到式1化合物9.1g。

實(shí)施例5

實(shí)施例5-1

將簡單節(jié)桿菌(as1.754)依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、一級(jí)培養(yǎng)和二級(jí)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為31-33℃，將20g式6化合物溶于20ml四氫呋喃投入5l發(fā)酵罐中，投料濃度為2％，反應(yīng)溫度為31℃。直至式6化合物剩余低于5％，反應(yīng)完成后升溫至70℃終止反應(yīng)，采用乙酸乙酯萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī)相濃縮，甲醇重結(jié)晶得到式7化合物17.5g。

實(shí)施例5-2

將簡單節(jié)桿菌(as1.94*)依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、一級(jí)培養(yǎng)和二級(jí)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為29-32℃，將20g式6化合物溶于30ml甲醇投入5l發(fā)酵罐中，投料濃度為3％，反應(yīng)溫度為32℃，直至式6化合物剩余低于5％，反應(yīng)完成后升溫至70℃終止反應(yīng)，采用氯仿萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī)相濃縮，甲醇重結(jié)晶得到式7化合物18.2g。

實(shí)施例5-3

將簡單節(jié)桿菌(as1.754)依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、一級(jí)培養(yǎng)和二級(jí)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30-32℃，將20g式6化合物溶于40mln，n-二甲基甲酰胺投入5l發(fā)酵罐中，投料濃度為4％，反應(yīng)溫度為32℃，直至式6化合物剩余低于5％，反應(yīng)完成后升溫至70℃終止反應(yīng)，采用二氯甲烷萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī)相濃縮，甲醇重結(jié)晶得到式7化合物18.6g。

實(shí)施例6

實(shí)施例6-1

將10g式7化合物投入到50ml醋酸中，再加入10％的鹽酸氨基脲水溶液。將反應(yīng)混合液加熱至60-65℃反應(yīng)至無原料點(diǎn)。降溫至室溫，稀釋入200ml水中，過濾，得到8.9g式2化合物。

實(shí)施例6-2

將10g式7化合物投入到100ml醋酸中，再加入8％的鹽酸氨基脲水溶液。將反應(yīng)混合液加熱至70-75℃反應(yīng)至無原料點(diǎn)。降溫至室溫，稀釋入400ml水中，過濾，得到9.1g式2化合物。

實(shí)施例6-3

將10g式7化合物投入到100ml醋酸中，再加入5％的鹽酸氨基脲水溶液。將反應(yīng)混合液加熱至80-85℃反應(yīng)至無原料點(diǎn)。降溫至室溫，稀釋入400ml水中，過濾，得到9.2g式2化合物。

實(shí)施例6-4

將10g式7化合物投入到150ml醋酸中，再加入3％的鹽酸氨基脲水溶液。將反應(yīng)混合液加熱至85-90℃反應(yīng)至無原料點(diǎn)。降溫至室溫，稀釋入500ml水中，過濾，得到9.2g式2化合物。