本發(fā)明涉及一株產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶節(jié)桿菌產(chǎn)及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
低聚乳果糖是一種功能性低聚糖，具有促進(jìn)腸道雙歧桿菌增殖，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，改善腸道免疫力等特殊生理功能，甜度為蔗糖的30％，甜味特性類(lèi)似于蔗糖，甜味質(zhì)量是各種低聚糖中最佳的，因此可以應(yīng)用于食品工業(yè)中而不必?fù)?dān)心其對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味產(chǎn)生影響。商業(yè)化生產(chǎn)的低聚乳果糖，由于含有蔗糖、乳糖等其他成分，因而甜度要略高一些。與其它低聚糖相比，低聚乳果糖對(duì)酸、熱具有較高的穩(wěn)定性，其穩(wěn)定性與蔗糖相似，在中性條件下穩(wěn)定，在酸性條件下相對(duì)更穩(wěn)定，pH 7.0下80℃加熱2h和pH 3.0下80℃加熱2h，都幾乎不發(fā)生分解，在pH 4.5的條件下，其加熱溫度甚至可達(dá)到120℃。低聚乳果糖還具有高的保濕性，能使食品保持濕潤(rùn)，可防止面包、點(diǎn)心等淀粉類(lèi)食品老化，延長(zhǎng)食品貨架期。
2005年調(diào)查表明，低聚乳果糖已成為日本第三大功能性低聚糖消費(fèi)品。近年來(lái)許多研究者發(fā)現(xiàn)低聚乳果糖具有許多特定的生理功能，有望成為繼低聚乳果糖、低聚半乳糖后又一種被全球認(rèn)可的功能性食品添加劑。
酶法合成是工業(yè)化生產(chǎn)低聚乳果糖的主要途徑，酶法合成低聚乳果糖的產(chǎn)率低一直是制約酶法合成發(fā)展的重要難題，因此，尋找一種高酶活性的β-呋喃果糖苷酶成為解決低聚乳果糖生產(chǎn)瓶頸的關(guān)鍵。
中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN101624582A(申請(qǐng)?zhí)?00910115791.1)公開(kāi)了一種節(jié)桿菌產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵方法，屬生物技術(shù)工程領(lǐng)域，發(fā)酵培養(yǎng)基組成成份為：蔗糖3～7g/L，牛肉膏25～40g/L，酵母膏2～3g/L，(NH4)2HPO4 8～12g/L，KH2PO4 0.5～1g/L，MgSO4·7H2O0.1～0.5g/L，余為水；先將菌種活化、培養(yǎng)，然后加入上述發(fā)酵培養(yǎng)基，初始pH值為6.0～8.0，發(fā)酵溫度為25～45℃，接種量為1～4％；本發(fā)明大大優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)基配方，菌株生物量高、產(chǎn)酶量高、酶活性高。
上述技術(shù)方案從培養(yǎng)環(huán)境入手，得到的培養(yǎng)基和發(fā)酵方法可以提高酶產(chǎn)量，但制約酶產(chǎn)量和酶活的主要因素是在菌株方面，因此尋找酶產(chǎn)量高、酶活高的菌株，成為目前的研究熱點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一株產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶節(jié)桿菌及其應(yīng)用。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供該節(jié)桿菌株在生產(chǎn)低聚乳果糖中的應(yīng)用，由于該菌株所產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶具有高合成低聚乳果糖的能力，可顯著降低生產(chǎn)成本。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一株節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004，2016年8月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)CGMCC No.12855。
本發(fā)明所述節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004的原始菌株分離于山東德州百龍創(chuàng)園生產(chǎn)車(chē)間附近的土壤，并經(jīng)過(guò)誘變后獲得。該菌株呈乳白色，半透明狀，尺寸約2～4μm×1.8～3.5μm。革蘭氏染色呈陽(yáng)性，短桿狀，單個(gè)或成對(duì)排列，培養(yǎng)周期中伴隨著桿狀、球狀形態(tài)的變化。該菌株可高產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶，生成低聚乳果糖的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到30％以上，轉(zhuǎn)化應(yīng)用于生產(chǎn)中可大大提高以蔗糖和乳糖為底物生成低聚乳果糖的能力，降低生產(chǎn)成本，有助于低聚乳果糖產(chǎn)品的推廣。
上述節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004的培養(yǎng)方法，步驟如下：
(1)取節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004接種于固體培養(yǎng)基中，在28-35℃的條件下，培養(yǎng)24-48h，制得活化菌株；
(2)取步驟(1)制得的活化菌株，接種于種子培養(yǎng)基中，在28～35℃的條件下，增殖培養(yǎng)24-48h，即得種子液；
(3)取步驟(2)制得的種子液，按體積比1～10％的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28～35℃擴(kuò)大培養(yǎng)36～60h，即得菌體發(fā)酵液。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中的種子培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：
葡萄糖2％，酵母膏1.5％，磷酸二氫鉀0.2％，磷酸氫二銨0.6％，七水硫酸鎂0.01％，pH6.0～7.2。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中的發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：
蔗糖4％，乳糖1％，酵母膏1.2％，蛋白胨0.8％，七水硫酸鎂0.1％，磷酸氫二銨0.4％，pH 6.0～7.2。
所述步驟(1)中的固體培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常規(guī)固體培養(yǎng)基，如LB培養(yǎng)基等。
上述節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004在制備β-呋喃果糖苷酶中的應(yīng)用。
上述應(yīng)用，步驟如下：
(a)取上述制備的菌體發(fā)酵液經(jīng)固液分離，洗滌菌體，合并分離液及洗滌液，制得粗酶液；
(b)將步驟(a)制得的粗酶液中加入固體氯化鈉，制得0.1～0.5mol/L的混合溶液，冷藏靜止2h，固液分離，取上清液，再加入固體氯化鈉，使溶液達(dá)到90％的硫酸銨飽和度，冷藏靜止2h，固液分離，取沉淀，溶解于pH 7.8、0.05mol/L的磷酸鹽緩沖中，制得β-呋喃果糖苷酶。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(a)的洗滌菌體為采用pH 7.0、濃度40mmol/L的磷酸緩沖液重懸，然后經(jīng)固液分離，取液體，制得洗滌液。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(a)、(b)中的固液分離均為在4℃、4000r/min條件下，離心40min。
上述制備的β-呋喃果糖苷酶在制備低聚乳果糖中的應(yīng)用。
有益效果
本發(fā)明從土壤中分離出節(jié)桿菌，在經(jīng)過(guò)紫外誘變、亞硝基胍誘變處理等誘變處理技術(shù)，最后獲得高產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶的高產(chǎn)菌株命名為BLCY-004，其酶活達(dá)到1100U/ml，相對(duì)于傳統(tǒng)β-呋喃果糖苷酶活力提高50％以上，應(yīng)用于低聚乳果糖生產(chǎn)中可大大提高蔗糖轉(zhuǎn)化成低聚乳果糖的能力，顯著降低生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。
實(shí)施例1
一株節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004，2016年8月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)CGMCC No.12855。
上述節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004的篩選過(guò)程如下：
(1)富集培養(yǎng)
選取山東德州百龍創(chuàng)園生產(chǎn)車(chē)間附近的土壤，用小鏟子除去表土，取離地面5-15cm處的土壤約10g，用無(wú)菌水稀釋10倍，加入培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)基成分：葡萄糖2％，酵母膏1.5％，磷酸二氫鉀0.2％，磷酸氫二銨0.6％，七水硫酸鎂0.01％，pH為6.5；培養(yǎng)溫度為28-35℃，培養(yǎng)36h。
(2)純種分離
采用劃線(xiàn)分離法，取一支盛有5ml無(wú)菌水的大試管，取步驟(1)中富集培養(yǎng)后的菌液2ml放入其中稀釋?zhuān)浞终袷幏稚?，用接種環(huán)以無(wú)菌操作挑取稀釋液一環(huán)先在平板培養(yǎng)基一邊做第一次平行劃線(xiàn)3-4條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約60度角，將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后同一次劃線(xiàn)方法做第二次劃線(xiàn)，同法依次做第三次和第四次劃線(xiàn)。劃線(xiàn)完畢，蓋上皿蓋，將培養(yǎng)皿倒置，30℃培養(yǎng)36h后，挑取單個(gè)菌落接種于10個(gè)斜面培養(yǎng)基上，分別編號(hào)01-10。
將01-10斜面種子接種于搖瓶培養(yǎng)基中培養(yǎng)32℃培養(yǎng)36h，對(duì)01-10搖瓶發(fā)酵液β-呋喃果糖苷酶酶活進(jìn)行測(cè)定，04號(hào)搖瓶酶活最高，達(dá)到505U/ml。
平板培養(yǎng)基成分：葡萄糖2％，酵母膏1.5％，磷酸二氫鉀0.2％，磷酸氫二銨0.6％，七水硫酸鎂0.01％，瓊脂2％，pH為pH6.0-7.2。
搖瓶培養(yǎng)基成分：蔗糖4％，乳糖1％，酵母膏1.2％，蛋白胨0.8％，七水硫酸鎂0.1％，磷酸氫二銨0.4％，pH 6.0-7.2。
(3)誘變篩選
對(duì)04號(hào)菌種進(jìn)行紫外線(xiàn)誘變，紫外線(xiàn)誘變采用15W紫外線(xiàn)燈20cm照射，照射時(shí)間為150s，最終得到高產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶的高產(chǎn)菌株命名為BLCY-004，其酶活達(dá)到1100U/ml。
酶活定義如下：在pH 6.0，40℃以蔗糖作為底物進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，每分鐘使還原能力增加相當(dāng)于2μmol的D-葡萄糖的量的酶量定于為1個(gè)活力單位(U)。
實(shí)施例2
實(shí)施例1所述的節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004的培養(yǎng)方法，步驟如下：
(1)取節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004接種于LB培養(yǎng)基中，在30℃的條件下，活化培養(yǎng)30h，制得活化菌株；
(2)取步驟(1)制得的活化菌株，接種于種子培養(yǎng)基中，在32℃的條件下，增殖培養(yǎng)36h，制得種子液；
所述種子培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：
葡萄糖2％，酵母膏1.5％，磷酸二氫鉀0.2％，磷酸氫二銨0.6％，七水硫酸鎂0.01％，pH6.5。
(3)取步驟(2)制得的種子液，按體積比1％的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃，擴(kuò)大培養(yǎng)35h，即得菌體發(fā)酵液；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：
蔗糖4％，乳糖1％，酵母膏1.2％，蛋白胨0.8％，七水硫酸鎂0.1％，磷酸氫二銨0.4％，pH 6.5。
經(jīng)檢測(cè)，上述制得的菌體發(fā)酵液的菌體濃度為6.5×1010cfu/ml。
實(shí)施例3
實(shí)施例1所述的節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004的培養(yǎng)方法，步驟如下：
(1)取節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004接種于LB培養(yǎng)基中，在31℃的條件下，活化培養(yǎng)36h，制得活化菌株；
(2)取步驟(1)制得的活化菌株，接種于種子培養(yǎng)基中，在32℃的條件下，增殖培養(yǎng)36h，制得種子液；
所述種子培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：
葡萄糖2％，酵母膏1.5％，磷酸二氫鉀0.2％，磷酸氫二銨0.6％，七水硫酸鎂0.01％，pH 7.0。
(3)取步驟(2)制得的種子液，按體積比5％的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃，擴(kuò)大培養(yǎng)40h，即得菌體發(fā)酵液；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：
蔗糖4％，乳糖1％，酵母膏1.2％，蛋白胨0.8％，七水硫酸鎂0.1％，磷酸氫二銨0.4％，pH 6.8。
經(jīng)檢測(cè)，上述制得的菌體發(fā)酵液的菌體濃度為6.0×1010cfu/ml。
實(shí)施例4
實(shí)施例1所述的節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004的培養(yǎng)方法，步驟如下：
(1)取節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004接種于LB培養(yǎng)基中，在35℃的條件下，活化培養(yǎng)48h，制得活化菌株；
(2)取步驟(1)制得的活化菌株，接種于種子培養(yǎng)基中，在35℃的條件下，增殖培養(yǎng)48h，制得種子液；
所述種子培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：
葡萄糖2％，酵母膏1.5％，磷酸二氫鉀0.2％，磷酸氫二銨0.6％，七水硫酸鎂0.01％，pH 7.2。
(3)取步驟(2)制得的種子液，按體積比10％的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35℃，擴(kuò)大培養(yǎng)48h，即得菌體發(fā)酵液；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比：
蔗糖4％，乳糖1％，酵母膏1.2％，蛋白胨0.8％，七水硫酸鎂0.1％，磷酸氫二銨0.4％，pH 7.2。
經(jīng)檢測(cè)，上述制得的菌體發(fā)酵液的菌體濃度為7.0×1010cfu/ml。
實(shí)施例5
節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004在制備β-呋喃果糖苷酶中的應(yīng)用。
上述應(yīng)用，步驟如下：
(a)分別取實(shí)施例2～4制備的菌體發(fā)酵液經(jīng)4℃、4000r/min條件下離心40min，收集分離液，沉淀為菌體，用pH 7.0、濃度40mmol/L的磷酸緩沖液重懸，經(jīng)4℃、10000r/min條件下離心40min，收集洗滌液，合并分離液及洗滌液，制得粗酶液；
(b)將步驟(a)制得的粗酶液加入固體氯化鈉，制得0.1-0.5mol/L的混合溶液，冷藏靜止2h，固液分離，取上清液，再加入固體氯化鈉，使溶液達(dá)到90％的硫酸銨飽和度，冷藏靜止2h，固液分離，取沉淀，溶解于pH 7.8、0.05mol/L的磷酸鹽緩沖中，制得β-呋喃果糖苷酶。
經(jīng)檢測(cè)，實(shí)施例2中每毫升發(fā)酵液能夠產(chǎn)生6000μgβ-呋喃果糖苷酶，實(shí)施例3中每毫升發(fā)酵液能夠產(chǎn)生5800ugβ-呋喃果糖苷酶，實(shí)施例4中每毫升發(fā)酵液能夠產(chǎn)生6300μgβ-呋喃果糖苷酶。
將上述β-呋喃果糖苷酶配制成濃度為15000μg/ml的β-果糖基轉(zhuǎn)移酶溶液，經(jīng)檢測(cè)，酶活達(dá)到1100U/ml；
在相同濃度條件下檢測(cè)04號(hào)節(jié)桿菌原始菌株所產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶，酶活為505U/ml。
由上述結(jié)果可以看出本申請(qǐng)所述節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)BLCY-004菌株所產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶酶活遠(yuǎn)高于原始出發(fā)菌株。