本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種嗜根考克氏菌。

背景技術(shù)：

真菌毒素是真菌在食品或飼料里生長(zhǎng)所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，對(duì)人類和動(dòng)物都有害，真菌毒素污染是我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和食品安全中的重大問(wèn)題，食品安全關(guān)系到每個(gè)人的利益，因此有效的防止真菌毒素污染食品或農(nóng)產(chǎn)品是一個(gè)亟需解決的問(wèn)題。

現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于真菌毒素的防治可以分為物理法、化學(xué)藥劑法和生物防治法，物理法治標(biāo)不治本，化學(xué)藥劑法效率高，對(duì)真菌毒素的殺傷力大，但卻存在嚴(yán)重的化學(xué)藥劑殘留的問(wèn)題，化學(xué)藥劑的殘留會(huì)使吃了飼料的動(dòng)物體內(nèi)殘留，從而影響人類的身體健康；生物防治法主要是利用能夠降解或者抑制體內(nèi)殘留的微生物防治真菌毒素，然而現(xiàn)有分離出來(lái)的微生物對(duì)毒素的降解作用太弱，出現(xiàn)的微生物種類少，難以滿足真菌毒素的防治的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，提供一株新的能夠降解真菌毒素的嗜根考克氏菌。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

一株嗜根考克氏菌，嗜根考克氏菌被稱為CAMT21651（KR-51），于2016年6月21日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC），地址為：廣州市先烈中路100號(hào)大院59號(hào)樓5樓，廣東省微生物研究所；保藏編號(hào)為：GDMCC No.60048，分類學(xué)命稱：Kocuria rhizophila。

優(yōu)選地，所述嗜根考克氏菌的16S rRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。

優(yōu)選地，所述嗜根考克氏菌為球狀、革蘭氏陽(yáng)性，菌落為亮黃色，呈圓形凸起，整齊濕潤(rùn)不透明，菌落直徑為0.423～1.283 mm。

優(yōu)選地，所述嗜根考克氏菌的硝酸鹽還原試驗(yàn)為陽(yáng)性，接觸酶陽(yáng)性。

優(yōu)選地，所述嗜根考克氏菌的氧化酶、V-P試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、酪氨酸水解、脲酶、糖發(fā)酵試驗(yàn)均為陰性。

該菌對(duì)真菌毒素具有降解作用，特別是對(duì)DON毒素具有降解作用。

將該菌的菌懸液添加入飼料中喂養(yǎng)動(dòng)物，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物體內(nèi)毒素殘留明顯的下降。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明通過(guò)從攝取真菌毒素的對(duì)蝦體內(nèi)成功分離獲得耐真菌毒素的微生物，該微生物被鑒定為嗜根考克氏菌CAMT21651（KR-51），于2016年6月21日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC），地址為：廣州市先烈中路100號(hào)大院59號(hào)樓5樓，廣東省微生物研究所；保藏編號(hào)為：GDMCC No：60048；該菌能夠顯著降低動(dòng)物體內(nèi)真菌毒素的殘留量，從而為真菌毒素的生物防治奠定了基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為嗜根考克氏菌CAMT21651（KR-51）的電鏡掃描圖。

圖2為嗜根考克氏菌CAMT21651（KR-51）的的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋說(shuō)明，但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明作任何限定。除非特別說(shuō)明，實(shí)施例中所涉及的試劑、方法均為本領(lǐng)域常用的試劑和方法。本發(fā)明對(duì)化合物的來(lái)源不做任何形式的限定。

實(shí)施例1 耐DON的微生物的分離

（1）制備DON蓄積的蝦仁

隨機(jī)挑選體質(zhì)健康、個(gè)體大小均一的南美白對(duì)蝦（5±0.5g），按照每組40尾（設(shè)3個(gè)平行）隨機(jī)分配到長(zhǎng)方形硬塑養(yǎng)殖箱（容積40×30×12cm³）中，利用充氣式養(yǎng)殖系統(tǒng)保持海水溶氧量DO>6mg/L，pH6.5～7.5；水溫24～28 ℃；鹽度9.18～11.99 ‰。每天換1/3體積的水，采用自然光照，每日飼料量為南美白對(duì)蝦體重的5%，每日分為三次，早上9點(diǎn)一次，下午3點(diǎn)一次，晚上9點(diǎn)一次，每日飼料飼喂比為2：3：5。

以四天為一個(gè)周期，DON真菌毒素按照四天換一種劑量添加到飼料中喂養(yǎng)對(duì)蝦，真菌毒素的起始添加劑量是6 mg/kg·feed，每天染毒，每個(gè)周期真菌毒素的添加劑量遞增1.5倍。四天為一個(gè)周期取樣一次，在無(wú)菌超凈臺(tái)去除蝦頭、蝦尾、蝦殼、蝦腸、以及提取出肝胰腺等，得到蝦肌肉于-20 ℃保存。

（2）染毒蝦仁中分離DON的耐受菌

在無(wú)菌超凈臺(tái)中用滅菌剪刀將一尾蝦的蝦仁剪細(xì)碎，從中取出蝦肉25.0 g于滅菌225mL生理鹽水，在漩渦混合器中漩渦120 s，制成1：10的樣品勻液。用移液槍吸取1：10的樣品勻液1mL，沿試管內(nèi)壁緩慢注入裝有9mL的滅菌生理鹽水的試管中，搖晃試管或者用移液槍頭反復(fù)吹打混合均勻，制成1：100的樣品勻液。以此類推制備10倍系列稀釋樣品的勻液，每遞增稀釋一次，更換一次1mL移液槍頭，最后得到10^-1～10^-3稀釋度的樣品勻液。在三個(gè)稀釋度中分別取0.1mL樣品稀釋液于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）上，均勻涂布，置于30℃培養(yǎng)48h后計(jì)算菌落總數(shù)并選擇具有代表性單菌落，用三段劃線法劃線純化。從冷凍蝦仁中分離到一株耐 DON的菌KR-51，耐受DON濃度為1 mg/kg。

（3）毒素耐受菌KR-51的生長(zhǎng)特性及生理生化鑒定

KR-51菌落為亮黃色革蘭氏陽(yáng)性球菌，菌落直徑為0.423～1.283 mm，菌落呈圓形凸起，整齊濕潤(rùn)不透明，最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基為改良TGY培養(yǎng)基（10g 胰蛋白胨，5g 酵母浸粉，1g 葡萄糖，30g NaCl，1000 mL 蒸餾水，pH為7.0～7.5），最適生長(zhǎng)溫度為 30 ℃，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性，接觸酶陽(yáng)性，而氧化酶、V-P試驗(yàn)、吲哚、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、明膠液化、酪氨酸水解、脲酶、糖類發(fā)酵試驗(yàn)（葡萄糖、海藻糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、D-木糖）等均呈現(xiàn)陰性，該菌株的電鏡掃描圖如圖1。

（4）耐受菌KR-51分離株的16S rRNA 基因序列測(cè) 序 及 同 源 性 比 較

將目標(biāo)菌的菌株劃線接種于改良TGY培養(yǎng)基中，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，得到單菌落。

以引物1：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和引物2：5’-CGGCTACCTTGTTACGAC-3’ 作為上下游引物。建立30μL的PCR反應(yīng)體系： 15 μL 2×MightyAmp polymerase Ver.2，12.9μL雙蒸水，0.75μL上游引物1，0.75μL下游引物2 和0.6μL DNA聚合酶。最后挑取微量的單菌落作為DNA模板，加入30 μL PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序第一階段： 98 ℃預(yù)變性2min；第二階段：98 ℃變性10 s、58 ℃退火15 s、68 ℃延伸90 s，40個(gè)循環(huán)；第三個(gè)階段10 ℃保存20 min。

PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL核酸染料混合，點(diǎn)樣于凝膠孔上，進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳（121V，30min），用凝膠成像儀觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，16S rRNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物工程計(jì)算服務(wù)有限公司完成。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，將16S rRNA序列登陸數(shù)據(jù)庫(kù)EzBioCloud中進(jìn)行相似性比對(duì)搜索，從中獲得相似性較高且是有效描述的典型菌株的16S rRNA序列作為參比對(duì)象，，利用MEGA6.0的Neighbor Joining法建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并進(jìn)行Bootstraps檢驗(yàn)。結(jié)果檢測(cè)發(fā)現(xiàn)毒素耐受菌KR-51被鑒定為嗜根考克氏菌（Kocuria rhizophila），該菌株的遺傳系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2。

該毒素耐受菌KR-51被稱為CAMT21651（KR-51），于2016年6月21日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC），地址為：廣州市先烈中路100號(hào)大院59號(hào)樓5樓，廣東省微生物研究所；保藏編號(hào)為：GDMCC No：60048。

實(shí)施例2 KR-51對(duì)水產(chǎn)飼料中DON 毒素在對(duì)蝦體內(nèi)殘留量的消減

選取對(duì)蝦600 尾，隨機(jī)分成4個(gè)處理組，分別為基礎(chǔ)飼料組、基礎(chǔ)飼料+ DON組、基礎(chǔ)飼料 + 嗜根考克氏菌制劑組、基礎(chǔ)飼料 + DON + 嗜根考克氏菌制劑組（嗜根考克氏菌制劑的添加量為1000 mL/kg·feed（0.02%質(zhì)量分?jǐn)?shù)，1×10⁸～3.6×10⁸CFU/g·feed））。

（1）基礎(chǔ)飼料 + DON組：制備DON微膠囊毒飼料，DON毒素設(shè) 6、9、13.15、20.25和30.375 mg/kg·feed劑量組。

（2）基礎(chǔ)飼料 + 嗜根考克氏菌制劑組：挑取實(shí)施例1所述嗜根考克氏菌株接種在改良TGY培養(yǎng)基中，32 ℃培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)24h的嗜根考克氏菌發(fā)酵液按1：1的比例均勻噴灑到基礎(chǔ)飼料中（嗜根考克氏菌在飼料中的含量為1×10⁸～3.6×10⁸ CFU/g·feed）。

（3）基礎(chǔ)飼料+DON+嗜根考克氏菌制劑組：配制不同劑量的DON飼料組，加入嗜根考克氏菌（嗜根考克氏菌在飼料中的含量為1×10⁸～3.6×10⁸ CFU/g·feed）。

試驗(yàn)采用劑量遞增法染毒，以飼料中DON含量為6 mg/kg·feed作為起始染毒劑量，每天染毒，4天為一周期，每期遞增1.5倍，連續(xù)染毒20天，并設(shè)置空白對(duì)照。

采用LC-MS/MS方法檢測(cè)對(duì)蝦肌肉中DON毒素的殘留量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：和基礎(chǔ)飼料+DON組相比，基礎(chǔ)飼料+DON + 嗜根考克氏菌制劑組中消除DON殘留率最高為37.01%±0.75，最終消除殘留量為8.55±0.93 ng/g。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣東海洋大學(xué)

<120> 一種嗜根考克氏菌

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1132

<212> DNA

<213> 16S rRNA序列

<400> 1

gtgcaatgcg cagctaccat gcagtcgacg ctgagcttgg tgcttgcact gggtggatga 60

gtggcgaacg ggtgagtaat acgtgagtaa cctgcccttg actctgggat aagcctggga 120

aactgggtct aatactggat acgacatgtc accgcatggt ggtgtgtgga aagggtttta 180

ctggttttgg atgggctcac ggcctatcag cttgttggtg gggtaatggc tcaccaaggc 240

gacgacgggt agccggcctg agagggtgac cggccacact gggactgaga cacggcccag 300

actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcggaagcct gatgcagcga 360

cgccgcgtga gggatgacgg ccttcgggtt gtaaacctct ttcagcacgg aagaagcgaa 420

agtgacggta cgtgcagaag aagcgccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 480

tagggcgcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagag ctcgtaggcg gtttgtcgcg 540

tctgctgtga aagcccgggg cttaaccccg ggtgtgcagt gggtacgggc agacttgagt 600

gcagtagggg agactggaat tcctggtgta gcggtgaaat gcgcagatat caggaggaac 660

accgatggcg aaggcaggtc tctgggctgt tactgacgct gaggagcgaa agcatgggga 720

gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca tgccgtaaac gttgggcact aggtgtgggg 780

aacattccac gttttccgcg ccgtagctaa cgcattaagt gccccgcctg gggagtacgg 840

ccgcaaggct aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggcgg agcatgcgga 900

ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc aagggcttga catacaccgg accgggccag 960

agatgtcttt ccccttgtgg ggctggtgta caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg 1020

tcgtgagatg tggttaagtc ccgcacgagc gcaaccctcg ttctatgttg gcagcacgtg 1080

atggtgggga ctcaatagga gaactgcccg gggtcaactt cggaaggaat gt 1132

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物1

<400> 2

gagagtttga tcctggctca g 21

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物2

<400> 3

cggctacctt gttacgac 18