本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，特別地，涉及一種弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基，及其制備和發(fā)酵方法，以及利用該培養(yǎng)基制備農(nóng)用弗氏鏈霉菌菌劑的方法。
背景技術(shù)：
鏈霉菌(Streptomycetaceae)是抗生素類(lèi)物質(zhì)的主要生產(chǎn)菌，在微生物產(chǎn)生的20000多種活性物質(zhì)中，鏈霉菌占到60％以上，是一類(lèi)作物有益菌，在農(nóng)業(yè)病害的生物防治上具有廣闊的應(yīng)用前景。弗氏鏈霉菌作為鏈霉菌屬(Streptomyces)的一個(gè)種類(lèi)，可產(chǎn)生泰樂(lè)霉素、新霉素等有效活性成分，對(duì)作物具有明顯的促生、抗病作用，越來(lái)越多地被應(yīng)用于果樹(shù)、蔬菜等多種作物栽培中。
但是，土壤中自然生長(zhǎng)的弗氏鏈霉菌數(shù)量太少，無(wú)法發(fā)揮上述作用。而現(xiàn)有技術(shù)中弗氏鏈霉菌多為液體發(fā)酵，發(fā)酵周期長(zhǎng)、產(chǎn)孢量少，難以滿(mǎn)足其作為農(nóng)用微生物菌劑的工業(yè)化生產(chǎn)的要求。
中國(guó)專(zhuān)利CN 102329754 B公開(kāi)了一種弗氏鏈霉菌新菌株的菌劑制備方法，包括先制備弗氏鏈霉菌新菌株的種子液，再將種子液轉(zhuǎn)接到固體增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)7-10天后，經(jīng)干燥獲得弗氏鏈霉菌新菌株原菌菌劑。該菌劑的制備方法采用液體+固體聯(lián)合發(fā)酵工藝進(jìn)行菌種增殖，所制備菌劑中含有效活菌數(shù)為50億/g以上，與傳統(tǒng)的液體發(fā)酵吸附成固體制劑的方式相比，產(chǎn)孢量更高，代謝產(chǎn)物量大，其產(chǎn)品的生物活性更好，保存期更長(zhǎng)。但是，該發(fā)明也存在缺點(diǎn)，譬如，其液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基的原料來(lái)源單一，養(yǎng)分不夠豐富，造成菌種生長(zhǎng)緩慢，菌劑生產(chǎn)周期長(zhǎng)，從菌種的活化到固體發(fā)酵結(jié)束后干燥得到菌劑原液，需要30天左右，限制了其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基及其制備和發(fā)酵方法，以及利用該培養(yǎng)基制備農(nóng)用弗氏鏈霉菌菌劑的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中液體發(fā)酵弗氏鏈霉菌產(chǎn)孢量少、發(fā)酵周期長(zhǎng)、難以制備農(nóng)用固體微生物菌劑，以及有效利用磷礦資源的技術(shù)問(wèn)題。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一種弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基，以重量份計(jì)，包括：3～10份玉米粉、3～18份豆粕粉、18～45份秸稈粉、10～30份草炭土、20～50份磷尾礦、1～10份碳酸鈣、40～50份營(yíng)養(yǎng)液。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述秸稈粉的粒徑細(xì)度優(yōu)選為30-50目；所述草炭土細(xì)度為40目；所述磷尾礦粉顆粒細(xì)度在80目以下；所述培養(yǎng)基的有機(jī)質(zhì)含量≥60％。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，以重量份計(jì)，所述營(yíng)養(yǎng)液包括1～10份的蔗糖、1～5份的硫酸銨、0.1～1份磷酸二氫鉀、85～92份水。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，培養(yǎng)基以重量份計(jì)，包括：5～10份的玉米粉、8～10份的豆粕粉、18～25份的秸稈粉、20～30份的草炭土、30～40份的磷尾礦、2～3份的碳酸鈣和43～48份蔗糖-硫酸銨營(yíng)養(yǎng)液。
更進(jìn)一步地，培養(yǎng)基包括以下重量份計(jì)的原料：10份玉米粉、10份豆粕粉、18份秸稈粉、30份草炭土、30份磷尾礦、2份碳酸鈣和45份蔗糖-硫酸銨營(yíng)養(yǎng)液。
更進(jìn)一步地，培養(yǎng)基包括以下重量份計(jì)的原料：7份玉米粉、15份豆粕粉、20份秸稈粉、20份草炭土、35份磷尾礦、3份碳酸鈣和43份蔗糖-硫酸銨營(yíng)養(yǎng)液。
更進(jìn)一步地，培養(yǎng)基包括以下重量份計(jì)的原料：5份玉米粉、8份豆粕粉、25份秸稈粉、25份草炭土、40份磷尾礦、2份碳酸鈣和48份蔗糖-硫酸銨營(yíng)養(yǎng)液。
一種上述弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：
(A)按照上述質(zhì)量比例，稱(chēng)取玉米粉、豆粕粉、磷尾礦、秸稈粉、草炭土、碳酸鈣，混合各原料得到混合物；
(B)在上述混合物中加入營(yíng)養(yǎng)液，機(jī)械攪拌混合均勻，自然pH，經(jīng)滅菌處理，得到固體培養(yǎng)基。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述滅菌處理?xiàng)l件為115-122℃下施加1.0-2.0kg/cm2壓力20～40分鐘。
一種弗氏鏈霉菌孢子的固體發(fā)酵方法，包括以下步驟：
1)孢子懸液制備：從冰箱菌種斜面挑取孢子接種茄瓶斜面，培養(yǎng)后加入無(wú)菌水洗脫制備孢子懸液；2)液體發(fā)酵：將孢子懸液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行液體發(fā)酵，至所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中菌絲體生長(zhǎng)進(jìn)入所述弗氏鏈霉菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，得到液體發(fā)酵種子液；3)固體發(fā)酵：將所述液體發(fā)酵種子液接種到以上述方法制備的弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基中，進(jìn)行固體發(fā)酵，得到固體發(fā)酵培養(yǎng)基。
進(jìn)一步地，所述孢子懸液的制備過(guò)程中，接種菌種為弗氏鏈霉菌，菌種保藏編號(hào)為CGMCC No.11963，于茄瓶斜面接種，28～32℃下恒溫靜置培養(yǎng)6～10天，用滅菌蒸餾水洗脫。
進(jìn)一步地，所述液體發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵條件為溫度28～32℃，震蕩頻率150～220r/分鐘，恒溫振蕩培養(yǎng)24～36小時(shí)。
更進(jìn)一步地，所述液體發(fā)酵的條件為溫度30～32℃，震蕩頻率180～200r/分鐘。
進(jìn)一步地，所述液體發(fā)酵過(guò)程中，以上一步驟制備的孢子懸液作為接種菌液，接種量為液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積的3-6％；所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的成分以重量比計(jì)算，包括2％的豆粕粉和0.5％的葡萄糖懸液，其余為水。
進(jìn)一步地，所述弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基的發(fā)酵條件為在28～35℃下培養(yǎng)3～6天。
更進(jìn)一步地，所述弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基的發(fā)酵條件為在30～34℃下培養(yǎng)4～5天。
進(jìn)一步地，所述弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基的發(fā)酵過(guò)程包括發(fā)酵初期和產(chǎn)孢期；發(fā)酵初期固體培養(yǎng)基的水分含量為40～60％，進(jìn)入產(chǎn)孢期后所述弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基的水分含量小于35％；液體發(fā)酵種子液的接種量為所述弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基質(zhì)量的10～15％。發(fā)酵初期水分含量根據(jù)弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基所含水分，液體發(fā)酵種子液以100％含水量計(jì)，補(bǔ)充液體發(fā)酵種子液至所需含水量；產(chǎn)孢期水分含量為將所得固體發(fā)酵培養(yǎng)基稱(chēng)重(W0)，徹底烘干后再次稱(chēng)重(Wt)，根據(jù)以下公式計(jì)算含水量：含水量＝(W0-Wt)/W0。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面還提供了一種農(nóng)用弗氏鏈霉菌菌劑的制備方法，即在固體發(fā)酵結(jié)束后，將固體發(fā)酵產(chǎn)物孢子粉直接與褐煤以及磷尾礦粉復(fù)配得到弗氏鏈霉菌農(nóng)用微生物菌劑粉劑產(chǎn)品。
進(jìn)一步地，所述農(nóng)用弗氏鏈霉菌菌劑的制備過(guò)程中，固體發(fā)酵產(chǎn)物與褐煤以及磷尾礦粉的復(fù)配比例為20～40：30～60：60～80，以重量份計(jì)比；孢子粉與褐煤以及磷尾礦粉混合均勻后得到的弗氏鏈霉菌菌劑，使菌劑的水分含量為8～15％；所述弗氏鏈霉菌菌劑的水分含量以濕度計(jì)測(cè)定，置于恒溫控制培養(yǎng)室調(diào)整菌劑水分含量。
現(xiàn)有技術(shù)中常用的鏈霉菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基組分存在以下問(wèn)題：鏈霉菌固體發(fā)酵基質(zhì)用到大量的玉米粉、麩皮，一般占總養(yǎng)分干重的40～80％。玉米粉、麩皮中含有豐富的纖維素、蛋白質(zhì)、淀粉、維生素等，養(yǎng)分含量豐富，但在促進(jìn)鏈霉菌生長(zhǎng)繁殖的同時(shí)，容易滋生大量細(xì)菌，且細(xì)菌比鏈霉菌生長(zhǎng)迅速，消耗掉大部分的養(yǎng)分，不利于鏈霉菌的孢子萌發(fā)和生長(zhǎng)，致使產(chǎn)孢數(shù)量少，且生產(chǎn)的菌劑雜菌率嚴(yán)重超標(biāo)。本發(fā)明選用少量玉米粉、豆粕粉以及秸稈粉代替玉米粉和麩皮作為固體培養(yǎng)基，一方面，秸稈粉為玉米秸稈收獲籽實(shí)后的剩余部分磨成的粉狀物，含有30％以上的碳水化合物、2％～4％的蛋白質(zhì)和0.5％～1％的脂肪，與玉米粉、豆粕粉合理搭配后，可以為弗氏鏈霉菌提供充足的碳源、氮源，有利于其生長(zhǎng)、產(chǎn)孢；另一方面，因玉米秸稈粉具有較強(qiáng)的吸水性、蓬松性，還具有減緩培養(yǎng)基質(zhì)水分流失和提高固體培養(yǎng)基質(zhì)透氣性的效果。
常用固體培養(yǎng)基組成中的細(xì)沙、細(xì)土雖然廉價(jià)、易得，但是需要嚴(yán)格控制沙、土的顆粒細(xì)度、以及理化指標(biāo)，原料的前處理工序較多，且沙、土的養(yǎng)分含量較低，作為農(nóng)用微生物菌劑施到土壤中不能補(bǔ)充養(yǎng)分。本發(fā)明選擇草炭土、磷尾礦粉作為土壤的替代原料，既能作為固體培養(yǎng)所需的支持體，還能為弗氏鏈霉菌提供豐富的氮源、碳源，促進(jìn)微生物的代謝和產(chǎn)孢。而弗氏鏈霉菌代謝產(chǎn)生的泰樂(lè)霉素、新霉素能有效抑制土壤中的病原菌，緩解作物病蟲(chóng)害；合成的有機(jī)酸及酶類(lèi)可以分解釋放磷尾礦粉中的磷、鈣、鎂等礦物養(yǎng)分。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中不需要提供無(wú)機(jī)鹽，磷尾礦分解產(chǎn)生的無(wú)機(jī)養(yǎng)分不僅刺激弗氏鏈霉菌快速產(chǎn)孢，縮短發(fā)酵周期，還增加了菌劑的速效養(yǎng)分含量。
本發(fā)明使用的主要固相載體含有磷尾礦粉，其主要物相為CaMg(CO3)2及Ca5F(PO4)3，P2O5含量在8％左右，MgO含量可高達(dá)19.0％。通過(guò)協(xié)調(diào)玉米粉、豆粕粉、秸稈粉、草炭土和磷尾礦粉的加入量，使得磷尾礦粉顆粒附近均能存在其余各原料，可以作為附著于磷尾礦粉顆粒上的菌體的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，起到促進(jìn)菌體生長(zhǎng)的作用。磷尾礦粉與秸稈粉之間的接觸面、孔隙增大也能起到促進(jìn)菌體生長(zhǎng)的作用。因磷尾礦粉的特殊來(lái)源與成分結(jié)構(gòu)，此原料基本不含雜菌，從而降低了滅菌過(guò)程中的能量消耗，從而降低成本，提高了原料利用率。
本發(fā)明提供的固體培養(yǎng)基還包括營(yíng)養(yǎng)液，該營(yíng)養(yǎng)液含有碳源、氮源，無(wú)需添加無(wú)機(jī)鹽成分，簡(jiǎn)單易配。營(yíng)養(yǎng)液的加入量可根據(jù)常規(guī)加入量選取。優(yōu)選采用45份的蔗糖-硫酸銨營(yíng)養(yǎng)液，采用此配方營(yíng)養(yǎng)液能有效提高菌體的生長(zhǎng)能力。按此量加入營(yíng)養(yǎng)液能避免加入過(guò)多的營(yíng)養(yǎng)液導(dǎo)致菌體附著的磷尾礦粉、秸稈粉之間的距離過(guò)大，影響菌體的增殖、產(chǎn)孢。也能避免加入營(yíng)養(yǎng)液過(guò)少，導(dǎo)致菌絲體因干燥導(dǎo)致的代謝途徑阻遏，次生代謝物產(chǎn)生受到抑制，從而影響磷尾礦中無(wú)機(jī)元素的釋放，影響菌體的生長(zhǎng)。
本發(fā)明提供的固體培養(yǎng)基不需要進(jìn)行調(diào)節(jié)pH，通過(guò)添加輕質(zhì)碳酸鈣粉進(jìn)行緩沖、調(diào)控，使整個(gè)發(fā)酵過(guò)程維持在相對(duì)平衡的酸堿度，既維持了有利于弗氏鏈霉菌菌絲體的生長(zhǎng)、抑制雜菌生長(zhǎng)繁殖的環(huán)境，降低了雜菌率，又避免引入對(duì)菌體生長(zhǎng)存在刺激或毒害作用的酸堿物質(zhì)及離子。優(yōu)選的碳酸鈣的加入可緩沖整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的pH，對(duì)菌體無(wú)毒害作用，且有助于孢子產(chǎn)生，其中的鈣還能起到促進(jìn)弗氏鏈霉菌產(chǎn)孢的作用。
本發(fā)明所采用的固體培養(yǎng)基的滅菌處理?xiàng)l件為：在115-122℃下施加1.0-2.0kg/cm2的壓力20～40分鐘。按此條件進(jìn)行滅菌，較常規(guī)固體發(fā)酵滅菌時(shí)間短、溫度低，滅菌效率高，節(jié)約蒸汽用量，且能充分殺滅固體培養(yǎng)基內(nèi)的雜菌。
根據(jù)本發(fā)明提供的優(yōu)選配比制備的固體培養(yǎng)基，具有最優(yōu)的孢子量、菌體數(shù)量和最低的雜菌含量。
本發(fā)明提供的弗氏鏈霉菌孢子的固體發(fā)酵過(guò)程中，孢子懸液的制備為先將斜面孢子接種到茄瓶斜面培養(yǎng)后，加入無(wú)菌水洗脫、混勻，后接種于含有豆粕粉、葡萄糖的液體發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵罐培養(yǎng)擴(kuò)大種子液量。其中，孢子懸液的接種量為液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積的3～6％。采用該比例接種在節(jié)約菌液的同時(shí)，提高液體發(fā)酵的效率。
本發(fā)明所述的固體培養(yǎng)基的發(fā)酵采用液-固雙相發(fā)酵方法，先進(jìn)行液體發(fā)酵，使得孢子懸液中的弗氏鏈霉菌孢子充分萌發(fā)。該液體發(fā)酵采用適宜于弗氏鏈霉菌生長(zhǎng)的條件，孢子快速萌發(fā)，大大縮短了鏈霉菌的液體發(fā)酵周期，同時(shí)液降低了染菌幾率。隨著液體發(fā)酵的進(jìn)行，弗氏鏈霉菌快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且持續(xù)保持高速增殖。將該液體發(fā)酵液接種至上述固體培養(yǎng)基后，由于固體培養(yǎng)基的pH、碳氮比環(huán)境波動(dòng)不大，接種后的弗氏鏈霉菌菌絲體得以快速生長(zhǎng)、產(chǎn)孢，極大地減少了染菌幾率，降低了菌劑產(chǎn)品的雜菌數(shù)量。
其中，所述液體發(fā)酵條件優(yōu)選：溫度為28～32℃，振蕩頻率150～220r/分鐘，恒溫培養(yǎng)24～36小時(shí)。采用該培養(yǎng)條件有利于弗氏鏈霉菌的生長(zhǎng)，縮短了發(fā)酵周期，降低染菌幾率。
其中，所述固體發(fā)酵條件優(yōu)選：在30～34℃下培養(yǎng)4～5天。按此條件發(fā)酵，能避免發(fā)酵周期過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致的雜菌污染、繁殖從而增加菌劑中雜菌率。所述液體發(fā)酵液的接種量為固體培養(yǎng)基質(zhì)的10～15％。采用該比例接種，能保證進(jìn)入固體培養(yǎng)基中的菌體數(shù)量適宜，避免接種過(guò)量，導(dǎo)致后續(xù)固體發(fā)酵培養(yǎng)基水分過(guò)高產(chǎn)孢困難。
雖然此固體培養(yǎng)基組分不適宜細(xì)菌的繁殖，但作為農(nóng)用微生物菌劑仍需對(duì)雜菌率有較嚴(yán)格的控制。對(duì)于雜菌的控制，還可以通過(guò)對(duì)固體培養(yǎng)過(guò)程中水分含量、接種量的控制實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的弗氏鏈霉菌孢子的固體發(fā)酵過(guò)程包括發(fā)酵初期和產(chǎn)孢期，發(fā)酵初期固體培養(yǎng)基的水分含量為40～60％，進(jìn)入產(chǎn)孢期后固體培養(yǎng)基的水分含量小于35％。按此含水量調(diào)整固體培養(yǎng)基中的含水量，結(jié)合固體發(fā)酵的溫度，使得發(fā)酵過(guò)程中的溫濕度利于弗氏鏈霉菌的生長(zhǎng)，而不利于各類(lèi)雜菌的生長(zhǎng)。
本發(fā)明提供的農(nóng)用微生物菌劑的制備過(guò)程中，固體發(fā)酵結(jié)束后，無(wú)需進(jìn)行烘干處理；按照該方法所制備的鏈霉菌農(nóng)用微生物菌劑水分含量在8～15％，活菌數(shù)10～20億/g，雜菌率＜5％，符合農(nóng)用微生物菌劑GB2087-2006的指標(biāo)要求。
采用本發(fā)明提供的方法，生產(chǎn)一批農(nóng)用微生物菌劑的周期為8-10天，液體發(fā)酵為1-2天，固體發(fā)酵約4-5天，摻混一天，菌劑活菌數(shù)檢測(cè)3-5天。采用本發(fā)明提供的方法生產(chǎn)時(shí)間得到有效縮短，生產(chǎn)效率得到提高。
本發(fā)明的有益效果在于：
1、本發(fā)明提供的固體培養(yǎng)基加入豆粕粉玉米粉和秸稈粉，并協(xié)調(diào)草炭土和磷尾礦的混合量，使其在保證供給微生物充足有機(jī)質(zhì)的同時(shí)，磷尾礦中的礦物元素通過(guò)菌種的發(fā)酵作用活化出來(lái)，提高磷尾礦中的有效養(yǎng)分含量，從而促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)。通過(guò)加入碳酸鈣和秸稈粉，分別可以調(diào)控培養(yǎng)基的酸堿環(huán)境、增加發(fā)酵過(guò)程的穩(wěn)定性，以及提高固體培養(yǎng)基質(zhì)的疏松度和透氣性，從而抑制雜菌生長(zhǎng)，為弗氏鏈霉菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢營(yíng)造最佳環(huán)境，促進(jìn)菌絲體快速繁殖及提高孢子產(chǎn)生量。本發(fā)明提供的弗氏鏈霉菌產(chǎn)孢的發(fā)酵培養(yǎng)基適于弗氏鏈霉菌的生長(zhǎng)，每克發(fā)酵原料可產(chǎn)生7.5*109以上個(gè)孢子；制備的孢子粉萌發(fā)率可達(dá)95％。
2、本發(fā)明采用液體-固體聯(lián)合發(fā)酵培養(yǎng)工藝制備弗氏鏈霉菌菌劑，與傳統(tǒng)的固體發(fā)酵方式相比，菌種增殖的產(chǎn)孢量更高，發(fā)酵周期更短。該方法所提供的液體發(fā)酵液碳氮比搭配合理，促進(jìn)孢子懸液接入液體培養(yǎng)基后快速萌發(fā)，24-48小時(shí)內(nèi)即可產(chǎn)生大量菌絲體，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，不僅極大地縮短了發(fā)酵周期，還減少了染菌幾率。
3、本發(fā)明采用磷尾礦粉與弗氏鏈霉菌復(fù)配制備農(nóng)用微生物菌劑，利用微生物的作用活化磷尾礦粉中的礦質(zhì)元素，提高菌劑的養(yǎng)分有效性，既增加了農(nóng)用微生物菌劑的肥效，也實(shí)現(xiàn)了對(duì)磷資源的綜合利用。
4、將微生物制成微生物肥料是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上利用微生物的主要途徑之一。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，多以褐煤等含有微生物有機(jī)碳、氮營(yíng)養(yǎng)源的物質(zhì)作為固相載體，與菌劑復(fù)配生產(chǎn)農(nóng)用微生物菌劑，作為微生物肥料。除褐煤外，本發(fā)明還將弗氏鏈霉菌的孢子粉與以磷尾礦粉為主要成分的菌劑固相載體復(fù)配，制備農(nóng)用微生物菌劑。
磷尾礦粉來(lái)自工業(yè)選礦后的廢礦粉，我國(guó)80％的磷礦為中低品位磷礦，難以滿(mǎn)足濕法磷酸對(duì)原料礦石質(zhì)量的高要求，每年因此產(chǎn)生的磷尾礦達(dá)到700萬(wàn)噸以上。而磷尾礦因無(wú)經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值，被大量廢棄，不僅占用大面積的土地資源，消耗高昂的堆場(chǎng)建設(shè)和維護(hù)費(fèi)用，還產(chǎn)生巨大的環(huán)境淋溶風(fēng)險(xiǎn)。近幾年雖然有一些磷尾礦綜合利用的技術(shù)出現(xiàn)，但未從根本上解決磷礦選礦尾礦的利用問(wèn)題。因此面對(duì)當(dāng)今磷資源日漸匱乏的現(xiàn)狀，此發(fā)明對(duì)實(shí)現(xiàn)磷尾礦作為二次資源的綜合利用具有重大意義。
附圖說(shuō)明
圖1是本發(fā)明制備的農(nóng)用弗氏鏈霉菌微生物菌劑圖。
具體實(shí)施方式
下面通過(guò)實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但不限于此。
為使本發(fā)明更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但是本發(fā)明可以由權(quán)利要求限定和覆蓋的多種不同方式實(shí)施。
以下實(shí)施例和對(duì)比例中所用原料和設(shè)備均為市售，其中各類(lèi)培養(yǎng)基均按常規(guī)方法配置。以下過(guò)程中接種均在無(wú)菌操作臺(tái)上完成；液體發(fā)酵在數(shù)顯恒溫震蕩培養(yǎng)箱上完成；滅菌處理在立式高壓滅菌鍋上完成；固體發(fā)酵在2m3的曲池內(nèi)完成；菌劑復(fù)配過(guò)程采用不銹鋼粉劑攪拌機(jī)完成。接種菌種為弗氏鏈霉菌，菌種保藏編號(hào)為CGMCC No.11963。
農(nóng)用微生物菌劑活菌數(shù)、雜菌率檢測(cè)方法：培養(yǎng)基為改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基，1000ml培養(yǎng)基含可溶性淀粉20g、KNO3 1g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO4·7H2O0.01g，瓊脂20g，pH值7.2-7.5，120℃高壓滅菌30分鐘冷卻至50-55℃，每300ml培養(yǎng)基中加入3％重鉻酸鉀1ml，混勻，傾入無(wú)菌平皿。將制備好的農(nóng)用微生物菌劑按照GB2087-2006方法進(jìn)行梯度稀釋后，取10-7稀釋度涂布平板，培養(yǎng)3-5天后計(jì)數(shù)。
實(shí)施例1：
弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基的制備方法：
(A)以重量計(jì)，稱(chēng)取10份玉米粉、10份豆粕粉、18份秸稈粉、30份草炭土、30份磷尾礦和2份碳酸鈣，其中秸稈粉的粒徑為-40目，草炭土的粒徑為-40目。將各物質(zhì)混合均勻；
(B)加入45份蔗糖-硫酸銨營(yíng)養(yǎng)液，用不銹鋼攪拌系統(tǒng)充分混合均勻，并在115℃加1.2kg/cm2壓力滅菌40分鐘，得到固體培養(yǎng)基。所述蔗糖-硫酸銨營(yíng)養(yǎng)液的組成以重量份計(jì)包括：1份蔗糖、1份硫酸銨、0.6份磷酸二氫鉀和92份水。
弗氏鏈霉菌孢子的發(fā)酵方法：
1)菌種斜面孢子轉(zhuǎn)接至茄瓶斜面，30℃條件下培養(yǎng)6天，斜面加入適量無(wú)菌水，孢子在無(wú)菌水內(nèi)均勻分散，沒(méi)有團(tuán)聚，制成孢子懸液；
2)液體發(fā)酵：將孢子懸液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的成分以重量比計(jì)算，包括2％的豆粕粉和0.5％的葡萄糖懸液，其余為水。接種量為液體發(fā)酵培養(yǎng)基體積的6％，在溫度30℃，振蕩頻率180r/分鐘的條件下，裝恒溫振蕩搖床培養(yǎng)24小時(shí)進(jìn)行液體發(fā)酵。至液體發(fā)酵中菌體生長(zhǎng)進(jìn)入弗氏鏈霉菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即聞到菌液有一股特殊抗生素味道時(shí)，得到液體發(fā)酵種子液；
3)固體發(fā)酵：將液體發(fā)酵種子液接種所得固體培養(yǎng)基中，液體發(fā)酵種子液的接種量為弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基質(zhì)量的10％，在30℃下培養(yǎng)4天。在此過(guò)程中通過(guò)無(wú)菌取樣觀察培養(yǎng)基質(zhì)表面是否出現(xiàn)白色孢子，在出現(xiàn)孢子之前，控制固體培養(yǎng)基的水分含量為45～55％，待弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基表面出現(xiàn)孢子后，將固體培養(yǎng)基的水分含量降低至35％以下。固體發(fā)酵結(jié)束后，得到固體發(fā)酵培養(yǎng)基。
農(nóng)用弗氏鏈霉菌微生物菌劑的制備：
固體發(fā)酵結(jié)束后，按照孢子粉(w)：褐煤：(w)磷尾礦粉(w)為1:2:4的比例稱(chēng)量好各組分，使用不銹鋼攪拌系統(tǒng)充分混合均勻，得到弗氏鏈霉菌農(nóng)用微生物菌劑粉劑產(chǎn)品。
實(shí)施例2：
弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基的制備方法：
(A)以重量計(jì)，稱(chēng)取7份玉米粉、15份豆粕粉、20份秸稈粉、20份草炭土、35份磷尾礦和3份碳酸鈣，其中草炭土的粒徑為-40目，玉米秸稈粉的粒徑為-30目。將各物質(zhì)混合均勻；
(B)加入43份蔗糖-硫酸銨營(yíng)養(yǎng)液，用不銹鋼攪拌系統(tǒng)進(jìn)行充分混合均勻，并在122℃加1.5kg/cm2壓力20分鐘，得到固體培養(yǎng)基。所述蔗糖-硫酸銨營(yíng)養(yǎng)液的組成以重量份計(jì)包括：5份蔗糖、3份硫酸銨、1份磷酸二氫鉀和85份水。
弗氏鏈霉菌孢子的發(fā)酵方法：
同實(shí)施例1，不同之處在于，孢子懸液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基后，在溫度28℃，振蕩頻率220r/分條件下，裝恒溫振蕩搖床培養(yǎng)36小時(shí)；所述液體發(fā)酵種子液的接種量為弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基質(zhì)量的15％；所述液體發(fā)酵種子液接種到弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基后，在30℃下培養(yǎng)6天。
弗氏鏈霉菌農(nóng)用微生物菌劑的制備：
固體發(fā)酵結(jié)束后，按照孢子粉(w)：褐煤(w)：磷尾礦粉(w)為1:1.5:3的比例稱(chēng)量好各組分，使用不銹鋼攪拌系統(tǒng)充分混合均勻，得到弗氏鏈霉菌農(nóng)用微生物菌劑粉劑產(chǎn)品。
實(shí)施例3：
弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基的制備方法：
(A)以重量計(jì)，稱(chēng)取5份玉米粉、8份豆粕粉、25份秸稈粉、25份草炭土、40份磷尾礦和2份碳酸鈣；其中草炭土的粒徑為-40目，玉米秸稈粉的粒徑為-50目。將各物質(zhì)混合均勻；
(B)加入48份蔗糖-硫酸銨營(yíng)養(yǎng)液，用不銹鋼攪拌系統(tǒng)進(jìn)行充分混合均勻，并在120℃加1.3kg/cm2壓力30分鐘，得到固體培養(yǎng)基。所述蔗糖-硫酸銨營(yíng)養(yǎng)液的組成以重量份計(jì)包括：7份蔗糖、2份硫酸銨、0.8份磷酸二氫鉀和89份水。
弗氏鏈霉菌孢子的發(fā)酵方法：
同實(shí)施例1，不同之處在于，孢子懸液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基后，在溫度30℃，振蕩頻率200r/分條件下，裝恒溫振蕩搖床培養(yǎng)30小時(shí)；液體發(fā)酵種子液的接種量為弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基質(zhì)量的12％；所述發(fā)酵好的液體培養(yǎng)基接種到弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基后，在30℃下培養(yǎng)5天。
弗氏鏈霉菌農(nóng)用微生物菌劑的制備：
固體發(fā)酵結(jié)束后，按照孢子粉(w)：褐煤(w)：磷尾礦粉(w)為1:1:2的比例稱(chēng)量好各組分，使用不銹鋼攪拌系統(tǒng)充分混合均勻，得到弗氏鏈霉菌農(nóng)用微生物菌劑粉劑產(chǎn)品。
實(shí)施例4：
弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基的制備方法同實(shí)施例1；
弗氏鏈霉菌孢子的發(fā)酵方法：同實(shí)施例1，不同之處在于，孢子懸液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基后，在溫度32℃，振蕩頻率150r/分鐘條件下，裝恒溫振蕩搖床培養(yǎng)34小時(shí)。
弗氏鏈霉菌農(nóng)用微生物菌劑的制備：同實(shí)施例1。
實(shí)施例5：
弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基的制備方法同實(shí)施例1；
弗氏鏈霉菌孢子的發(fā)酵方法：同實(shí)施例1，不同之處在于，固體發(fā)酵時(shí)，將液體發(fā)酵種子液接種到所得弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基后，弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基的發(fā)酵條件為在28℃下培養(yǎng)5天。
實(shí)施例6：
弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基的制備方法同實(shí)施例1；
弗氏鏈霉菌孢子的發(fā)酵方法：同實(shí)施例1，不同之處在于，固體發(fā)酵時(shí)，將液體發(fā)酵種子液接種到所得弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基后，弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基的發(fā)酵條件為在28℃下培養(yǎng)6天。
實(shí)施例7：
弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基的制備方法同實(shí)施例1；
弗氏鏈霉菌孢子的發(fā)酵方法：同實(shí)施例1，不同之處在于，固體發(fā)酵時(shí)，將液體發(fā)酵種子液接種到所得弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基后，弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基的發(fā)酵條件為在35℃下培養(yǎng)3天。
實(shí)施例8：
弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基的制備方法同實(shí)施例1；
弗氏鏈霉菌孢子的發(fā)酵方法：同實(shí)施例1，不同之處在于，制備孢子懸液時(shí)，于茄瓶斜面接種，28℃下恒溫靜置培養(yǎng)10天。
實(shí)施例9：
弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基的制備方法同實(shí)施例1；
弗氏鏈霉菌孢子的發(fā)酵方法：同實(shí)施例1，不同之處在于，制備孢子懸液時(shí)，于茄瓶斜面接種，32℃下恒溫靜置培養(yǎng)6天。
對(duì)比例1
與實(shí)施例1-7的區(qū)別在于，弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基組分用麩皮100份、微量元素營(yíng)養(yǎng)液15份、磷酸氫二鉀0.3份、氯化鈉0.25份、硝酸鉀0.1份、碳酸鈣0.8份，自然pH值。液體種子用高氏培養(yǎng)基，液體菌種齡84h，接種量10％，發(fā)酵溫度30℃，料水比10：6。
固體發(fā)酵結(jié)束后以空氣作為干燥介質(zhì)在50℃下干燥固體培養(yǎng)基，得到孢子粉。
對(duì)比例2
與實(shí)施例1-7的區(qū)別在于，弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基組分用40重量份的玉米粉、10重量份的米糠、50重量份的沙土，其中沙土為由重量比為4:1的細(xì)土和沙子組成。細(xì)土的粒徑為-80目，沙子的粒徑為-60目?；旌暇鶆蚋魑镔|(zhì)；加入30重量份的高氏一號(hào)培養(yǎng)液，用稀硫酸或石灰水調(diào)節(jié)pH值至7，并在130℃下施加2.5kg/cm2壓力70分鐘，得到固體培養(yǎng)基。
固體發(fā)酵結(jié)束后以空氣作為干燥介質(zhì)在50℃下干燥固體培養(yǎng)基，得到孢子粉。
實(shí)驗(yàn)例
表1實(shí)施例1-7和對(duì)比例1-2菌粉中產(chǎn)孢量、雜菌含量、固體發(fā)酵周期表
由表1可見(jiàn)，實(shí)施例1-7的產(chǎn)孢量比對(duì)照提高27～89％。對(duì)比例1-2中雜菌率是實(shí)施例1-7的1.4～7倍，本發(fā)明大大降低了雜菌含量，提高菌劑質(zhì)量和使用效果。
采用本發(fā)明提供的弗氏鏈霉菌固體培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法能有效抑制培養(yǎng)過(guò)程中雜菌的生長(zhǎng)，同時(shí)還能提高孢子粉中的孢子數(shù)量，而且縮短了發(fā)酵周期，提高了生產(chǎn)效率。此外還充分利用了磷尾礦資源，通過(guò)微生物作用，制備一種新型的富含磷及多種礦物元素的農(nóng)用微生物菌劑，符合國(guó)家大力發(fā)展循環(huán)經(jīng)濟(jì)的需要，實(shí)現(xiàn)二者的綜合利用，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供有利條件。