本發(fā)明涉及高效生產(chǎn)DC₁₆的細菌，同時涉及其制備DC₁₆的方法，具體涉及利用培養(yǎng)法從石油污染土壤中，對能代謝正十六烷烴生成DC₁₆的細菌進行富集、篩選、分離和鑒定，并對其代謝生產(chǎn)的DC₁₆進行分離、純化和測定。

背景技術(shù)：

DC₁₆是一種重要合成原料，可以用來合成麝香酮，代替天然麝香，用于配制多種中成藥。DC₁₆在自然界中不存在，并且化工方法也很難合成，因此，生物代謝法成為生產(chǎn)DC₁₆最有效的方法。到目前為止，生物法生產(chǎn)DC₁₆均是利用熱帶假絲酵母菌(Candida cloacae)來完成，還沒有發(fā)現(xiàn)利用細菌生產(chǎn)DC₁₆的報道。用熱帶假絲酵母菌(Candida cloacae)發(fā)酵法制備DC₁₆的報道最早出現(xiàn)在70年代， 如日本內(nèi)尾等人用陰溝假絲酵母(Candida cloacae)MR-12 生產(chǎn)DC₁₆。后來，陳元童利用熱帶假絲酵母(Candida cloacae)突變株UH-3-9生產(chǎn)DC₁₆，通過向反應(yīng)體系中添加丙烯酸，來抑制二羧酸的β-氧化，降低了熱帶假絲酵母(Candida cloacae)對已生成DC₁₆的分解，提高了DC₁₆的產(chǎn)率，發(fā)酵3天時DC₁₆的產(chǎn)量達到了54 g/L，均高于高忠祥（1990）和植村（1987）報道的40 g/L左右的產(chǎn)量。曹務(wù)波（2011）等公開了利用熱帶假絲酵母(Candida cloacae)突變株ly-6發(fā)酵正十六烷生產(chǎn)DC₁₆的發(fā)明專利，在補加正十六烷發(fā)酵165小時后, DC₁₆的產(chǎn)率為170.5 g/L，轉(zhuǎn)化率為88.1%。熱帶假絲酵母菌(Candida cloacae) ，即熱帶念珠菌，屬隱球酵母目、隱球酵母科，是一種真菌,可引起急性、亞急性或慢性感染，是最常見的真菌病,并可導(dǎo)致皮膚、粘膜、內(nèi)臟受到損害等。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)DC₁₆的細菌，并提供了其具體的制備方法。本發(fā)明不但分離到一株能高效代謝生產(chǎn)DC₁₆的新種菌，豐富了微生物資源庫，而且DC₁₆的發(fā)酵產(chǎn)率高于之前的研究，同時避免了使用熱帶假絲酵母菌發(fā)酵的危害。

本發(fā)明所提供的細菌編號為STKD-1，屬于不動桿菌 Acinetobacter sp.屬，其菌株保藏號為CGMCCNo.11839，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路一號院3號，保藏日期為2015年12月9日。

具體的本發(fā)明提供的細菌在制備十六碳二元酸中的制備步驟如下：

（1）制備培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基II：

正十六烷 1.5g/L，蛋白胨4.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.15g/L ，KH₂PO₄ 0.8g/L，NaCl 0.1g/L，去離子水1000mL，調(diào)pH 為7.2，分裝到500 mL三角瓶中，121℃ 20min 滅菌待用；

液體篩選培養(yǎng)基：

K₂HPO₄ 1.5g/L，MgSO₄ ·7H₂O 0.5g/L, NH₄NO₃ 1.5g/L, FeCl₃ 0.025g/L, 無水CaCl₂0.01g/L，正十六烷1.5 g/L，用2M的NaOH 調(diào)節(jié)pH 至 7.0，121 ℃ 20 min滅菌，待用；

（2）發(fā)酵

正十六烷發(fā)酵細菌的預(yù)培養(yǎng)過程：將菌株接種到液體篩選培養(yǎng)基中，28 ℃，150 rpm/min條件振蕩培養(yǎng)3 d，得到預(yù)培養(yǎng)液；

發(fā)酵過程：取預(yù)培養(yǎng)液20mL接種到3L發(fā)酵培養(yǎng)基II中，28 ℃，150 rpm/min振蕩培養(yǎng)，每隔24 h用6 mol/L NaOH溶液調(diào)整發(fā)酵液pH至7.2，培養(yǎng)時間為20 d，發(fā)酵結(jié)束后取發(fā)酵液進行十六碳二元酸的提取及測定；

（3）十六碳二元酸的提取

將發(fā)酵液加熱到85 ℃，邊攪拌邊用NaOH調(diào)整pH為11.0，趁熱進行膜抽濾，所用濾膜為硝酸纖維素膜，孔徑為0.22μm，收集抽濾液；將抽濾液在4 ℃條件下靜置12 h，取抽濾液上部液體加入稀硫酸，調(diào)整pH為2.0，4 ℃條件下靜置12 h，收集底部沉淀；取抽濾液下部沉淀加入去離子水溶解，用稀硫酸調(diào)整溶液pH至2.0，4 ℃條件下靜置12 h，收集底部沉淀；合并兩部分沉淀，低溫真空干燥，即得總十六碳二元酸；

（4）氣質(zhì)聯(lián)用方法測定十六碳二元酸含量。

本發(fā)明提供了一種能代謝產(chǎn)生DC₁₆的新細菌，避免了現(xiàn)有技術(shù)中使用熱帶念珠菌生產(chǎn)DC₁₆菌株的危害，同時，本發(fā)明提供的新細菌發(fā)酵生產(chǎn)DC₁₆的產(chǎn)率大于現(xiàn)有技術(shù)中其他生物法的產(chǎn)率。

附圖說明

圖1為氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）測定D₁₆結(jié)果；

圖2為高效發(fā)酵生產(chǎn)DC₁₆菌株STDK-1的系統(tǒng)發(fā)育樹。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。

實施例1

1、細菌的富集

取青島黃島區(qū)中石化加油站附近的被石油污染的土壤10 g放入到燒杯中，再向其中加入90 mL的去離子水浸泡并攪拌，靜置30 min，取浸出液5 mL加入到100mL液體富集培養(yǎng)基中，28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)（150 rpm/min）5 d，得到富集培養(yǎng)液；富集培養(yǎng)基組成（/L）：牛肉膏3.0g， 蛋白胨10.0g， NaCl 5.0g，用NaOH調(diào)pH為7.6，121 ℃ 20 min滅菌待用；

2、正十六烷發(fā)酵細菌的篩選與純化

篩選培養(yǎng)基組成（/L）：K₂HPO₄ 1.5g，MgSO₄ ·7H₂O 0.5g, NH₄NO₃ 1.5g， FeCl₃0.025g, 無水CaCl₂ 0.01g，正十六烷1.5g，瓊脂20g，用2M的NaOH 調(diào)節(jié)pH 至 7.0，121 ℃ 20 min滅菌，趁熱倒平板，冷卻后即得固體平板培養(yǎng)基，半固體篩選培養(yǎng)基加入瓊脂4g/L,其他成分及含量不變，液體篩選培養(yǎng)基不加瓊脂；分離過程：取上述富集培養(yǎng)液20 μL滴加到固體平板培養(yǎng)基上，然后涂抹均勻，28 ℃條件下靜置培養(yǎng)3 d，挑取生長快的5個單菌落再分別進行劃線平板培養(yǎng)，所用平板培養(yǎng)基以及培養(yǎng)條件均同前，共得到5組平板。分別觀察5組平板菌落特征，如菌落特征不一致，則繼續(xù)重復(fù)劃線培養(yǎng)，直至菌落特征一致，此時平板菌落為單一菌（純菌）。通過上述多次劃線培養(yǎng)，共分離出5株純菌，記作STKD-1，STKD-2，STKD-3，STKD-4和STKD-5，分別將這5株純菌4 ℃條件下保存在半固體篩選培養(yǎng)基中，待用；

3、細菌的發(fā)酵產(chǎn)生DC₁₆所用培養(yǎng)基組成

（1）發(fā)酵培養(yǎng)基I組成（/L）：正十六烷2g，NaCl 0.5g, (NH₄)₂SO₄ 0.15g， MgSO₄·7H₂O 0.03g，NaNO₃ 0.1 g，NaH₂PO₄ 0.5g，F(xiàn)eCl₃ 0.04 g，去離子水配制，用NaOH調(diào)pH為7.2，分裝到500 mL三角瓶中，121℃ 20min 滅菌待用；

（2）發(fā)酵培養(yǎng)基II組成（/L）：正十六烷 1.5g，蛋白胨4.0g，(NH₄)₂SO₄ 0.15g ，KH₂PO₄0.8g，NaCl 0.1g，去離子水1000mL，調(diào)pH 為7.2，分裝到500 mL三角瓶中，121℃ 20min 滅菌待用；

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基III組成（/L）：正十六烷 2.5 g， KH₂PO₄ 1.5g， K₂HPO₄ 2.0g，NH₄ NO₃0.5g，NaCl 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.01g，無水CaCl₂ 0.01g，F(xiàn)eSO₄ 0.002g，去離子水1000mL，調(diào)pH 為7.2，分裝到500 mL三角瓶中，121℃ 20min 滅菌待用；

4、具體發(fā)酵過程：

（1）正十六烷發(fā)酵細菌的預(yù)培養(yǎng)過程：將菌株STKD-1，STKD-2，STKD-3，STKD-4和STKD-5分別接種到液體篩選培養(yǎng)基中，28 ℃條件振蕩（150 rpm/min）培養(yǎng)3 d，得到預(yù)培養(yǎng)液；

（2）發(fā)酵過程：分別取STKD-1，STKD-2，STKD-3，STKD-4和STKD-5的預(yù)培養(yǎng)液20mL分別接種到3L發(fā)酵培養(yǎng)基I、發(fā)酵培養(yǎng)基II和發(fā)酵培養(yǎng)基III中，28 ℃振蕩（150 rpm/min）培養(yǎng)，每隔24 h用6 mol/L NaOH溶液調(diào)整發(fā)酵液pH至7.2，培養(yǎng)時間為20 d，發(fā)酵結(jié)束后取發(fā)酵液進行DC₁₆的提取及測定；

5、DC₁₆的提取過程

將上述發(fā)酵液加熱到85 ℃，邊攪拌邊用NaOH調(diào)整pH為11.0，趁熱進行膜抽濾，所用濾膜為硝酸纖維素膜，孔徑為0.22μm，收集抽濾液，此時濾液中為可溶性十六碳二元酸鈉（溫度為85 ℃條件下，十六碳二元酸鈉為溶解態(tài)）。然后將抽濾液在4 ℃條件下靜置12 h，十六碳二元酸鈉低溫下溶解度降低而沉淀在底部，分別對上部液體以及底部沉淀進一步處理，上部液體暫記作液（I），底部沉淀暫記作沉淀（I）；

注：液（I）中殘留有少量十六碳二元酸鈉；沉淀（I）為十六碳二元酸鈉液（I）處理過程：向液（I）中加入稀硫酸，調(diào)整pH為2.0，此時殘余在液（I）中的十六碳二元酸鈉在酸性條件下形成DC₁₆，4 ℃條件下靜置12 h，DC₁₆低溫條件下溶解度降低，以晶體形式沉淀到容器底部，收集沉淀，記作沉淀（II）；

沉淀（I）處理過程：向沉淀（I）中加入去離子水溶解，然后用稀硫酸調(diào)整溶液的pH至2.0，4 ℃條件下靜置12 h，DC₁₆低溫條件下結(jié)晶在瓶底，記作沉淀（III）；

合并沉淀（II）和沉淀（III），低溫真空干燥，即得到總DC₁₆，因為本發(fā)明中利用分離純化到的5種菌株（STKD-1，STKD-2，STKD-3，STKD-4和STKD-5）分別對三種發(fā)酵培養(yǎng)基（I，II和III）進行正十六烷烴的發(fā)酵生產(chǎn)DC₁₆，所以共得到15組總DC₁₆；

6、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）方法測定DC₁₆

（1）氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）測定DC₁₆的運行參數(shù)

GC-MS參數(shù)設(shè)定：柱箱內(nèi)平衡時間為0.25 min，設(shè)定最高溫度為325 ℃，柱溫升溫程序為0 min達150℃，然后6 ℃/min升溫到300 ℃，總運行時間為35 min；進樣量為1 μL，樣品清洗抽吸速度為300μL/min；

（2）氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）測定DC₁₆的結(jié)果

5菌株（STKD-1，STKD-2，STKD-3，STKD-4和STKD-5）以上述三種發(fā)酵培養(yǎng)基（I、II和III）分別進行發(fā)酵產(chǎn)生DC₁₆，將發(fā)酵液通過結(jié)晶、低溫干燥處理得到15組發(fā)酵晶體，用甲醇溶解15組晶體，溶解液用作進樣，利用GC-MS 測定結(jié)晶體的物質(zhì)組成,運行參數(shù)見6(1)。測定結(jié)果表明，15組結(jié)晶體出峰時間一致，利用數(shù)據(jù)庫比對，判定15組結(jié)晶體在7.5min處出現(xiàn)的峰為DC₁₆，如圖1；

7、DC₁₆產(chǎn)率的計算及最佳運行條件的確定

DC₁₆的發(fā)酵產(chǎn)率根據(jù)重量來計算。對STKD-1，STKD-2，STKD-3，STKD-4和STKD-5 5菌株分別在3L的液體培養(yǎng)基中發(fā)酵20 d，通過結(jié)晶和低溫干燥，將獲得的DC₁₆進行稱重，根據(jù)發(fā)酵液體積，分別計算DC₁₆的發(fā)酵產(chǎn)率（表1）。由表1可以看出，在三種不同的發(fā)酵培養(yǎng)基（I、II和III）中，菌株STKD-1對正十六烷烴發(fā)酵生產(chǎn)DC₁₆的產(chǎn)率均為最大，分別為145.3g/L、176.2 g/L 和114.7 g/L。而比較三種不同的發(fā)酵培養(yǎng)基（I、II和III）對DC₁₆的發(fā)酵產(chǎn)率來看，發(fā)酵培養(yǎng)基II對5菌株的DC₁₆的發(fā)酵產(chǎn)率為最大，所以發(fā)酵生產(chǎn)DC₁₆的最佳組合為發(fā)酵培養(yǎng)基II和菌株STKD-1。據(jù)上述結(jié)果,在后續(xù)實驗中選取菌株STKD-1為代表做進一步分析；

表1 5菌株在不同發(fā)酵培養(yǎng)基（I，II和III）中發(fā)酵20 d時的D₁₆發(fā)酵產(chǎn)率（單位：g/L）

8、STKD-1的分類學(xué)鑒定

5菌株（STKD-1，STKD-2，STKD-3，STKD-4和STKD-5）發(fā)酵生產(chǎn)DC₁₆的結(jié)果表明，菌株STKD-1對正十六烷烴的發(fā)酵產(chǎn)率最大，因此，選取菌株STKD-1,對其系統(tǒng)分類學(xué)位置進行解析；

(1)菌株STKD-1DNA提取

菌株STKD-1 DNA的提取采用試劑盒-DP303來完成，提取步驟參照試劑盒中說明書；

(2) PCR對菌株STKD-1 DNA進行擴增

利用正向引物PF 5′-AGA GTTTGA TCC TGG CTC AG-3′和反向引物PR 5′-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′對菌株STKD-1 16S rDNA進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系（50μL）包括：1μL Taq DNA聚合酶，0.5μL模板DNA，5μL 10×PCR緩沖液，3.5μL MgCl₂，0.5μL PF和PR，2μL dNTP，37μL超純水。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性45S，55℃退火45S，72℃延伸90S，32個循環(huán)，再72℃延伸10 min；

(3) DNA測序

將PCR產(chǎn)物用DNA測序儀（型號：Applied Biosystems 3730XL）進行測序，將測得的序列發(fā)送到DDBJ (DNA Data Bank of Japan）,獲得菌株STKD-1的登錄號為LC094963。

具體序列如下：

aacacatgca agtcgagcgg agagaggtag cttgctaccg atcttagcgg cggacgggtg

agtaatgctt aggaatctgc ctattagtgg gggacaacat ttcgaaagga atgctaatac

cgcatacgtc ctacgggaga aagcagggga tcttcggacc ttgcgctaat agatgagcct

aagtcggatt agctagttgg tggggtaaag gcctaccaag gcgacgatct gtagcgggtc

tgagaggatg atccgccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc

agtggggaat attggacaat gggcgcaagc ctgatccagc catgccgcgt gtgtgaagaa

ggccttatgg ttgtaaagca ctttaagcga ggaggaggct actttagtta atacctagag

atagtggacg ttactcgcag aataagcacc ggctaactct gtgccagcag ccgcggtaat

acagagggtg caagcgttaa tcggatttac tgggcgtaaa gcgcgcgtag gcggctaatt

aagtcaaatg tgaaatcccc gagcttaact tgggaattgc attcgatact ggttagctag

agtgtgggag aggatggtag aattccaggt gtagcggtga aatgcgtaga gatctggagg

aataccgatg gcgaaggcag ccatctggcc taacactgac gctgaggtgc gaaagcatgg

ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccatgccgta aacgatgtct actagccgtt

ggggcctttg aggctttagt gccgcattta acgcgataag tagaccgcct ggggagtacg

gtcgcaagac taaaactcaa atgaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg

tttaattcga tgcaacgcga agaaccttac ctggccttga catagtaaga actttccaga

gatggattgg tgccttcggg aacttacata caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg

tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttttccttat ttgccagcga

gtaatgtcgg gaactttaag gatactgcca gtgacaaact ggaggaaggc ggggacgacg

tcaagtcatc atggccctta cggccagggc tacacacgtg ctacaatggt cggtacaaag

ggttgctacc tagcgatagg atgctaatct caaaaagccg atcgtagtcc ggattggagt

ctgcaactcg actccatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagaa tgccgcggtg

aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagtttg ttgcaccaga

agtagctagc ctaactgcaa agagggcggt （SEQ ID NO:1）；

(4) 系統(tǒng)樹的創(chuàng)建

利用近鄰法對菌株STDK-1其同源性較高菌株的16S rDNA序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹創(chuàng)建，所用軟件為CustalX2.1和Mega5。從系統(tǒng)樹（圖2）可以看出，菌株STDK-1屬于Acinetobacter屬，且與Acinetobacter calcoaceticus (X81661)的16S rDNA序列相似度為最高，為98%，是一種新種菌，命名為Acinetobactersp.STDK-1(LC094963)。

本發(fā)明從土壤中分離出能代謝產(chǎn)生DC₁₆的新細菌，然后在不同組成的培養(yǎng)基中加入正十六烷烴作為細菌的唯一碳源，對其搖床發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液，對發(fā)酵液中DC₁₆進行分離純化，并測定在3L發(fā)酵罐中經(jīng)過20 d發(fā)酵后DC₁₆的產(chǎn)率。另外，對能代謝產(chǎn)生DC₁₆的細菌的DNA進行提取、測序和系統(tǒng)進化位置也進行了分析。結(jié)果表明，在分離純化的5個菌株（STKD-1，STKD-2，STKD-3，STKD-4和STKD-5）中，菌株STKD-1在發(fā)酵培養(yǎng)基II中發(fā)酵時，DC₁₆的產(chǎn)率最大，為176.2 g/L，比之前報道的利用熱帶假絲酵母菌代謝產(chǎn)生DC₁₆的產(chǎn)率都高。通過系統(tǒng)進化樹分析，菌株STKD-1與Acinetobacter calcoaceticus (X81661)的16S rDNA序列相似度為最高(98%)，是一種新種菌，命名為Acinetobactersp.STDK-1，該菌株登錄序號為LC094963。

<120>一種細菌及其在生產(chǎn)十六碳二元酸中的應(yīng)用

<160>1

<210>1

<211>1410

<212>DNA

<213>來源于不動桿菌（Acinetobacter）

<222>(1)..(1410)

<400>1

aacacatgca agtcgagcgg agagaggtag cttgctaccg atcttagcgg cggacgggtg 60

agtaatgctt aggaatctgc ctattagtgg gggacaacat ttcgaaagga atgctaatac 120

cgcatacgtc ctacgggaga aagcagggga tcttcggacc ttgcgctaat agatgagcct 180

aagtcggatt agctagttgg tggggtaaag gcctaccaag gcgacgatct gtagcgggtc 240

tgagaggatg atccgccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc 300

agtggggaat attggacaat gggcgcaagc ctgatccagc catgccgcgt gtgtgaagaa 360

ggccttatgg ttgtaaagca ctttaagcga ggaggaggct actttagtta atacctagag 420

atagtggacg ttactcgcag aataagcacc ggctaactct gtgccagcag ccgcggtaat 480

acagagggtg caagcgttaa tcggatttac tgggcgtaaa gcgcgcgtag gcggctaatt 540

aagtcaaatg tgaaatcccc gagcttaact tgggaattgc attcgatact ggttagctag 600

agtgtgggag aggatggtag aattccaggt gtagcggtga aatgcgtaga gatctggagg 660

aataccgatg gcgaaggcag ccatctggcc taacactgac gctgaggtgc gaaagcatgg 720

ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccatgccgta aacgatgtct actagccgtt 780

ggggcctttg aggctttagt gccgcattta acgcgataag tagaccgcct ggggagtacg 840

gtcgcaagac taaaactcaa atgaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg 900

tttaattcga tgcaacgcga agaaccttac ctggccttga catagtaaga actttccaga 960

gatggattgg tgccttcggg aacttacata caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg 1020

tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttttccttat ttgccagcga 1080

gtaatgtcgg gaactttaag gatactgcca gtgacaaact ggaggaaggc ggggacgacg 1140

tcaagtcatc atggccctta cggccagggc tacacacgtg ctacaatggt cggtacaaag 1200

ggttgctacc tagcgatagg atgctaatct caaaaagccg atcgtagtcc ggattggagt 1260

ctgcaactcg actccatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagaa tgccgcggtg 1320

aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagtttg ttgcaccaga 1380

agtagctagc ctaactgcaa agagggcggt 1410