本發(fā)明涉及一種新的鏈霉菌、通過發(fā)酵培養(yǎng)該菌生產(chǎn)米爾貝霉素A3的方法。
背景技術(shù)：
：米爾貝霉素是微生物天然產(chǎn)物農(nóng)藥，已有數(shù)據(jù)表明它是當今世界上最優(yōu)良的殺螨劑之一。美國環(huán)保署認定其為低危險性殺蟲劑，荷蘭批準其為“GNO”(作物生產(chǎn)中的天然產(chǎn)物)。它屬生態(tài)友好型農(nóng)藥，適用于有機農(nóng)業(yè)病蟲害的綜合防治，在發(fā)達國家已成為一種受歡迎的殺蟲殺螨劑。米爾貝霉素是日本三共公司以二斑葉螨作為試蟲，從微生物的發(fā)酵液中篩選出的具有抗蟲活性的代謝產(chǎn)物(US3,950,360)。經(jīng)過大量基礎(chǔ)研究，1983年米爾貝霉素(milbemycin)A3和A4組分的混合物(A3：A4＝3：7)被用作殺螨劑，米爾貝霉素A3和A4結(jié)構(gòu)如式I所示。1990年，1％的米爾貝霉素乳油(milbeknock)在日本作為殺螨劑用于茶葉、茄子。1993年，1％的米爾貝霉素乳油用作梨、桃、西瓜、草莓、茄子、花卉的殺蟲劑也在日本登記。當前，米爾貝霉素已在日本、歐美等多個國家登記，并且作為安全、對環(huán)境友好的殺蟲殺螨劑被美國環(huán)保局推薦使用。由于米爾貝霉素發(fā)酵液組分復(fù)雜，分離難度較大，因此米爾貝霉素通常情況下是以A3和A4混合組分使用和申報，單一組分的生產(chǎn)與使用則鮮有報導。其最主要的原因在于從A3，A4比例相近的發(fā)酵液中單獨分離出A3，A4單組分難度較大，影響最終收率。以A3為例，發(fā)酵液中A3的含量低于30％，欲獲得A3單組分，則需要損失大量的A4。實現(xiàn)A3或者A4的單一組分生產(chǎn)，可進一步推動米爾貝霉素單組分在其他領(lǐng)域的應(yīng)用。而得到單組分最有效的方法是獲得成能夠生產(chǎn)單一組分的新菌種。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一在于提供一種能提高米爾貝霉素A3單位產(chǎn)量的微生物菌種，該菌種的特點在于其發(fā)酵液中米爾貝霉素A3組分的含量占米爾貝霉素A3和米爾貝霉素A4總含量的百分比大于70％，且米爾貝霉素A3的單位產(chǎn)量可以達到大于3000ug/ml，雜質(zhì)含量低。本發(fā)明的鏈霉菌HS7523的微生物菌種于2014年9月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院，中國科學院微生物研究所)，保藏號為CGMCCNO.9672，分類命名為吸水鏈霉菌Streptomyceshygroscopicus，并登記入冊，證明存活。本發(fā)明的鏈霉菌HS7523主要生物學特征為：ISP1，ISP2，ISP3菌落顏色白色，圓形，中間稍凸起，多皺，直徑大小為中型(約6mm左右)，有少量孢子，基內(nèi)菌絲發(fā)達，菌絲與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，不易挑起。在ISP1，ISP2培養(yǎng)基上無色素產(chǎn)生，在ISP3上有米褐色色素產(chǎn)生。本發(fā)明描述了鏈霉菌HS7523的形態(tài)學和分子水平上的特征，經(jīng)過和已知米爾貝霉素生產(chǎn)菌進行形態(tài)學和分子水平的比較，可以認定鏈霉菌HS7523屬吸水鏈霉菌。鏈霉菌HS7523與Streptomycessp.NRRL573916srRNA同源性99％，與StreptomycesbingchenggensisBCW-1同源性99％。鏈霉菌HS7523菌株與其它米爾貝生產(chǎn)菌在形態(tài)上最大的差異在于其他菌種如Streptomycessp.CGMCC7677的菌落在生產(chǎn)平板上會分泌金黃淚珠體于菌落表面，且有色素產(chǎn)生。而鏈霉菌HS7523在同樣的培養(yǎng)基上顏色灰白，表面無淚珠，無色素產(chǎn)生(見附圖1)。本發(fā)明還提供了一種采用鏈霉菌HS7523(CGMCCNO.9672)制備米爾貝霉素的方法。該方法包括采用鏈霉菌HS7523(CGMCCNO.9672)在含有可同化的碳、氮源的營養(yǎng)培養(yǎng)基里，進行有氧發(fā)酵的過程。優(yōu)選的實施方案中，上述可同化的碳源優(yōu)選自淀粉、糊精、葡萄糖、工業(yè)糖蜜、甘油、蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、木聚糖、甘露醇、山梨醇之一或上述物質(zhì)的組合。優(yōu)選的實施方案中，上述可同化的氮源優(yōu)選自酵母抽提物、酵母粉、牛肉浸膏、胰蛋白胨、蛋白胨、脫脂奶粉、全脂奶粉、黃豆餅粉、棉籽餅粉、花生餅粉、麩質(zhì)粉、玉米漿干粉、麩皮、尿素、銨鹽之一或上述物質(zhì)的組合。優(yōu)選的實施方案中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為20℃-40℃，更優(yōu)優(yōu)選25℃-35℃，培養(yǎng)基pH為6.0-8.0之間，優(yōu)選7.0左右；培養(yǎng)時間為300-360小時；通氧量為0.5-1.0vvm。所述發(fā)酵方式為液體深層發(fā)酵。米爾貝霉素可以通過以下方法進行檢測：取發(fā)酵液0.5ml，加入4.5ml75％乙醇，混合均勻，3000rpm、15分鐘離心，取上層液進樣。HPLC柱：ZorbexRX-C8；150mm*4.6mm；5μm紫外吸收波長：240nm溫度控制：攝氏22度HPLC流動相條件：梯度洗脫進樣量：10μl本發(fā)明采用的米爾貝霉素產(chǎn)生菌為鏈霉菌HS7523(CGMCCNO.9672)、鏈霉菌HS7523(CGMCCNO.9672)自發(fā)的突變株或通過常規(guī)的誘變得到的突變株。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：1.本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)米爾貝霉素的新菌鏈霉菌HS7523及其生產(chǎn)米爾貝霉素的方法。本發(fā)明菌鏈霉菌HS7523的特點在于其發(fā)酵液中米爾貝霉素A3的含量占米爾貝霉素A3和米爾貝霉素A4總含量的百分比大于70％，且米爾貝霉素A3的單位產(chǎn)量可以達到大于3000ug/ml，雜質(zhì)含量低。2.由于本發(fā)明所述的鏈霉菌HS7523通過發(fā)酵方法提高米爾貝霉素A3在發(fā)酵產(chǎn)物中的比例，降低了制備米爾貝霉素A3單一組分的難度，有利于降低生產(chǎn)成本和擴大米爾貝霉素A3單組分的應(yīng)用范圍。3.提高了米爾貝霉素A3發(fā)酵單位。本發(fā)明所述的鏈霉菌HS7523生產(chǎn)米爾貝霉素A3的效價較原始菌StreptomycesmilbemycinicusCGMCCNO.7677大幅提高，有利于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。附圖說明：圖1：本發(fā)明鏈霉菌HS7523菌株的菌落形態(tài)與鏈霉菌StreptomycesmilbemycinicusNO.CGMCC7677對比圖，其中A為鏈霉菌StreptomycesmilbemycinicusNO.CGMCC7677菌落形態(tài)，B為本發(fā)明鏈霉菌HS7523菌落形態(tài)。圖2：本發(fā)明鏈霉菌HS7523在實施例6的50L發(fā)酵罐中生產(chǎn)米爾貝霉素A3和A4的發(fā)酵曲線。圖3：本發(fā)明發(fā)明鏈霉菌HS7523在實施例6條件下產(chǎn)生的米爾貝霉素A3的HPLC圖譜，米爾貝霉素A4的含量為1246mg/L，A3含量為3050mg/L，米爾貝霉素A3的含量占A3和A4總含量的百分比為71％。具體實施方式實施例1：菌株來源本發(fā)明鏈霉菌StreptomyceshygroscopicusHS7523系在米爾貝霉素產(chǎn)生菌StreptomycesmilbemycinicusCGMCCNO.7677(見中國專利CN103789339A)的基礎(chǔ)上，通過多輪的誘變選育(包括NTG，EMS，UV等誘變手段)得到的米爾貝霉素A3高產(chǎn)菌種。該菌種與原始菌種相比，其外觀形態(tài)發(fā)生了較大的變化，屬于形態(tài)突變株。鏈霉菌StreptomycesmilbemycinicusCGMCCNO.7677菌株在ISP3斜面培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)10-12天后，在無菌條件下用接種鏟將菌絲體刮下，在磨口試管中磨碎菌絲體并懸浮于無菌水中，制得菌懸液，采用NTG(亞硝基胍)，EMS(甲基磺酸乙酯)，UV(紫外線)誘變處理，具體方法如下：稱取NTG晶體10mg，溶解在10ml無菌Tris緩沖液(pH8.0)中，再用移液管加入1ml菌懸液，置于28℃培養(yǎng)基中旋轉(zhuǎn)式或往復(fù)式搖床上振蕩處理30min。將處理過的菌懸液經(jīng)適當稀釋涂布于ISP3平板上。未作誘變處理的菌懸液亦經(jīng)適當稀釋涂布于ISP3平板作為對照。28℃培養(yǎng)10天后，檢查菌落數(shù)，并計致死率。取10-1或10-2梯度的單細胞菌懸液5ml-10ml到帶一根回形針的平板內(nèi)(直徑9cm)，置UV誘箱內(nèi)，置磁力攪拌器上，開蓋于UV15W，30cm處照射數(shù)分鐘(一般2-5分鐘)，邊照邊攪拌，照后用黑布包好，然后用生理鹽水(0.9％氯化鈉溶液)稀釋10-2—10-7，分別涂ISP3平板得誘變組。吸取1mlEMS溶于2ml無水乙醇中，再加入22ml，pH7.2的0.1mol/L磷酸緩沖液。取10-1或10-2梯度的單細胞菌懸液5ml到帶一根回形針的平板內(nèi)，加入5ml，4.0％EMS溶液，最后EMS溶液濃度為2.0％，置磁力攪拌器上，攪拌處理20分鐘-60分鐘。誘變平板內(nèi)加入10ml5％的硫代硫酸鈉即可中止反應(yīng)，用生理鹽水依次稀釋10-2—10-7，涂ISP3平板得誘變組。挑選經(jīng)過多輪上述單個或組合誘變后的單菌落不少于10000株，進行搖瓶發(fā)酵，HPLC檢測米爾貝霉素的產(chǎn)量。經(jīng)過多輪誘變，篩選出突變菌株StreptomyceshygroscopicusHS7523。實施例2：鏈霉菌HS7523菌種培養(yǎng)特征參照《鏈霉菌鑒定手冊》、《放線菌的分類與鑒定》、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中的有關(guān)內(nèi)容進行實驗。采用ISP1、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、高氏一號、蘋果酸鈣、營養(yǎng)瓊脂、YMS和查氏十種培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7～10天后，觀察菌絲體的顏色及色素情況(培養(yǎng)特征見表1)。表1鏈霉菌HS7523在10種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征備注：表1中“/”為不產(chǎn)生色素。實施例3：鏈霉菌HS7523生理生化試驗參照《鏈霉菌鑒定手冊》、《放線菌的分類與鑒定》、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中的有關(guān)內(nèi)容進行實驗。除溫度實驗外，均為28℃培養(yǎng)7～10天。1)碳源的利用：采用ISP9作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，各種碳源的終濃度均為1.0％。(結(jié)果見表2)2)無機氮源的利用：采用ISP9作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，硝酸鉀和硫酸銨的濃度均為0.1％。(結(jié)果見表2)3)降解試驗和NaCl耐受實驗(結(jié)果見表7)采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基為GYEA(pH6.8)，各種降解物的濃度見表3。(結(jié)果見表3)4)氧化酶和過氧化氫酶試驗(結(jié)果見表4)、pH試驗(結(jié)果見表5)和溫度試驗(結(jié)果見表6)均采用YMS培養(yǎng)基。表2鏈霉菌HS7523菌株的碳源和氮源的利用情況碳源生長情況碳源生長情況無機氮源生長情況D-葡萄糖4水楊苷4硫酸銨+D-棉子糖4D-乳糖3硝酸鉀-D-木糖0半乳糖4D-山梨醇2肌醇2L-阿拉伯糖0甘露醇3甘油4甘氨酸0麥芽糖4木聚糖4D-果糖1菊粉4D-蔗糖4鼠李糖2表3鏈霉菌HS7523菌株的降解試驗結(jié)果降解物降解物濃度結(jié)果*降解物降解物濃度結(jié)果腺嘌呤0.5％4，+酪蛋白1.0％4，-鳥嘌呤0.5％4，-酪氨酸1.0％4，-黃嘌呤0.4％4，-Tween-401.0％2，+木聚糖0.4％4，-Tween-601.0％3，+次黃嘌呤0.4％4，-Tween-801.0％4，+表4鏈霉菌HS7523菌株主要的生理生化特征試驗項目結(jié)果試驗項目結(jié)果試驗項目結(jié)果明膠液化+牛奶胨化-纖維素利用-淀粉水解+硝酸鹽還原+過氧化氫酶-牛奶凝固-硫化氫產(chǎn)生-V.P實驗-M.R實驗-表5鏈霉菌HS7523菌株生長的pH試驗pH3.54.04.55.05.56.06.57.07.5生長情況004444444表6鏈霉菌HS7523菌株生長的溫度試驗溫度(℃)714283745生長情況03320表7鏈霉菌HS7523菌株對NaCl的耐受性NaCl濃度1％4％7％10％菌株生長情況3000備注：表2-7中：0：無生長；1：生長很弱；2：能生長，有少量孢子；3：生長良好，有大量孢子；4：生長最好，有豐富孢子；+：陽性；-：陰性。實施例4：16SrDNA序列分析及與已知的米爾貝霉素產(chǎn)生菌的比較收集在ISP2上生長好的本發(fā)明菌絲體，接于含玻璃珠的TSB液體培養(yǎng)基中，置于28℃的培養(yǎng)箱中，250r/min震蕩培養(yǎng)2-4d。離心收集菌絲體，用無菌水洗滌2次后保存于4℃?zhèn)溆谩?1)菌絲體1000rpm離心1min。(2)加終濃度為3-4mg/ml的溶菌酶溶液(菌絲體體積:溶菌酶溶液體積＝1:5-10)，37℃水浴1-3hr。(3)加50-100ug/ml蛋白酶K及1％SDS，37℃水浴0.5-3h。(4)加等體積的中性酚/氯仿，振蕩30sec，12000rpm離心5min。(5)上清加1/10體積的3MNaAc溶液和等體積的異丙醇，混勻。室溫放置5min，12000rpm離心5min。(6)沉淀用70％乙醇洗滌2遍，干燥后溶于TE/RNase。(7)將提取的基因組作為模板，采用通用引物進行PCR擴增。上游引物27F為5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’下游引物1495R為5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’反應(yīng)在PCR擴增儀上進行。其程序是：95℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，55℃復(fù)性45s，72℃延伸90s，進行30個循環(huán)，72℃延伸10min。反應(yīng)體系如下：用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。選用條帶清晰的產(chǎn)物進行純化。擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳回收，并連接到T載體后進行測序，獲得了該菌株16SrDNA一級結(jié)構(gòu)的序列。通過在Genebank數(shù)據(jù)庫中進行相似性搜索(blast)，結(jié)果顯示與Streptomycessp.NRRL573916srRNA同源性99％，與StreptomycesbingchenggensisBCW-1同源性99.5％，結(jié)果見表8。表8鏈霉菌HS7523和相關(guān)菌株的同源性鏈霉菌HS7523與已知的米爾貝霉素產(chǎn)生菌的比較據(jù)US3950360報道，米爾貝霉素產(chǎn)生菌StreptomycesNRRLNO.5739在ISP2培養(yǎng)基上氣生菌絲灰色，背面黃褐色，菌落表面有許多黃色淚珠，有黃色色素產(chǎn)生；在ISP4培養(yǎng)基上氣生菌絲灰色，背面土黃，菌落表面也有許多黃色淚珠，有明亮的橄欖綠會色素產(chǎn)生，能夠利用阿拉伯糖和木糖。而本發(fā)明鏈霉菌HS7523在SP2培養(yǎng)基上氣生菌絲白色，背面米色，菌落表面無淚珠，無色素產(chǎn)生；在ISP4培養(yǎng)基上氣生菌絲白色，背面象牙色，菌落表面無淚珠，無色素產(chǎn)生，不能利用阿拉伯糖和木糖。據(jù)CN101100651A報道，米爾貝霉素產(chǎn)生菌冰城鏈霉菌(streptomycesbingchengsissp.nov)CGMCCNO.1734在高氏一號培養(yǎng)基上菌落表面灰色(有黑色吸水斑)，菌落背面黃灰色，有黃褐色色素產(chǎn)生。而本發(fā)明鏈霉菌HS7523在高氏一號培養(yǎng)基上菌落表面中間白，周圍電視灰4，菌落背面電視灰4，無色素產(chǎn)生。綜上所述，本發(fā)明鏈霉菌HS7523屬于鏈霉菌屬，但它不同于已知的米爾貝霉素產(chǎn)生菌StreptomycesNRRLNO.5739，菌冰城鏈霉菌(streptomycesbingchengsissp.nov)CGMCCNO.1734，鏈霉菌HS7523是一株全新的菌種。實施例5：制備米爾貝霉素A3(1)斜面菌絲體的制備與培養(yǎng)斜面孢子培養(yǎng)基配方(g/L)：酵母抽提物2，麥芽抽提物2，蔗糖8，脫脂奶粉1，瓊脂20，消前pH7.0-7.2，試管30×200mm，裝量20mL，經(jīng)121℃滅菌20分鐘后，冷卻到50-60℃擺斜面，接入一環(huán)菌絲體經(jīng)28±1℃培養(yǎng)10天后，菌絲成熟。(2)種子液的制備與培養(yǎng)種子培養(yǎng)基配方(g/L)：酵母抽提物5，蛋白胨5，蔗糖20，脫脂奶粉2，磷酸氫二鉀0.5，消前pH7.0-7.2，搖瓶裝液量為250mL三角瓶裝30mL，經(jīng)121℃滅菌20分鐘。菌體接種量為105-106c.f.u./mL，培養(yǎng)溫度28±1℃，250rpm，搖床振蕩培養(yǎng)48小時。(3)米爾貝霉素A3發(fā)酵培養(yǎng)基的制備與培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L)：酵母抽提物5，蔗糖120，脫脂奶粉10，黃豆餅粉10，棉籽餅粉14，磷酸氫二鉀1，七水硫酸亞鐵0.1，硫酸鋅0.02，碳酸鈣5，硫酸銅0.05，鉬酸鈉0.5，搖瓶裝液量為250mL三角瓶裝30mL，經(jīng)121℃滅菌20分鐘。將種子液以10％(體積百分比)的接種量接入，在28±1℃，250rpm搖床振蕩培養(yǎng)14天，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)HPLC測定，測得米爾貝霉素A4的含量為1206mg/L，A3含量為3100mg/L，米爾貝霉素A3的含量占A3和A4總含量的百分比為72％。實施例6：制備米爾貝霉素A3(1)種子罐種子液的制備在15L種子罐中投入10L的種子培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基的配比見實施例5，同時添加0.25％的泡敵作消泡劑)，滅菌采用蒸汽滅菌，121℃條件下30分鐘，待冷卻后，接入200ml搖瓶種子液，培養(yǎng)溫度28±1℃，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm，通氣量1vvm，培養(yǎng)48小時。(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配制與培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基的配方與前述實施例5相同，但要添加0.25％泡敵作為消泡劑，發(fā)酵罐50L，投料體積為35L，消前pH7.2-7.6，于121℃下蒸汽滅菌25分鐘，冷卻后，接入約3.5L種子罐培養(yǎng)液，發(fā)酵溫度28±1℃，攪拌槳轉(zhuǎn)速底限150rpm，與溶氧關(guān)聯(lián)，溶氧不低于35％。通氣量為0.6vvm，發(fā)酵培養(yǎng)14天，放罐，發(fā)酵液經(jīng)HPLC測定，測得米爾貝霉素A4的含量為1246mg/L，A3含量為3050mg/L，米爾貝霉素A3的含量占A3和A4總含量的百分比為71％。實施例7：制備米爾貝霉素A3(1)種子罐種子液的制備在15T種子罐中投入8T的種子培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基的配比見實施例5，同時添加0.25％的泡敵作消泡劑)，滅菌采用蒸汽滅菌，121℃條件下35分鐘，消后體積10T，待冷卻后，接入2L搖瓶種子液，培養(yǎng)溫度28±1℃，攪拌轉(zhuǎn)速100rpm，通氣量0.8vvm，培養(yǎng)48小時。(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配制與培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基的配方與前述實施例5相同，但要添加0.3％泡敵作為消泡劑，發(fā)酵罐70T，投料體積為55T，消前pH7.2-7.6，于121℃下蒸汽滅菌35分鐘，冷卻后，接入約6T種子罐培養(yǎng)液，發(fā)酵溫度28±1℃，攪拌槳轉(zhuǎn)速底限50rpm，與溶氧關(guān)聯(lián)，溶氧不低于35％。通氣量為0.5vvm，發(fā)酵培養(yǎng)14天，放罐，發(fā)酵液經(jīng)HPLC測定，測得米爾貝霉素A4的含量為1413mg/L，A3含量為3300mg/L，米爾貝霉素A3的含量占A3和A4總含量的百分比為70％。實施例8：制備米爾貝霉素A3種子培養(yǎng)基配方(g/L)：酵母膏10，蛋白胨5，蔗糖40，脫脂奶粉2，磷酸氫二鉀0.5，消前pH7.0-7.2。搖瓶裝液量為250mL三角瓶裝25mL，經(jīng)121℃滅菌20分鐘。從實施例5中的斜面上挖取1×2cm面積的菌塊接入種子瓶中，28±1℃下培養(yǎng)45hr。取上述種子培養(yǎng)液2.5mL接入發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏10，糖蜜200，脫脂奶粉11，黃豆餅粉11，棉籽餅粉11，磷酸氫二鉀1，七水硫酸亞鐵0.1，硫酸鋅0.02，碳酸鈣5，硫酸銅0.05，鉬酸鈉0.5，搖瓶裝液量為250mL三角瓶裝30mL，經(jīng)121℃滅菌20分鐘，在28±1℃，250rpm搖床振蕩培養(yǎng)14天，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)HPLC測定，測得米爾貝霉素A4的含量為1054mg/L，A3含量為3000mg/L，米爾貝霉素A3的含量占A3和A4總含量的百分比為74％。實施例9：制備米爾貝霉素A3種子液的制備與培養(yǎng)同實施例8，取2.5mL種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，蔗糖140，玉米漿10，黃豆餅粉10，麩質(zhì)粉15，磷酸氫二鉀1，七水硫酸亞鐵0.1，硫酸鋅0.02，碳酸鈣5，硫酸銅0.05，鉬酸鈉0.5，搖瓶裝液量為250mL三角瓶裝30mL，經(jīng)121℃滅菌20分鐘，在28±1℃，250rpm搖床振蕩培養(yǎng)14天，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)HPLC測定，測得米爾貝霉素A4的含量為1146mg/L，A3含量為3100mg/L，米爾貝霉素A3的含量占A3和A4總含量的百分比為73％。 對比實施例1：本發(fā)明鏈霉菌HS7523與原始菌CGMCC7677生產(chǎn)米爾貝霉素的對比實驗(1)斜面，種子，發(fā)酵培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件同實施例5，菌種采用原始菌CGMCC7677，進行五組平行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)HPLC測定，測得米爾貝霉素A4的平均含量為748mg/L，A3的平均含量為251mg/L，米爾貝霉素A3的含量占A3和A4總含量的百分比25％。(2)斜面，種子，發(fā)酵培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件同實施例5，菌種采用本發(fā)明鏈霉菌HS7523，進行五組平行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)HPLC測定，測得米爾貝霉素A4的平均含量為1114mg/L，A3的平均含量為3012mg/L，米爾貝霉素A3的含量占A3和A4總含量的百分比為73％。當前第1頁1 2 3