一種制備高純度米爾貝肟的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于動物制藥領域，涉及一種動物用抗生素的生產方法，尤其涉及一種制 備高純度米爾貝肟的方法。
【背景技術】
[0002] 米爾貝廂（milbemycinoxime)是一種新型的半合成的大環(huán)內酯類驅蟲藥物，是米 爾貝霉素A3和A4的肟化衍生物，對控制和預防大部分常見寄生蟲疾病都有很好的效果。通 常用來預防惡絲蟲病，控制線蟲、鉤蟲引發(fā)的犬、貓疾病及犬的鞭蟲病。
[0003] 米爾貝A3肟和米爾貝A4肟的化學結構式如下：
[0004]
[0005]目前米爾貝肟主要是通過發(fā)酵得到的米爾貝霉素半合成來得到，但是米爾貝霉素 發(fā)酵液單位普遍不高，產品的含量較低，組份雜質多，分離困難。這給制備高純度的米爾貝 肟帶來了很大的難度。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種適用于工業(yè)化大生產的高純度米爾貝肟的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的制備高純度米爾貝肟的方法，包括以下步驟：
[0008] 1)將含有米爾貝霉素A3和米爾貝霉素A4組份的發(fā)酵液進行固液分離，然后用第 一溶媒萃取菌渣，得到含有米爾貝霉素A3和米爾貝霉素A4組份的提取液；
[0009] 2)將提取液濃縮后上硅膠柱層析，并用第一溶媒和第二溶媒的混合溶液進行洗 脫，得到含有米爾貝霉素A3和米爾貝霉素A4組份的解吸液；
[0010] 3)將解吸液濃縮，去除溶劑，然后用二氯甲烷溶解濃縮物并進行氧化反應，得到含 有米爾貝霉素A3酮和米爾貝霉素A4酮的二氯甲烷溶液；
[0011] 4)將步驟3)得到的溶液經活性炭吸附脫色后進行濃縮，濃縮物用第一溶媒溶解， 上硅膠柱層析，用第一溶媒和第二溶媒的混合溶液進行洗脫，得到含有米爾貝霉素A3酮和 米爾貝霉素A4酮組份的解吸液，然后濃縮結晶，分離出結晶體；
[0012] 5)對結晶體進行肟化反應，加入水終止反應后加入二氯甲烷萃取，得到含有米爾 貝霉素A3肟和米爾貝霉素A4肟的二氯甲烷溶液；
[0013] 6)將上述的含有米爾貝霉素A3肟和米爾貝霉素A4肟的二氯甲烷溶液去除溶劑， 用第三溶媒的水溶液溶解，進行樹脂層析，然后將解吸液按照米爾貝霉素A3肟和米爾貝霉 素A4肟含量比例為1:4進行混合，得到解吸混合液；
[0014] 7)用庚烷萃取解吸混合液，得到含有米爾貝霉素A3肟和米爾貝霉素A4肟的庚烷 溶液，然后去除溶劑，再用第三溶媒溶解，加水降溫進行結晶，固液分離、干燥得到米爾貝肟 晶體。
[0015] 上述步驟1)的發(fā)酵液是通過現(xiàn)有技術進行菌種發(fā)酵培養(yǎng)得到的含有米爾貝霉素 A3和A4組份的發(fā)酵液；所述第一溶媒可以是庚烷或甲苯，優(yōu)選庚烷；萃取溶媒用量優(yōu)選為 菌渣重量的8~10倍；萃取溫度以30~40°C為宜。
[0016] 上述步驟2)將提取液濃縮至米爾貝霉素A3和米爾貝霉素A4組份的濃度為10~ 15g/L，并通過除菌板除菌后再上硅膠柱；其中所述除菌板的孔徑為0. 2~0. 45μm;所使用 的硅膠為工業(yè)級層析硅膠，粒徑為100~400目，干硅膠粉末的使用重量優(yōu)選為米爾貝霉素 A3和米爾貝霉素A4組份凈含量重量的50~100倍；所述第二溶媒可以是丙酮或丁酮，優(yōu) 選丙酮；第一溶媒和第二溶媒混合的比例優(yōu)選為第一溶媒體積（V):第二溶媒體積（V)= 80:20 ~95:5〇
[0017]上述步驟3)氧化反應使用的氧化劑可以是活性二氧化錳、氯鉻酸吡啶鹽（PCC)、 重鉻酸吡啶鹽（roc)等；更優(yōu)選活性二氧化錳。
[0018] 上述步驟4)中使用的活性炭優(yōu)選針用活性炭；活性炭的加入量為米爾貝霉素A3 酮和米爾貝霉素A4酮總量的2~3倍（質量）；活性炭加入后保持二氯甲烷溶液的溫度范 圍為30~35°C攪拌1~2小時，然后通過除菌板去除活性炭粉末，得到澄清的含有米爾貝 霉素A3酮和米爾貝霉素A4酮的二氯甲烷溶液。將澄清的含有米爾貝霉素A3酮和米爾貝 霉素A4酮的二氯甲烷溶液濃縮去除溶劑后，用第一溶媒溶解，上硅膠柱層析，所述硅膠為 工業(yè)級層析硅膠，粒徑為100~400目，干硅膠粉末的使用量為米爾貝霉素A3酮和米爾貝 霉素A4酮組份重量的50~100倍；洗脫所用的混合溶媒中第一溶媒體積（V):第二溶媒 體積（V) = 5:1 ~11:1。
[0019] 上述步驟5)肟化反應可以是：將米爾貝霉素酮結晶體用無水乙醇完全溶解后， 將鹽酸羥胺的水溶液緩慢加入該米爾貝霉素酮乙醇溶液中，攪拌混合同時保持溶液溫度為 20~25°C，反應1小時以上，直到米爾貝霉素酮完全轉變成米爾貝霉素肟后終止反應。
[0020] 上述步驟6)中所述第三溶媒優(yōu)選為乙醇或甲醇，更優(yōu)選甲醇；樹脂層析所使用的 上柱液為第三溶媒的水溶液，其中第三溶媒的體積百分含量為55%~60%;樹脂層析所使 用的解吸液也是第三溶媒的水溶液，其中第三溶媒的體積百分含量為60%~70%且高于 上柱液的含量；所使用的樹脂優(yōu)選為苯乙烯-聚苯乙烯系列的非極性大孔樹脂。
[0021] 上述步驟7)先在解吸混合液中加入兩倍解吸混合液體積的水，再用庚烷進行萃 取，得到含有米爾貝霉素A3肟和米爾貝霉素A4肟的庚烷溶液；然后將上述庚烷溶液去除溶 劑后加入第三溶媒進行溶解，得到米爾貝霉素A3肟和米爾貝霉素A4肟總濃度為20g/L~ 50g/L的溶液；再緩慢加入體積為第三溶媒體積3~4倍的水，降低溶液溫度到10~20°C， 緩慢攪拌結晶；最后固液分離、真空干燥得到含高純度米爾貝肟的結晶體。
[0022] 本發(fā)明提供了一種較簡單的純化方式得到高純度的米爾貝肟，非常適用于工業(yè)化 大生產。組份我們在研究過程中驚喜的發(fā)現(xiàn)通米爾貝霉素A3和米爾貝霉素A4組份的混合 物，在使用氧化活性較低的氧化劑氧化后，通過一次硅膠層析，米爾貝霉素A3酮和米爾貝 霉素A4酮的含量輕松的由不到25%提高到了 75%以上，且在氧化酮解吸液的濃縮過程中 米爾貝霉素A3酮和米爾貝霉素A4酮會自然析出結晶，產品的含量再次上升到95%以上，通 過樹脂層析調整米爾貝霉素A3肟和米爾貝霉素A4肟的含量比例的同時能夠再次將產品的 含量提高到98%以上。整個工藝比較簡單，對設備要求較低，通用性好，無需太大的改造，可 以快速進行工業(yè)化大生產。
【具體實施方式】
[0023] 以下通過【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步說明，但這并非是對本發(fā)明的限制，本 領域技術人員根據本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發(fā)明 的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內。
[0024] 下列實施例中，為了方便描述，將米爾貝霉素A3和米爾貝霉素A4產品之和稱為 "米爾貝霉素組份";將米爾貝霉素A3酮和米爾貝霉素A4酮產品之和稱為"米爾貝酮組份"； 將米爾貝霉素A3肟和米爾貝霉素A4肟產品之和稱為"米爾貝肟組份"。
[0025] 實施例1
[0026] 對含有米爾貝霉素A3和米爾貝霉素A4組份的發(fā)酵液進行板框壓濾，菌渣用8倍 菌渣重量的甲苯萃取，得到的甲苯萃取液經過高壓液色譜相檢測計算含米爾貝霉素組份 100g。濃縮甲苯萃取液，直到甲苯中米爾貝霉素組份的含量為15g/L，甲苯萃取濃縮液通過 0. 45μm孔徑的除菌板過濾。
[0027] 過濾后的甲苯萃取液進行硅膠上柱。硅膠柱由5kg的干硅膠裝填而成，硅膠粒徑 為100~200目。上柱完成后用甲苯：丙酮=95:5(V/V)的解吸液對硅膠柱進行解析。合 并解吸液，得到的解吸液含有米爾貝霉素組份90g，取小部分解吸液濃縮干，通過高壓液相 色譜檢測計算米爾貝霉素組份在濃縮物中的質量含量為20 %。
[0028] 將米爾貝霉素組份的解吸液減壓濃縮干，回收溶劑，濃縮物用二氯甲烷溶解，投入 活性二氧化錳氧化，直到高壓液相色譜檢測所有米爾貝霉素組份氧化成米爾貝酮組份后將 二氯甲烷中的活性二氧化錳過濾去除。得到二氯甲烷溶液含米爾貝酮組份86g。向二氯甲 烷溶液投入針用活性炭258g，水浴35°C下攪拌2小時，通過除菌板過濾去除活性炭。過濾 后的二氯甲烷米爾貝酮組份溶液，濃縮干回收二氯甲烷后用甲苯溶解濃縮物。
[0029] 用8. 6kg重量的干硅膠在甲苯中浸泡后裝填層析柱。含有米爾貝酮組份的甲苯溶 液上柱后，用甲苯：丙酮=11:1(V/V)的解吸液對硅膠柱進行解吸，收集含有米爾貝酮組 份的解吸液，得到含有米爾貝酮組份76g的解吸液混合液。濃縮解吸液過程中結晶，離心機 分離結晶體68g，高壓液相色譜檢測后計算其中含米爾貝酮組份65g。
[0030] 將米爾貝酮結晶體用1760mL無水乙醇溶解，稱取163. 2g鹽酸羥胺用163mL純化 水溶解完全，將鹽酸羥胺水溶液緩慢加入米爾貝酮乙醇溶液中，攪拌并保持溶液20°C，加入 完1小時后取樣，用高壓液相色譜檢測，米爾貝酮反應完全，立即加入水終止反應，并用二 氯甲烷萃取，得到含有米爾貝肟組份的二氯甲烷溶液，通過高壓液相色譜檢測計算二氯甲 烷溶液中含有米爾貝肟63g。
[0031] 濃縮干二氯甲烷溶液，用甲醇溶液溶解濃縮物，再向其中緩慢加入水，使其甲醇的 體積百分比降低為60%，用上海華震色譜-3樹脂進行層析，上柱完成后用甲醇的體積百分 比為70%的甲醇水溶液進行解析，收集含有米爾貝肟的解吸液，通過高壓液相色譜檢測調 整混合解吸液中米爾貝霉素A3肟色譜含量和米爾貝霉素A4肟組份色譜含量比例=1: 4。 解吸液中加入2倍解吸液體積的水，并用庚烷萃取，通過高壓液相色譜檢測計算庚烷溶液 中含有米爾貝肟組份50g
[0032] 濃縮干并回收庚烷，用2. 5L甲醇溶解濃縮物，再向其中緩慢加入10L純化水，降低 溫度到20C結晶。
[0033] 離心分離結晶物，真空干燥得到米爾貝肟結晶體48g，通過高壓液相色譜檢測其中 米爾貝肟組份質量百分含量為98. 3%。
[0034] 實施例2
[0035] 對含有米爾貝霉素A3和米爾貝霉素A4組份的發(fā)酵液進行板框壓濾，菌渣用10 倍菌渣重量的庚烷萃取，得到的庚烷萃取液經過高壓液相色譜檢測計算含米爾貝霉素組份 120g。濃縮庚烷萃取液，直到庚烷中米爾貝霉素組份的含量為10g/L，庚烷萃取濃縮液通過 0.2μπι孔徑的除菌板過濾。
[0036] 過濾后的庚烷萃取液進行硅膠上柱。硅膠柱由12kg的干硅膠裝填而成，硅膠粒徑 為300~400目。上柱完成后用庚烷：丁酮= 80:20 (V/V)的解吸液對硅膠柱進行解析。合 并解吸液，得到的解吸液含有米爾貝霉