本發(fā)明涉及一種新的鏈霉菌、通過發(fā)酵培養(yǎng)該菌生產(chǎn)米爾貝霉素A4的方法。

背景技術(shù)：

米爾貝霉素是微生物天然產(chǎn)物農(nóng)藥，已有數(shù)據(jù)表明它是當今世界上最優(yōu)良的殺螨劑之一。美國環(huán)保署認定其為低危險性殺蟲劑，荷蘭批準其為“GNO”(作物生產(chǎn)中的天然產(chǎn)物)。它屬生態(tài)友好型農(nóng)藥，適用于有機農(nóng)業(yè)病蟲害的綜合防治，在發(fā)達國家已成為一種受歡迎的殺蟲殺螨劑。

米爾貝霉素是日本三共公司以二斑葉螨作為試蟲，從微生物的發(fā)酵液中篩選出的具有抗蟲活性的代謝產(chǎn)物(US3,950,360)。經(jīng)過大量基礎(chǔ)研究，1983年米爾貝霉素(milbemycin)A3和A4組分的混合物(A3：A4＝3：7)被用作殺螨劑，米爾貝霉素A3和A4結(jié)構(gòu)如式I所示。1990年，1％的米爾貝霉素乳油(milbeknock)在日本作為殺螨劑用于茶葉、茄子。1993年，1％的米爾貝霉素乳油用作梨、桃、西瓜、草莓、茄子、花卉的殺蟲劑也在日本登記。當前，米爾貝霉素已在日本、歐美等多個國家登記，并且作為安全、對環(huán)境友好的殺蟲殺螨劑被美國環(huán)保局推薦使用。

日本三共公司是米爾貝霉素的原研廠，其1980年發(fā)表的文獻中表明米爾貝霉素A3+A4的含量僅僅只有150mg/L左右(Yo Takiguchi et al,The J.of Antibiotics,1980,OCT,1120-1127)。后經(jīng)過菌種誘變和發(fā)酵條件優(yōu)化，1990年米爾貝霉素A3+A4的含量達到530mg/L(Koicchi Nonaka et al,Actinomycetol.1990， 13:32-41)。國內(nèi)米爾貝霉素研發(fā)啟動較晚，主要集中在東北農(nóng)業(yè)大學項文勝課題組，目前也取得了較大的突破，如在2011年發(fā)表的文獻中米爾貝霉素A3+A4的單位含量最高達到了1595mg/L(Zhang Baoxin et al，African J Biotechnol10(37):7225-7235)，在中國專利CN 103468625 A中米爾貝霉素A3+A4的單位含量提高至2237mg/L。

米爾貝霉素發(fā)酵液組分復雜，米爾貝霉素A3，A4為主要成分，另外還含有其他結(jié)構(gòu)類似物。通常情況下米爾貝霉素發(fā)酵液中米爾貝霉素A3和A4的比例大約為1:2，因此現(xiàn)有的商業(yè)化產(chǎn)品也是A3，A4的混合組分。導致這一結(jié)果最主要的原因在于要從A3，A4比例相近的發(fā)酵液中單獨分離出A3，A4單組分難度較大，影響最終收率。實現(xiàn)A4的單一組分生產(chǎn)，可進一步推動米爾貝霉素A4單組分在其他領(lǐng)域的應用。而得到單組分最有效的方法是獲得能夠生產(chǎn)單一組分的新菌種，并進一步提高發(fā)酵單位。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種能提高米爾貝霉素A4單位產(chǎn)量的微生物菌種，該菌種的特點在于其發(fā)酵液中米爾貝霉素A4的含量占A3和A4總含量的百分比大于80％，且米爾貝霉素A4的單位產(chǎn)量可以達到大于4000ug/ml，米爾貝霉素A3+A4的單位產(chǎn)量可以達到大于5000ug/ml，發(fā)酵單位高，雜質(zhì)含量低。

本發(fā)明的鏈霉菌HS7522的微生物菌種于2014年9月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院，中國科學院微生物研究所)，保藏號為CGMCC NO.9671，分類命名為吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)，并登記入冊，證明存活。

本發(fā)明的鏈霉菌HS7522主要生物學特征為：ISP1上菌落顏色白色，ISP2上菌落卵石灰，ISP3上亮象牙色，圓形，中間稍凸起，多皺，直徑大小為中型(約6mm左右)，除ISP1外，孢子量豐富，基內(nèi)菌絲發(fā)達，菌絲與培養(yǎng)基結(jié)合緊密，不易挑起。在ISP1，ISP2培養(yǎng)基上無色素產(chǎn)生，在ISP3上有土黃灰色色素產(chǎn)生。

本發(fā)明描述了鏈霉菌HS7522的形態(tài)學和分子水平上的特征，經(jīng)過和已知米爾貝霉素生產(chǎn)菌進行形態(tài)學和分子水平的比較，可以認定鏈霉菌HS7522屬吸水鏈霉菌。鏈霉菌HS7522與Streptomyces sp.NRRL 5739 16s rRNA同源性99.5％， 與Streptomyces bingchenggensis BCW-1同源性99.9％。本菌株與多數(shù)米爾貝生產(chǎn)菌在形態(tài)上最大的差異在于其他菌種如Streptomyces sp.CGMCC 7677的菌落在生產(chǎn)平板上會分泌金黃淚珠體于菌落表面。而HS7522在同樣的培養(yǎng)基上顏色鼠灰，表面無淚珠(見附圖1)。

本發(fā)明的還提供了一種采用鏈霉菌HS7522(CGMCC NO.9671)制備米爾貝霉素的方法。該方法包括采用鏈霉菌HS7522(CGMCC NO.9671)在含有可同化的碳、氮源的營養(yǎng)培養(yǎng)基里，進行有氧發(fā)酵的過程。

優(yōu)選的實施方案中，上述可同化的碳源優(yōu)選自淀粉、糊精、葡萄糖、工業(yè)糖蜜、甘油、蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、木聚糖、甘露醇、山梨醇之一或上述物質(zhì)的組合。

優(yōu)選的實施方案中，上述可同化的氮源優(yōu)選自酵母抽提物、酵母粉、牛肉浸膏、胰蛋白胨、蛋白胨、脫脂奶粉，全脂奶粉，黃豆餅粉、棉籽餅粉、花生餅粉、麩質(zhì)粉、玉米漿干粉、麩皮、尿素、銨鹽之一或上述物質(zhì)的組合。

優(yōu)選的實施方案中，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為20℃-40℃，優(yōu)選25℃-35℃，培養(yǎng)基pH為6.0-8.0，優(yōu)選7.0左右；培養(yǎng)時間為300-360小時；通氧量為0.5-1.0vvm。

所述發(fā)酵方式為液體深層發(fā)酵。

米爾貝霉素可以通過以下方法進行檢測：

取發(fā)酵液0.5ml，加入4.5ml 75％乙醇，混合均勻，3000rpm、15分鐘離心，取上層液進樣。

HPLC柱：Zorbex RX-C8；150mm*4.6mm；5μm

紫外吸收波長：240nm

溫度控制：攝氏22度

HPLC流動相條件：梯度洗脫

進樣量：10μl

本發(fā)明采用的米爾貝霉素產(chǎn)生菌為鏈霉菌HS7522(CGMCC NO.9671)、鏈霉菌HS7522(CGMCC NO.9671)自發(fā)的突變株或通過常規(guī)的誘變得到的突變株。

本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：

1.本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)米爾貝霉素的新菌鏈霉菌HS7522及其生產(chǎn)米爾貝霉素的方法。本發(fā)明鏈霉菌HS7522的特點在于其發(fā)酵液中米爾貝霉素A4的含量占A3和A4總含量的百分比大于80％，且米爾貝霉素A4的單位產(chǎn)量可以達到大于4000ug/ml，米爾貝霉素A3+A4的單位產(chǎn)量可以達到大于5000ug/ml，發(fā)酵單位高，雜質(zhì)含量低。

2.由于本發(fā)明所述的鏈霉菌HS7522通過發(fā)酵方法提高米爾貝霉素A4在發(fā)酵產(chǎn)物中的比例，降低了制備米爾貝霉素A4單一組分的難度，有利于降低生產(chǎn)成本和擴大米爾貝霉素A4單組分的應用范圍。

3.提高了米爾貝霉素A4發(fā)酵單位。本發(fā)明所述的鏈霉菌HS7522生產(chǎn)米爾貝霉素A4的效價較原始菌Streptomyces milbemycinicus CGMCC NO.7677大幅提高，有利于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明：

圖1：本發(fā)明鏈霉菌HS7522菌株的菌落形態(tài)與鏈霉菌Streptomyces milbemycinicus NO.CGMCC 7677對比圖，其中B為鏈霉菌Streptomyces milbemycinicus NO.CGMCC 7677菌落形態(tài)，A為本發(fā)明鏈霉菌HS7522菌落形態(tài)。

圖2：本發(fā)明鏈霉菌HS7522在實施例6的50L發(fā)酵罐中生產(chǎn)米爾貝霉素A3和A4的發(fā)酵曲線。

圖3：本發(fā)明鏈霉菌HS7522在實施例6條件下產(chǎn)生的米爾貝霉素A4的HPLC圖譜，米爾貝霉素A4含量為4100mg/L，A3含量962mg/L，米爾貝霉素A4的含量占A3和A4總含量的百分比為81％。

具體實施方式

實施例1：菌株來源

本發(fā)明鏈霉菌Streptomyces hygroscopicus HS7522系在米爾貝霉素產(chǎn)生菌種Streptomyces milbemycinicus CGMCC 7677(見中國專利CN103789339A)的基礎(chǔ)上，通過多輪的誘變選育(包括NTG，EMS，UV等誘變手段)得到的米爾貝霉素A4高比例菌種。該菌種與原始菌種相比，其外觀形態(tài)發(fā)生了較大的變化，屬于形態(tài)突變株。

鏈霉菌Streptomyces milbemycinicus CGMCC NO.7677菌株在ISP3斜面培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)10-12天后，在無菌條件下用接種鏟將菌絲體刮下，在磨口試管中磨碎菌絲體并懸浮于無菌水中，制得菌懸液，采用NTG(亞硝基胍)，EMS(甲基磺酸乙酯)，UV(紫外線)誘變處理。

稱取NTG晶體10mg，溶解在10ml無菌Tris緩沖液(pH8.0)中，再用移液管加入1ml菌懸液，置于28℃培養(yǎng)基中旋轉(zhuǎn)式或往復式搖床上振蕩處理30min。將處理過的菌懸液經(jīng)適當稀釋涂布于ISP3平板上。未作誘變處理的菌懸液亦經(jīng)適當稀釋涂布于ISP3平板作為對照。28℃培養(yǎng)10天后，檢查菌落數(shù)，并計致死率。

取10^-1或10^-2梯度的單細胞菌懸液5ml-10ml到帶一根回形針的平板內(nèi)(直徑9cm)，置UV誘箱內(nèi),置磁力攪拌器上，開蓋于UV15W，30cm處照射數(shù)分鐘(一般2-5分鐘)，邊照邊攪拌，照后用黑布包好.然后用生理鹽水(0.9％氯化鈉溶液)稀釋10^-2—10^-7，分別涂ISP3平板得誘變組。

吸取1ml EMS溶于2ml無水乙醇中，再加入22ml，pH7.2的0.1mol/L磷酸緩沖液。取10^-1或10^-2梯度的單細胞菌懸液5ml到帶一根回形針的平板內(nèi)，加入5ml，4.0％EMS溶液，最后EMS溶液濃度為2.0％，置磁力攪拌器上，攪拌處理20分鐘至60分鐘。誘變平板內(nèi)加入10ml 5％的硫代硫酸鈉即可中止反應，用生理鹽水依次稀釋10^-2—10^-7，涂ISP3平板得誘變組。

挑選經(jīng)過多輪上述單個或組合誘變后的單菌落不少于10000株，進行搖瓶發(fā)酵，HPLC檢測米爾貝霉素的產(chǎn)量。經(jīng)過多輪誘變，篩選出突變菌株Streptomyces hygroscopicus HS7522。

實施例2：鏈霉菌HS7522菌種培養(yǎng)特征

參照《鏈霉菌鑒定手冊》、《放線菌的分類與鑒定》、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中的有關(guān)內(nèi)容進行實驗。

采用ISP1、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、高氏一號、蘋果酸鈣、營養(yǎng)瓊脂、YMS和查氏十種培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7～10天后，觀察菌絲體的顏色及色素情況(培養(yǎng)特征見表1)。

表1 鏈霉菌HS7522在10種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征

備注：表1中“/”為不產(chǎn)生色素。

實施例3：生理生化試驗

參照《鏈霉菌鑒定手冊》、《放線菌的分類與鑒定》、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中的有關(guān)內(nèi)容進行實驗。除溫度實驗外，均為28℃培養(yǎng)7～10天。

1)碳源的利用：采用ISP9作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，各種碳源的終濃度均為1.0％。(結(jié)果見表2)

2)無機氮源的利用：采用ISP9作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，硝酸鉀和硫酸銨的濃度均為0.1％。(結(jié)果見表2)

3)降解試驗和NaCl耐受實驗(結(jié)果見表7)采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基為GYEA(pH6.8)，各種降解物的濃度見表3。(結(jié)果見表3)

4)氧化酶和過氧化氫酶試驗(結(jié)果見表4)、pH試驗(結(jié)果見表5)和溫度試驗(結(jié)果見表6)均采用YMS培養(yǎng)基。

表2 鏈霉菌HS7522菌株的碳源和氮源的利用情況

表3 鏈霉菌HS7522菌株的降解試驗結(jié)果

表4 鏈霉菌HS7522菌株主要的生理生化特征

表5 鏈霉菌HS7522菌株生長的pH試驗

表6 鏈霉菌HS7522菌株生長的溫度試驗

表7 鏈霉菌HS7522菌株對NaCl的耐受性

備注：表2-7中，0：無生長；1：生長很弱；2：能生長，有少量孢子；3：生長良好，有大量孢子；4：生長最好，有豐富孢子；+：陽性；-：陰性。

實施例4：16S rDNA序列分析

收集在ISP2上生長好的本發(fā)明菌絲體，接于含玻璃珠的TSB液體培養(yǎng)基中，置于28℃的培養(yǎng)箱中，250r/min震蕩培養(yǎng)2-4d。離心收集菌絲體，用無菌水洗滌2次后保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

(1)菌絲體1000rpm離心1min。

(2)加終濃度為3-4mg/ml的溶菌酶溶液(菌絲體體積:溶菌酶溶液體積＝1:5-10)，37℃水浴1-3hr。

(3)加50-100ug/ml蛋白酶K及1％SDS，37℃水浴0.5-3h。

(4)加等體積的中性酚/氯仿，振蕩30sec，12000rpm離心5min。

(5)上清加1/10體積的3M NaAc溶液和等體積的異丙醇，混勻。室溫放置5min，12000rpm離心5min。

(6)沉淀用70％乙醇洗滌2遍，干燥后溶于TE/RNase。

(7)將提取的基因組作為模板，采用通用引物進行PCR擴增。

上游引物27F為5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

下游引物1495R為5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’

反應在PCR擴增儀上進行。其程序是：95℃預變性5min，94℃變性45s，55℃復性45s，72℃延伸90s，進行30個循環(huán)，72℃延伸10min。反應體系如下：

用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。選用條帶清晰的產(chǎn)物進行純化。擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳回收，并連接到T載體后進行測序，獲得了該菌株16S rDNA一級結(jié)構(gòu)的序列。通過在Genebank數(shù)據(jù)庫中進行相似性搜索(blast)，結(jié)果顯示與Streptomyces sp.NRRL 573916s rRNA同源性99.5％，與Streptomyces bingchenggensis BCW-1同源性99.9％。

表8 鏈霉菌HS7522和相關(guān)菌株的同源性

鏈霉菌HS7522與已知的米爾貝霉素產(chǎn)生菌的比較

據(jù)CN101100651A報道，米爾貝霉素產(chǎn)生菌冰城鏈霉菌(streptomyces bingchengsis sp.nov)CGMCC NO.1734在高氏一號培養(yǎng)基上菌落表面灰色(有黑色吸水斑)，菌落背面黃灰色，有黃褐色色素產(chǎn)生。而本發(fā)明鏈霉菌HS7522在高氏一號培養(yǎng)基上菌落表面白色，菌落背面米褐色，無色素產(chǎn)生。

據(jù)US3950360報道，米爾貝霉素產(chǎn)生菌Streptomyces NRRL NO.5739在ISP2培養(yǎng)基上氣生菌絲灰色，背面黃褐色，菌落表面有許多黃色淚珠，有黃色色素產(chǎn)生； 在ISP4培養(yǎng)基上氣生菌絲灰色，背面土黃，菌落表面也有許多黃色淚珠，有明亮的橄欖綠會色素產(chǎn)生，能夠利用阿拉伯糖和木糖。而本發(fā)明鏈霉菌HS7522在SP2培養(yǎng)基上氣生菌絲卵石灰，背面米紅色，菌落表面無淚珠，無色素產(chǎn)生；在ISP4培養(yǎng)基上氣生菌絲象牙色，背面象牙色，菌落表面無淚珠，無色素產(chǎn)生，不能利用阿拉伯糖和木糖。

綜上所述，本發(fā)明鏈霉菌HS7522屬于鏈霉菌屬，但它不同于已知的米爾貝霉素產(chǎn)生菌Streptomyces NRRL NO.5739，菌冰城鏈霉菌(streptomyces bingchengsis sp.nov)CGMCC NO.1734，鏈霉菌HS7522是一株全新的菌種。

實施例5：制備米爾貝霉素A4

(1)斜面菌絲體的制備與培養(yǎng)

斜面孢子培養(yǎng)基配方(g/L)：酵母抽提物2，麥芽抽提物2，蔗糖10，脫脂奶粉1.2，瓊脂20，消前pH 7.0-7.2，試管30×200mm，裝量20mL，經(jīng)121℃滅菌20分鐘后，冷卻到50-60℃擺斜面，接入一環(huán)菌絲體經(jīng)28±1℃培養(yǎng)10天后，菌絲成熟。

(2)種子液的制備與培養(yǎng)

種子培養(yǎng)基配方(g/L)：酵母抽提物5，蛋白胨5，蔗糖20，脫脂奶粉3，磷酸氫二鉀0.8，消前pH6.8-7.2，搖瓶裝液量為250mL三角瓶裝30mL，經(jīng)121℃滅菌20分鐘。菌體接種量為10⁵-10⁶c.f.u./mL，培養(yǎng)溫度28±1℃，250rpm，搖床振蕩培養(yǎng)48小時。

(3)米爾貝霉素A4發(fā)酵培養(yǎng)基的制備與培養(yǎng)

發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L)：酵母抽提物5，蔗糖100，脫脂奶粉11，黃豆餅粉10，棉籽餅粉14，磷酸氫二鉀1，七水硫酸亞鐵0.1，硫酸鋅0.02，碳酸鈣5，硫酸銅0.05，鉬酸鈉0.5，搖瓶裝液量為250mL三角瓶裝30mL，經(jīng)121℃滅菌20分鐘。將種子液以10％(體積百分比)的接種量接入，在28±1℃，250rpm搖床振蕩培養(yǎng)14天，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)HPLC測定，測得米爾貝霉素A4含量為3900mg/L，A3含量為967mg/L，米爾貝霉素A4的含量占A3和A4總含量的百分比為80.1％。實施例6：制備米爾貝霉素A4

(1)種子罐種子液的制備

在15L種子罐中投入10L的種子培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基的配比見實施例5，同時添加0.25％的泡敵作消泡劑)，滅菌采用蒸汽滅菌，121℃條件下30分鐘，待 冷卻后，接入200ml搖瓶種子液，培養(yǎng)溫度28±1℃，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm，通氣量1vvm，培養(yǎng)48小時。

(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配制與培養(yǎng)

發(fā)酵培養(yǎng)基的配方與前述實施例5相同，但要添加0.25％泡敵作為消泡劑，發(fā)酵罐50L，投料體積為35L，消前pH7.0-7.6，于121℃下蒸汽滅菌25分鐘，冷卻后，接入約3.5L種子罐培養(yǎng)液，發(fā)酵溫度28±1℃，攪拌槳轉(zhuǎn)速底限150rpm，與溶氧關(guān)聯(lián)，溶氧不低于35％。通氣量為0.6vvm，發(fā)酵培養(yǎng)14天，放罐，發(fā)酵液經(jīng)HPLC測定，測得米爾貝霉素A4含量為4100mg/L，A3含量為962mg/L，米爾貝霉素A4的含量占A3和A4總含量的百分比為81％。

實施例7：制備米爾貝霉素A4

(1)種子罐種子液的制備

在15T種子罐中投入8T的種子培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基的配比見實施例5，同時添加0.25％的泡敵作消泡劑)，滅菌采用蒸汽滅菌，121℃條件下35分鐘，消后體積10T，待冷卻后，接入2L搖瓶種子液，培養(yǎng)溫度28±1℃，攪拌轉(zhuǎn)速100rpm，通氣量0.8vvm，培養(yǎng)48小時。

(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配制與培養(yǎng)

發(fā)酵培養(yǎng)基的配方與前述實施例5相同，但要添加0.3％泡敵作為消泡劑，發(fā)酵罐70T，投料體積為55T，消前pH6.8-7.6，于121℃下蒸汽滅菌35分鐘，冷卻后，接入約6T種子罐培養(yǎng)液，發(fā)酵溫度28±1℃，攪拌槳轉(zhuǎn)速底限50rpm，與溶氧關(guān)聯(lián)，溶氧不低于35％。通氣量為0.5vvm，發(fā)酵培養(yǎng)14天，放罐，發(fā)酵液經(jīng)HPLC測定，測得米爾貝霉素A4含量為4020mg/L，A3含量為961mg/L，米爾貝霉素A4的含量占A3和A4總含量的百分比為80.7％。

實施例8：制備米爾貝霉素A4

種子培養(yǎng)基配方(g/L)：酵母浸粉5，蛋白胨5，蔗糖40，磷酸氫二鉀0.5，消前pH7.0-7.4。搖瓶裝液量為250mL三角瓶裝25mL，經(jīng)121℃滅菌20分鐘。從實施例5中的斜面上挖取1×2cm面積的菌塊接入種子瓶中，28±1℃下培養(yǎng)45hr。取上述種子培養(yǎng)液2.5mL接入發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏12，糖蜜200，脫脂奶粉11，黃豆餅粉11，棉籽餅粉11，磷酸氫二鉀1，七水硫酸亞鐵0.1，硫酸鋅0.02，碳酸鈣5，硫酸銅0.05，鉬酸鈉0.5，搖瓶裝液量為250mL三角瓶裝30mL， 經(jīng)121℃滅菌20分鐘，在28±1℃，250rpm搖床振蕩培養(yǎng)14天，發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液經(jīng)HPLC測定，測得米爾貝霉素A4的含量為3960mg/L，A3含量為929mg/L，米爾貝霉素A4的含量占A3和A4總含量的百分比為81％。

實施例9：制備米爾貝霉素A4

種子液按實施例8進行，然后2.5mL種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10，蔗糖140，玉米漿10，黃豆餅粉10，麩質(zhì)粉15，磷酸氫二鉀1，七水硫酸亞鐵0.1，硫酸鋅0.02，碳酸鈣5，硫酸銅0.05，鉬酸鈉0.5，搖瓶裝液量為250mL三角瓶裝30mL，經(jīng)121℃滅菌20分鐘，在28±1℃，250rpm搖床振蕩培養(yǎng)14天，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)HPLC測定，測得米爾貝霉素A4的含量為4100mg/L，A3含量為900mg/L，米爾貝霉素A4的含量占A3和A4總含量的百分比為82％。對比實施例1：本發(fā)明鏈霉菌HS7522與原始菌CGMCC 7677生產(chǎn)米爾貝霉素的對比實驗

(1)斜面，種子，發(fā)酵培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件同實施例5，菌種采用原始菌CGMCC 7677，進行五組平行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)HPLC測定，測得米爾貝霉素A4的平均含量為729mg/L，A3的平均含量為297mg/L，米爾貝霉素A4的含量占A3和A4總含量的百分比為71％。

(2)斜面，種子，發(fā)酵培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件同實施例5，菌種采用本發(fā)明鏈霉菌HS7522，進行五組平行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液經(jīng)HPLC測定，測得米爾貝霉素A4的平均含量為4016mg/L，A3的平均含量為942mg/L，米爾貝霉素A4的含量占A3和A4總含量的百分比為81％。